基因组dna的提取课件

1 分离纯化基因组DNA 【目的】 了解基因组DNA提取的原理与基本方法。 掌握硅胶膜吸附法提取DNA的方法 。 2 核酸是遗传信息的载 体，是最重要的生物信息 分子，是分子生物学研究 的主要对象。核酸样品的 质量直接关系到实验的成 败。 【原理】 3 DNA提取原则1：DNA片段长度（完整性） DNA提取原则2：排除其它分子污染（纯度） 4 破碎细胞 提 取 纯 化 5 破碎细胞 提 取 纯 化 机 械 法 化 学 法 酶 法 6 破碎细胞 提 取 纯 化 沉淀法：异丙醇、无水乙醇 介质吸附： 硅基质:高盐低pH值 结合核酸 低盐高pH值 洗脱 阴离子交换树脂 磁珠 7 破碎细胞 提 取 纯 化 沉淀法：晾干异丙醇或乙醇；适 量buffer溶解 介质吸附： 硅基质:洗杂，空甩 2 min, 晾干； 低盐高pH值 洗脱 8 9 【试剂与器材】 1.小白鼠（3人一组，每2组一只） 2.微量加样器 3.匀浆器 4.动物组织基因组DNA 提取试剂盒 5.生理盐水 10 小白鼠肝 脱颈处死 脱颈处死 右手抓住鼠尾用力向后拉 ,同时左手拇指与食指用力向 下按住鼠头。将脊髓与脑髓拉 断，鼠便立即死亡。 【操作流程】 11 匀浆器匀浆 采用相应的蛋白变性剂和 蛋白酶K进行处理，消化 蛋白 【操作流程】 沉淀核酸 消化去蛋白 12 【操作流程I 】 肝+ 2 mL 生理盐水 700L匀浆液 离心12000 rpm, 1 min,弃尽上清 破碎细胞 加 GA 200 L 振荡至彻底悬浮 加 蛋白酶K 20 L 56, 60 min,裂解 组织，消化蛋白 短暂离心（5秒） 加 GB 200 L 充分混匀， 70, 10 min 短暂离心（5秒） 标记！ 上交，-20保存 硅胶膜吸附法 消化蛋白 13 14 【操作流程II】 加 乙醇 200 L 混匀至少15s 短暂离心 硅胶膜吸附法 沉淀核酸 裂解的样本 加入吸附柱 缓冲液冲洗 DNA洗脱收集 注意：动作要轻柔 15 【操作流程II】 硅胶膜吸附法 沉淀核酸 裂解的样本 加入吸附柱 缓冲液冲洗 DNA洗脱收集 核酸吸附 将上一步所得溶液和絮状沉淀都 加入一个吸附柱CB3中； 吸附柱放入收集管中 ； 12,000rpm离心30s； 倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集 管中 注意：未完全消化 的组织块不要加入 吸附柱中！ 16 【操作流程II】 硅胶膜吸附法 沉淀核酸 裂解的样本 加入吸附柱 缓冲液冲洗 DNA洗脱收集 核酸吸附 漂洗去杂 漂洗液漂洗去蛋白片段，盐分和 其它杂质 向吸附柱中加入500L GD， 12,000rpm离心30s，弃废液，将吸 附柱放回收集管中； 向吸附柱中加入700 LPW， 12,000rpm离心30s，弃废液，将吸 附柱放回收集管中； 向吸附柱中加入500 LPW， 12,000rpm离心30s，弃废液，将吸 附柱放回收集管中； 17 【操作流程II】 硅胶膜吸附法 沉淀核酸 裂解的样本 加入吸附柱 缓冲液冲洗 DNA洗脱收集 核酸吸附 漂洗去杂 洗脱DNA 洗脱前要充分空甩，以除去乙醇的 影响； 采用合适的缓冲液 注意: 将吸附柱放回收集管中，12,000rpm ，离心2min，倒掉废液: 将吸附柱开盖放置5min，以彻底晾 干吸附材料中残余的漂洗液; 将吸附柱转入干净的离心管中，向吸 附膜的中间部位悬空滴加100uL洗脱 缓冲液TE，室温放置5min； 12,0OOrpm离心2min，将DNA溶液收集 到离心管中 洗脱缓冲液体积不应少于50L，体 积过小影响回收效率； 为增加基因组DNA的得率，可将离 心得到的溶液再加入吸附柱CB3中， 室温放置2min，12,000rpm离心 2min； 洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大 影响，应在7.0-8.5范围内； DNA产物应保存在20。 18 【操作流程】 (总结) 溶液和絮状 沉淀转入 加 PW 700 L 加 GD 500 L 12,000rpm,离心 30s ，弃废液 加 PW 500 L 充分混匀 短暂离心 勿加入组 织块！ 检测样品浓度和纯度， 余下样品，-20保存 加 乙醇 200 L 12,000rpm,离心 30s ，弃废液 12,000rpm,离心 30s ，弃废液 12,000rpm,离心 30s ，弃废液 12,000rpm,离心 2min，去乙醇 晾干5min 加 TE 100 L 加在膜中 心！ 吸附柱套入新 离心管，室温 放置5min 12,000rpm,离心 2min，收集滤液 可重复洗脱可重复洗脱 动作 轻柔 19 纯度（OD260/OD280） 紫外分光光度计进行测量（选择正确的稀释倍数） OD260/OD280 1.9 说明有部分降解或有RNA污染 得率 紫外分光光度计进行测量 Yield OD26050ng/L稀释倍数（双链DNA） DNA检测方法紫外分光光度法 20 DNA检测方法电泳检测 取5L洗脱液1% 琼脂糖凝胶电泳, 检 测DNA分子大小，纯度以及完整性 电泳检测要控制上样量。上样量过大会导致泳道过亮、拖尾等现象， 影响正确判断。 如果加样孔里有亮带，说明有蛋白污染。 若上样量合适，泳道有弥散、拖尾现象，说明基因组DNA有降解。 21 浓度：100300ng/uL 纯度：任何杂质都可能导致DNA在储存过程中的降解， 因此要确保纯化得到的核酸的纯度。 温度：纯化得到基因组DNA之后需将