子宫内膜腺癌组织中的RKIP、+NF-КB和CASPASE-3的表达的研究.pdfVIP

广州医学院 硕士学位论文 子宫内膜腺癌组织中的rkip、 nf-b和caspase-3的表达的研 究 姓名：张昭 申请学位级别：硕士 专业：妇产科学 指导教师：周龙书 2011-05 广州医学院硕士学位论文 1 子宫内膜癌组织中的子宫内膜癌组织中的 rkip、 nf-b 和和 caspase-3 的表达的研究的表达的研究 广州医学院第二附属医院 研究生： 张昭 导 师： 周龙书 教授 中文摘要中文摘要 目的目的： 研究 raf-激酶抑制蛋白 （raf kinase inhibitor protein； rkip） 、 核因子 b(nuclear factor- gene binding；nf-b)和天冬氨酸特异性半胱氨酸酶-3（cysteine aspartate-specific protease-3；caspase-3）在子宫内膜癌组织中的表达及其生物学 意义，并探讨三者之间的相互关系。 方法：方法： 按随机对照法，收集子宫内膜癌的标本 54 例作为研究组，子宫内膜增生症 （单纯性增生和复杂性增生） 标本 20 例以及正常增殖期子宫内膜标本 20 例作为 对照组。所有病例均经病理确诊。采用免疫组化法检测子宫内膜癌、子宫内膜增 生症及正常子宫内膜组织中 rkip、nf-b 和 caspase-3 的表达情况。分析三者 的表达情况与不同临床病理学指标的相关关系、以及三者之间的相互关系。应用 spss13.0 软件进行统计学数据分析。 结果：结果： 1.rkip、 nf-b 和 caspase-3 在子宫内膜癌组中的阳性表达率分别为 46.3%、 63.0%、 55.6%； 在子宫内膜增生症组中的阳性表达率分别为 65.0%、 30.0%、 70%; 在正常子宫内膜组织中的阳性表达率分别为 100%、5.0%、100%。三者在三种组 织中的阳性表达率之间比较差异均有统计学意义（p0.05） 。 2.子宫内膜癌组织中 rkip 的表达与子宫内膜癌各临床病理学特征的关系： rkip 在不同手术-病理分期、不同肌层浸润深度、有或无淋巴结转移的病例中表 达率之间比较差异均有统计学意义（p0.05） 。在不同病理分级病例中其阳性表 达率之间比较差异有统计学意义（p0.05）,其中 g1 与 g2 比较差异无统计学意 广州医学院硕士学位论文 2 义（p0.05） ，g1 与 g3 比较差异有统计学意义（p0.05） ，g2 与 g3 比较差异 有统计学意义（p0.05） 。 3.子宫内膜癌组织中 nf-b 蛋白的表达与子宫内膜癌各临床病理学特征的 关系：nf-b 在不同手术-病理分期、不同肌层浸润深度、有或无淋巴结转移的 病例中表达率之间比较差异均有统计学意义（p0.05） 。在不同病理分级病例中 其阳性表达率之间比较差异有统计学意义（p0.05）,其中 g1 与 g2 比较差异有 统计学意义（p0.05） ，g1 与 g3 比较差异有统计学意义（p0.05） ，g2 与 g3 比较差异无统计学意义（p0.05） 。 4.子宫内膜癌组织中 caspase-3 蛋白的表达与子宫内膜癌各临床病理学特征 的关系：caspase-3 在不同病理分级病例中其阳性表达率之间比较差异有统计学 意义（p0.05）,其中 g1 与 g2 比较差异无统计学意义（p0.05） ，g1 与 g3 比 较差异有统计学意义（p0.05） ，g2 与 g3 比较差异有统计学意义（p0.05） 。 而其与发病年龄、手术-病理分期、肌层浸润、淋巴结转移均无关（p0.05） 。 5.子宫内膜癌组织中 rkip、nf-b 和 caspase-3 表达的相关性：rkip 与 nf-b 的表达呈负相关（r =-0.288，p0.05） ；rkip 与 caspase-3 的表达呈正相 关（r =0.307，p0.05） ；caspase-3 与 nf-b 的表达呈负相关（r =-0.454，p 0.05） 。 结论：结论： 1.rkip的表达缺失可能与子宫内膜癌的发生发展及侵袭、转移、预后有关。 2.nf-b的过表达可能与子宫内膜癌的发生发展及侵袭、转移、预后有关。 3.caspase-3可能参与子宫内膜癌细胞的去分化过程， 而与子宫内膜癌的浸润 进展无相关性。 4.在子宫内膜癌中， rkip表达下降导致nf-b及其下游信号通路的活化使得 肿瘤细胞得以抵抗凋亡，进而促进肿瘤的发生发展。 关键词关键词 子宫内膜癌；raf-激酶抑制蛋白；核因子 b；天冬氨酸特异性半胱氨酸 酶-3 子宫内膜癌组织中的 rkip、nf-kb 和 caspase-3 的表达的研究 3 the study on the expression of rkip, nf-b and caspase-3 in endometrial cancer the second affiliated hospital of guangzhou medical college postgraduate:zhang zhao tutor :zhou long-shu abstract objects to study the expression and biological significance of raf kinase inhibitor protein(rkip), nuclear factor- gene binding(nf-b) and cysteine aspartate-specific protease-3(caspase-3) in endometrial carcinoma tissue, and to explore the threes correlations. methods by the means of randomized contrast, collected 54 cases of endometrial carcinoma specimens as researching group, together with 20 cases of endometrial hyperplasia specimens(simple hyperplasia and complex hyperplasia) and 20 cases of normal proliferative phase of endometrial specimens as contrast group.all cases were confirmed by pathology. used immunohistochemical methods to detect the expression of rkip, nf-b and caspase-3 in endometrial carcinoma, endometrial hyperplasia and normal endometrial tissue. analyzed the relationship between the threes expression and different characteristics of clinical pathology, as well as the threes correlations. spss17.0 was applied for statistical data analysis. results 1. the positive expression rates of rkip, nf-b and caspase-3 in the endometrial carcinoma group were 46.3%,63.0%, 55.6% respectively; positive expression rates 65.0%,30.0%,70.0% separately in endometrial hyperplasia; and 100.0%,5.0%,100.0% respectively in normal endometrial tissue. among the three organizations, the positive expression rate of the three was statistically significant 广州医学院硕士学位论文 4 differences ( p0.05). 2.the relationship between rkip expression in endometrial cancer and different characteristics of clinical pathology of endometrial cancer: the difference of the positive rates of rkip were all statistically significant(p0.05) in different surgery-pathologic stages,different depths of myometrial invasion and with or without lymph node metastasis.the difference of positive expression rates was statistically significant(p0.05) in different pathological grades cases, among which g1 and g2 was no significant difference (p 0.05), g1 and g3 was statistically significant difference (p 0.05). 4. the relationship between caspase-3 expression in endometrial cancer and different characteristics of clinical pathology of endometrial cancer: the difference of positive expression rates of caspase-3 was statistically significant(p0.05) in different pathological grades cases, among which g1 and g2 was no significant difference (p 0.05), g1 and g3 was statistically significant difference (p 0.05). but it showed no correlations with age of onset, surgical - pathologic stage, myometrial invasion and lymph node metastasis(p 0.05). 5. the correlation of rkip, nf-b and caspase-3s expression in endometrial carcinoma: expression of rkip and nf-b was negatively correlated (r =-0.288，p 0.05);rkip and caspase-3 was positively correlated （r =0.307， p0.05） ; caspase-3 and nf-b was negatively correlated (r =-0.454，p0.05) . 子宫内膜癌组织中的 rkip、nf-kb 和 caspase-3 的表达的研究 5 conclusions 1. the loss of expression of rkip might be related with endometrial adenocarcinomas development,invasion, metastasis and prognosis. 2. overexpression of nf-b might be related with endometrial adenocarcinomas development,invasion, metastasis and prognosis. 3caspase-3 might participate in the dedifferentiation process of endometrial carcinoma cells, but was unrelated with the infiltrating progress of endometrial carcinoma. 4rkip being suppressed caused activation of nf-b and its downstream signaling pathway, in which might tumor cells be able to resist apoptosis, and thus promoting the tumor growth. 广州医学院硕士学位论文 2 缩略词表缩略词表 rkip raf kinase inhibitor protein raf-激酶抑制蛋白 nf-b nuclear factor- gene binding 核因子b caspase-3 cysteine aspartate-specific protease-3 天冬氨酸特异性半胱氨酸酶 -3 figo the international federation of gynecology and obstetrics 国际妇产科协会 ec endometrial carcinoma 子宫内膜癌 hrt hormone replacement therapy 激素替代治疗 mapk mitogen-activated protein kinases 有丝分裂原激活蛋白酶 jnk cjun nterminal kinase cjun 氨基末端激酶 ice interleukin-1 converting enzyme 白介素-1转化酶 tnf tumor necrosis factor 肿瘤坏死因子 ikk ib kinase ib 激酶复合体 gpcr g-protein-coupled recepters g 蛋白偶联受体 grk-2 g-protein-coupled receptor kinase-2 g 蛋白偶联受体激酶-2 erk fasting blood glucose 细胞外信号调节激酶 广州医学院硕士学位论文 44 学位论文原创性声明学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。文中依法引用他人的成果、对本文的 研究作出重要贡献的个人和集体， 均已在文中做出明确标注或得到许 可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的任何形式的研究成果， 也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。 本人如违反上述声明，愿意承担以下责任和后果： 1交回学校授予的学位证书； 2学校可在相关媒体上对作者本人的行为进行通报； 3本人按照学校规定的方式，对因不当取得学位给学校造成的名 誉损害，进行公开道歉。 4本人负责因论文成果不实产生的法律纠纷。 论文作者签名： 日期： 年 月 日 子宫内膜癌组织中的 rkip、nf-kb 和 caspase-3 的表达的研究 45 学位论文知识产权权属声明学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品， 知识产权归 属广州医学院及附属单位。 广州医学院及附属单位享有以任何方式发 表、复制、公开阅览、借阅以及申请专利等权利。本人离校后发表或 使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时， 署名单位仍 然为广州医学院及附属单位。 任何其他收存和保管本论文的单位和个 人，未经本论文作者、导师授权，不得将本论文转借他人、复制、抄 录或以其他任何方式传播，否则，引起有碍作者的著作权益问题，将 会追究相应的法律责任。 论文作者签名： 日期： 年 月 日 导师签名： 日期： 年 月 日 广州医学院硕士学位论文 6 前前 言言 子宫内膜癌（endometrial carcinoma，ec）是发生于子宫内膜的一组上皮性 恶性肿瘤，以来源于子宫内膜腺体的腺癌最常见。为女性生殖道三大恶性肿瘤之 一，占女性全身恶性肿瘤的7%，占女性生殖道恶性肿瘤的20%-30%1。近年来随 着生活水平的提高，激素替代治疗（hormone replacement therapy，hrt）的发展， 其发病率有明显上升并年轻化趋势，与宫颈癌比较，已趋接近甚至超过，而5年 生存率却逐年下降2。全球每年约有14.2万妇女患子宫内膜癌，4.2万人死于该疾 病3。在美国，子宫内膜癌是最常见的妇科恶性肿瘤，据统计其2010年的新发病 例有43,470例，死亡病例达7,950例4。由于其病因、发病机制仍不清楚，且该病 具有发病率高、晚期治愈率低的特点，严重危害着女性的健康，因此子宫内膜癌 的病因及发病机制研究成为近年妇科肿瘤的研究热点。 有关肿瘤的研究普遍认为，正常细胞程序性死亡（凋亡）的机制遭破坏，可 导致肿瘤细胞的产生和发展。细胞内存在调节细胞增生和凋亡的原癌基因、抑癌 基因和凋亡调节基因，它们之间相互作用协调调节细胞的增生与凋亡。癌基因激 活和抑癌基因失活引起的细胞周期调节失控是肿瘤发生发展的重要原因。因此， 以选择性地诱导肿瘤细胞凋亡为目标的理论和技术已经成为治疗恶性肿瘤的主 要方向。 近年来的研究发现， 细胞凋亡是各种抗癌药物引起细胞死亡的主要方式， 从而使得细胞凋亡与肿瘤之间的关系及细胞凋亡在癌症治疗中的作用成为抗肿 瘤研究的新焦点。rkip的功能下降可能影响肿瘤转移、血管发生、抗凋亡能力 以及染色体的完整性。nf-b信号转导通路可以促进肿瘤的发生，而nf-b蛋白 本身参与肿瘤的发生、增殖、抗凋亡、侵袭、血管生成和转移的过程。caspase-3 作为细胞凋亡的最重要的执行者，其活性受到抑制就会引起细胞凋亡障碍，可能 进一步引起肿瘤的发生和发展。rkip、nf-b和caspase-3在子宫内膜癌发生发 展过程中的作用及相互关系有待进一步研究和探讨。 rkip 是磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族中的一员，广泛存在于各种不同的物种 中，具有重要的生物学功能。rkip 在人体多种组织和不同类型细胞中都有表达， 并参与 raf-1/mek/erk 信号通路、 g 蛋白偶联受体信号通路和 nf-b 信号通路 的调控。 rkip 在细胞信号调控网络中的作用已受到人们的广泛瞩目。 rkip 的丢 子宫内膜癌组织中的 rkip、nf-kb 和 caspase-3 的表达的研究 7 失破坏了细胞稳态，导致肿瘤等疾病的发生。近年来研究表明在人类的许多恶性 肿瘤中如前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺导管癌、肺癌、肝癌等腺 癌中均存在 pkip 蛋白的低表达，且 rkip 在上述这些肿瘤中的低表达与患者的 预后不良相关。这表明 rkip 基因的功能下调可能在这些恶性肿瘤的发生发展中 起重要作用。其中 rkip 在前列腺癌中的研究最为广泛，研究表明 rkip 可以作 为前列腺癌转移的标志物， 其在前列腺癌中的表达已被公认为前列腺癌的独立预 后因素。因此，探讨 rkip 在子宫内膜癌发生发展过程中的作用有助于子宫内膜 癌的治疗及预后评估。目前国内尚未见关于 rkip 与子宫内膜癌相关性的详细报 导。 nf-b是一种几乎存在于所有细胞的转录因子，是rel家族成员，是由p50和 p65两个亚单位以不同形式组合形成的同源二聚体或异源二聚体。在体内发挥生 理功能的nf-b主要是p50-p60二聚体。nf-b体系广泛参与机体防御反应、 组织损伤和应激、细胞分化和凋亡以及肿瘤生长抑制过程的信号传递。在 静息的细胞中，nf-b和ib形成复合体，以无活性形式存在于胞浆中。当 细胞受细胞外信号刺激后，ib激酶复合体（ib kinase,ikk）活化将ib磷 酸化，使nf-b暴露核定位位点。游离的nf-b迅速移位到细胞核，与特异 性b序列结合，诱导相关基因转录。nf-b在肿瘤发生发展的多个环节都有 重大意义，特别是在决定肿瘤细胞是否会发生凋亡中的作用最为重要。越来越多 的证据证实nf-b是一种强大的肿瘤促进因子。 nf-b可以调控促凋亡和抗凋亡 基因(如bcl-xl和bcl-2)的表达，依靠刺激的不同和细胞类型的不同产生不同的生 物学结果。luiz等5的研究证实了nf-b在肿瘤的生长，细胞凋亡等方面发挥 着关键作用，nf-b所致的gadd45和联合表达下调是很多肿瘤细胞逃逸 凋亡机制的关键步骤。 这说明了nf-b是一种在肿瘤发生发展中发挥重要作 用的肿瘤因子。 但nf-b在子宫内膜癌中的确切分子生物学功能还需要进一 步深入研究。 肿瘤的发生发展是一个多基因、多步骤、多重调控的复杂过程，调控 肿瘤细胞周期，诱导肿瘤细胞凋亡是抑制恶性肿瘤发生发展的重要机制。 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（cysteine aspartate-specific protease， caspase）是与细胞凋亡有密切关系的一群家族性蛋白酶。迄今为止，已在 广州医学院硕士学位论文 8 哺乳动物中发现了14种caspase分子。而caspase-3是半胱氨酸天门冬氨酸蛋白 酶(caspase)家族中最重要的凋亡执行者之一，大多数促发细胞凋亡的因素，最 终均需通过caspase-3介导的信号传导途径导致细胞凋亡。由于caspase-3是细胞 凋亡调控中的关键蛋白酶，近年来caspase-3与肿瘤发生发展的关系及如何通 过caspase-3促进肿瘤细胞凋亡以达到治疗肿瘤的目的已成为国际研究热 点。因此，探讨caspase-3蛋白在子宫内膜癌发生发展过程中的作用有助于 子宫内膜癌的治疗。 yeung等7通过细胞试验证明了调节rkip的表达水平可以直接影响nf-b 信号传导通路的活性，另外其通过基因分析和激酶含量测定证实rkip介导调节 与nf-b信号通路活性相关的四种激酶（nf-b诱导激酶、tgf活化激酶-1、 ikk、ikk）从而实现抑制nf-b的活化。其后tang等8发现在癌细胞中同样 存在着rkip对nf-b的负性调节，并提出rkip对nf-b的抑制可能是通过一个 自动调节反馈回路实现的。 最近的研究发现9,10在癌症中， 肿瘤细胞中可能存在 rkip-nf-b-snail，snail反过来抑制rkip的转录和表达这一环形信号机制，而 肿瘤细胞的抵抗凋亡表型可能是通过snail-介导的rkip的抑制最终导致nf-b的 活化来维持的。另外，在对胃癌细胞株的体外培养实验中，李琦等11通过测定 nf-b和caspase-3的活性， 提示了nf-b的特异抑制剂可通过抑制nf-b活性从 而达到抑制胃癌细胞增殖和促进作为凋亡执行者的caspase-3蛋白的表达， 最终诱 导胃癌细胞凋亡。这些都提示着肿瘤细胞中可能存在rkip和nf-b的反馈调节 通路，调节caspase-3的活性从而影响肿瘤细胞的凋亡。 然而，关于凋亡执行者caspase-3与rkip和nf-b在子宫内膜癌中的表达 及其相关关系国内外尚未见报导。本研究采用免疫组化法检测rkip、nf-b 和caspase-3在正常增生期子宫内膜、子宫内膜增生症、子宫内膜癌中的表 达情况，并结合临床参数进行分析，以探讨它们与子宫内膜癌临床病理特 征及预后之间的关系，并分析子宫内膜癌中rkip与nf-b、 caspase-3之间的 相互关系，以进一步探讨它们在子宫内膜癌发生发展中的作用，以期对子 宫内膜癌的治疗及预后起一定的指导作用。 子宫内膜癌组织中的 rkip、nf-kb 和 caspase-3 的表达的研究 9 一、一、 材料和方法材料和方法 1.1 研究对象研究对象 收集广州医学院第二附属医院2007-2010年手术切除并经病理证实为子宫内 膜腺癌的标本 54 例，全部病例术前均未接受化疗、放疗或性激素治疗且肝肾功 能均正常。年龄范围在 36 72 岁，平均年龄 52.18.1 岁。54 例内膜样腺癌中， 组织学分级（世界卫生组织 who，2003） ：高分化（g1 级）28 例、中分化（g2 级） 16 例、 低分化 （g3 级） 10 例； 手术病理分期 （国际妇产科联盟 figo， 2009） ： 期 20 例、期 14 例、期 18 例、期 2 例；按肿瘤浸润情况分为：无肌层 浸润 6 例、浸润浅肌层（1/2）30 例、深肌层或浆膜浸润（1/2）18 例；按有 无淋巴结转移情况分为：无淋巴结转移 44 例、有淋巴结转移 10 例。另随机抽取 同期同年龄段的因其他妇科良性疾病而于广州医学院第二附属医院行手术切除 的子宫内膜标本为对照，术前同样未接受任何治疗且肝肾功能正常，包括正常子 宫内膜 20 例、子宫内膜增生症 20 例。 1.2 仪器、材料与实验试剂仪器、材料与实验试剂 1.2.1 主要实验仪器 （1）电热恒温水浴箱（上海顺丰仪器仪表有限公司） （2）电热恒温鼓风干燥箱（广州东方电热干燥设备厂） （3）微波炉（美的） （4）加样器 （5）电冰箱 （6）染色架 （7）染色缸 （8）切片刀 （9）石蜡切片机 （10）试剂瓶 （11）双目显微镜 （12）载玻片、盖玻片 （13）全自动显微照相系统 广州医学院硕士学位论文 10 1.2.2 化学试剂 （1）兔抗人 rkip 单克隆抗体-购于美国 eiptomic 公司 （2）兔抗人 caspase-3 单克隆抗体-购于美国 eiptomic 公司 （3）兔抗人 nf-b 多克隆抗体-购于美国 bioworld 公司 （4）即用型免疫组化 ultrasensitives-p 超敏试剂盒-购于福州迈新公司 （5）柠檬酸组织抗原修复液（ph=6.0）-购于福州迈新公司 （6）3，3-二氨基联苯胺（3，3-diaminobenzidine,dab）显色试剂盒-购于 福州迈新公司 （7）其他试剂：二甲苯，无水乙醇，0.1m 磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution,pbs）,苏木素复染剂，双蒸水，中性树胶，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，bsa） ，聚乙二醇辛基苯基醚（triton）等试剂均为国产。 1.3 试验方法试验方法 1.3.1 切片及烤片 取封存的组织石蜡块连续切片，切片厚度 4m。将切片用毛笔轻轻扶起，置 于温水中充分展开，再用处理过的玻片捞起，置电热干燥机上烤干，然后将玻片 置于电热恒温鼓风干燥箱中，以 60的恒温烘烤 1 小时，以便切片紧密粘附。 1.3.3 免疫组化染色程序 采用快捷免疫组化学染色法，具体步骤如下： （1） 将病理切片置于 60的恒温烤箱烘烤约 1 小时 15 分进行脱蜡，烤好的组 织切片依次置于二甲苯 （） 中浸泡 2min二甲苯 （） 中浸泡 2min95% 酒精 2min80%酒精 2min70%酒精 2min， 将组织内的石蜡置换出来， 再 用 pbs 冲洗 3min3 次。 （2）在微波炉中用中档加热柠檬酸组织抗原修复液至沸腾后，放入切片改成中 低档继续加热 15min，以阻断内源性过氧化物酶，修复抗原。 （3）冷却至室温后，pbs 浸泡 5min3 次。 （4）滴加 a 液（内源性过氧化酶阻断剂）置于湿盒中放置室温 30min。 （5）pbs 冲洗 5min3 次后，滴加 b 液（动物免疫血清）置于湿盒中放置室温 1 小时。 （6）pbs 冲洗 5min3 次后，加入用 bsa 稀释的一抗，分别为兔抗人 rkip（1： 子宫内膜癌组织中的 rkip、nf-kb 和 caspase-3 的表达的研究 11 500） 、兔抗人 caspase-3（1：100） 、兔抗人 nf-b（1：50）工作液，置于 湿盒中并放入 4冰箱过夜。 （7）隔日取出湿盒后室温放置小时。 （8）除去一抗工作液，pbs 浸泡 5min3 次，彻底洗净病理切片上残留的一抗 液体。 （9）滴入 c 液（生物素标记的二抗） ，置于湿盒中室温放置 1 小时。 （10）去除二抗工作液，pbs 浸泡 5min3 次，彻底洗净病理切片上多余的二抗 液体。 （11）滴加 d 液（链霉菌抗生素蛋白-过氧化酶） ，置于湿盒中室温放置 30min。 （12）用新鲜配置的 dab 溶液（850l 双蒸水+dab 显色试剂盒的 a、b、c 液各一滴）显色，显色时间为数秒1min，镜下观察显色情况，适时终止 显色。 （13）pbs 浸泡 5min3 次（终止显色并彻底洗净残留的显色液） 。 （14）苏木素复染细胞核（复染时间约为 30 秒1min） 。 （15）自来水冲洗返蓝。 （16）70%酸性酒精浸泡 1min（分色） ，梯度乙醇脱水（70%酒精 2min80%酒 精 2min90%酒精 2min100%酒精2min100%酒精2min） ，二甲苯 透明（二甲苯3min二甲苯3min二甲苯3min） ，中性树胶封片， 显微镜观察。 分别用 pbs 代替 3 种一抗为阴性对照，用已知阳性组织切片作阳性对照。 1.4 免疫组化结果判断免疫组化结果判断 rkip、nf-b 和 caspase-3 阳性染色均呈棕黄色颗粒或弥漫分布，rkip 定 位于胞浆和胞膜、caspase-3 定位于胞浆，nf-b 则定位于细胞核和胞浆。在高 倍镜（400）下对每张切片均随机观察 5 个视野。计数 200 个细胞/视野，共计 1000 个细胞。以阳性细胞数目的百分比结合染色强度进行半定量评分。阳性细 胞计分方法：无着色：0 分；1%25%为 1 分；26%50%为 2 分；51%75% 为 3 分；75%为 4 分。染色强度：不着色为 0 分；黄色为 1 分；棕黄色为 2 分； 棕褐色为 3 分。评分结果：01 分为阴性（） ；23 分为弱阳性（） ；46 分为中等阳性（） ；6 分为强阳性（） 。为表达缺失、低表达； 广州医学院硕士学位论文 12 为过表达；均为阳性。结果判断均由两名高年资病理医 生统一核准。 1.5 统计学分析统计学分析 实验资料的统计学处理通过 spss13.0 统计软件包进行统计学分析。计数资 料采用“行列表”的 检验、多组等级/频数表的非参数检验，rkip、nf-b 和 caspase-3 在子宫内膜癌组织中的相关性用 spearman 相关分析， 相关性用相关系 数 r 表示。p 值0.05 时认为组间差异有统计学意义。 子宫内膜癌组织中的 rkip、nf-kb 和 caspase-3 的表达的研究 13 二、结果二、结果 2.1 rkip 蛋白在子宫内膜癌、子宫内膜增生症和正常子宫内膜组织中的表达蛋白在子宫内膜癌、子宫内膜增生症和正常子宫内膜组织中的表达 rkip 蛋白免疫组织化学阳性染色定位于细胞浆或细胞膜。以抗体在细胞胞 浆或细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性，且以腺体细胞为主。在正常子宫内膜组织、 子宫内膜增生症和子宫内膜癌组织中的阳性表达率依次为 100%（20/20） 、65.0% （13/20） 、46.3%（25/54） 。三者比较差异有统计学意义（=17.739，p=0.000） 。 其中正常子宫内膜组织与子宫内膜增生症组织比较，差异有统计学意义 （p=0.004） ；正常子宫内膜组织与子宫内膜癌组织比较，差异有统计学意义 （p=0.000） ；子宫内膜增生症组织与子宫内膜癌组织比较，差异无统计学意义 （p=0.153） 。见表 1。病理染色图片见附录。 100.0% 65.0% 46.3% 0.0% 10.0% 20.0% 30.0% 40.0% 50.0% 60.0% 70.0% 80.0% 90.0% 100.0% 阳 性 率 正常组增生症组内膜癌组 表1：rkip在不同组织中的阳性表现率 正常组 增生症组 内膜癌组 2.2 子宫内膜癌中子宫内膜癌中 rkip 蛋白表达与临床病理特征的关系蛋白表达与临床病理特征的关系 1.rkip 蛋白表达与子宫内膜癌手术-病理分期、 病理分级的关系： 各期 rkip 蛋白的阳性表达率为：-期为 58.8%（20/34） ，-期为 25.0%（5/20） ，两 者比较差异有统计学意义（=5.794，p=0.016） 。不同病理分级子宫内膜癌组织 中 rkip 蛋白的阳性表达率为：g1 为 57.1%（16/28） ，g2 为 50.0%（8/16）,g3 为 10.0%（1/10） 。三者比较差异有统计学意义（=6.588，p=0.037） ，其中 g1 广州医学院硕士学位论文 14 与 g2 比较差异有统计学意义（=0.210，p=0.647） ，g1 与 g3 比较差异无统计 学意义（=6.624，p=0.010） ，g2 与 g3 比较差异无统计学意义（=4.350， p=0.037） 。 2.rkip 蛋白的表达与发病年龄、肌层浸润、淋巴转移的关系：本研究发现 rkip 蛋白的表达与发病年龄无关（=0.128，p=0.721） 。rkip 在无肌层浸润或 浸润1/2 肌层组和浸润1/2 肌层组中的表达差异有统计学意义(=6.294， p=0.012),以及其在内膜癌无淋巴结转移组和有淋巴结转移组中的表达差异也有 统计学意义（=6.503，p=0.011） 。见表 2。 表表 2：rkip 表达与子宫内膜癌临床病理学特征的关系表达与子宫内膜癌临床病理学特征的关系 表达情况表达情况 临床病理特征临床病理特征 总例数总例数 阳性率（阳性率（%） 值值 p 值值 年龄年龄 50 岁 23 13 10 43.5 50 岁 31 16 15 48.4 0.128 0.721 手术病理分期手术病理分期 - 34 14 20 58.8 - 20 15 5 25.0 5.794 0.016 病理分级病理分级 g1 28 12 16 57.1 g2 16 8 8 50.0 g3 10 9 1 10.0 6.588 0.037 肌层浸润肌层浸润 无及1/2 36 15 21 58.3 1/2 18 14 4 22.2 6.294 0.012 淋巴结转移淋巴结转移 无 44 20 24 54.5 有 10 9 1 10.0 6.503 0.011 子宫内膜癌组织中的 rkip、nf-kb 和 caspase-3 的表达的研究 15 2.3 nf-b 蛋白在子宫内膜癌、子宫增生症和正常子宫内膜组织中的表达蛋白在子宫内膜癌、子宫增生症和正常子宫内膜组织中的表达 nf-b 蛋白免疫组织化学阳性染色定位于细胞核和细胞质。以抗体在胞核 和胞浆中出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性，且以腺体细胞为主。在正常子宫内膜 组织、子宫内膜增生症和子宫内膜癌组织中的阳性表达率依次为 5%（1/20）、 30%(6/20)、63.0%(34/54)。三者比较差异有统计学意义（=21.621，p=0.000） 。 其中正常子宫内膜组织与子宫内膜增生症组织比较，差异有统计学意义 （=4.329，p=0.037） ；正常子宫内膜组织与子宫内膜癌组织比较，差异有统计 学意义（=19.671，p=0.000） ；子宫内膜增生症组织与子宫内膜癌组织比较，差 异有统计学意义（=6.385，p=0.012） 。见表 3。 5.0% 30.0% 63.0% 0.0% 10.0% 20.0% 30.0% 40.0% 50.0% 60.0% 70.0% 80.0% 90.0% 100.0% 阳 性 率 正常组增生症组内膜癌组 表3：nf-kb在不同组织中的阳性表现率 正常组 增生症组 内膜癌组 2.4 子宫内膜癌中子宫内膜癌中 nf-b 蛋白表达与临床病理特征的关系蛋白表达与临床病理特征的关系 1.nf-b 蛋白表达与子宫内膜癌手术-病理分期、病理分级的关系：各期 nf-b 蛋白的阳性表达率为： -期为 47.1% （16/34） ， -期为 90.0% （18/20） ， 两者比较差异有统计学意义（=9.957，p=0.002） 。不同病理分级子宫内膜癌组 织中 nf-b 蛋白的阳性表达率为： g1 为 35.7% （10/28） ， g2 为 87.5% （14/16） ,g3 为 100%（10/10） 。三者比较差异有统计学意义（=18.578，p=0.000） ，其中 g1 与 g2 比较差异有统计学意义（=11.013，p=0.001） ，g1 与 g3 比较差异有统计 学意义（=12.214，p=0.000） ，g2 与 g3 比较差异无统计学意义（=1.354， p=0.245） 。 广州医学院硕士学位论文 16 2.nf-b 蛋白的表达与发病年龄、肌层浸润、淋巴转移的关系：本研究发现 nf-b 蛋白的表达与发病年龄无关（=0.713，p=0.399） 。nf-b 在无肌层浸润 或浸润1/2 肌层组和浸润1/2 肌层组中的表达差异有统计学意义(=7.782， p=0.005),以及其在内膜癌无淋巴结转移组和有淋巴结转移组中的表达差异也有 统计学意义（=7.219，p=0.007） 。见表 4。 表表 4：nf-b 表达与子宫内膜癌临床病理学特征的关系表达与子宫内膜癌临床病理学特征的关系 表达情况表达情况 临床病理特征临床病理特征 总例数总例数 阳性率（阳性率（%）值值 p 值值 年龄年龄 50 岁 23 10 13 56.5 50 岁 31 10 21 67.7 0.713 0.399 手术病理分期手术病理分期 - 34 18 16 47.1 - 20 2 18 90.0 9.957 0.002 病理分级病理分级 g1 28 18 10 35.7 g2 16 2 14 87.5 g3 10 0 10 100.0 18.578 0.000 肌层浸润肌层浸润 无及1/2 36 18 18 50.0 1/2 18 2 16 88.9 7.782 0.005 淋巴结转移淋巴结转移 无 44 20 24 54.5 有 10 0 10 100.0 7.219 0.007 2.5 caspase-3 蛋白在子宫内膜癌、 子宫内膜增生症和正常子宫内膜组织中的表 达 蛋白在子宫内膜癌、 子宫内膜增生症和正常子宫内膜组织中的表 达 caspase-3 蛋白免疫组织化学阳性染色定位于细胞浆。以抗体在细胞胞浆出 子宫内膜癌组织中的 rkip、nf-kb 和 caspase-3 的表达的研究 17 现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性，且以腺体细胞为主。亦有极少数细胞核中有阳性 表达。在正常子宫内膜组织、子宫内膜增生症和子宫内膜癌组织中的阳性表达率 依次为 100%（20/20） 、70%（14/20） 、55.6%（30/54）。三者比较差异有统计学 意义 （=13.169， p=0.001） 。 其中正常子宫内膜组织与子宫内膜增生症组织比较， 差异有统计学意义（=7.059，p=0.008） ；正常子宫内膜组织与子宫内膜癌组织 比较，差异有统计学意义（=13.156，p=0.000） ；子宫内膜增生症组织与子宫内 膜癌组织比较，差异无统计学意义（=1.263，p=0.261） 。见表 5。 100.0% 70.0% 55.6% 0.0% 10.0% 20.0% 30.0% 40.0% 50.0% 60.0% 70.0% 80.0% 90.0% 100.0% 阳 性 率 正常组增生症组内膜癌组 表5:caspase-3在不同组织中的阳性表达率 正常组 增生症组 内膜癌组 2.6 子宫内膜癌中子宫内膜癌中 caspase-3 蛋白表达与临床病理特征的关系蛋白表达与临床病理特征的关系 1.caspase-3 蛋白表达与子宫内膜癌手术-病理分期、病理分级的关系：各期 caspase-3 蛋白的阳性表达率为：-期为 61.8%（21/34） ，-期为 45.0% （9/20） ，两者比较差异无统计学意义（=1.433，p=0.231） 。不同病理分级子宫 内膜癌组织中 caspase-3 蛋白的阳性表达率为： g1 为 75.0% （21/28） ， g2 为 43.8% （7/16）,g3 为 30.0%（3/10） 。三者比较差异有统计学意义（=6.773，p=0.034） ， 其中 g1 与 g2 比较差异有统计学意义（=3.604，p=0.058） ，g1 与 g3 比较差异 无统计学意义 （=5.652， p=0.017） ， g2 与 g3 比较差异无统计学意义 （=0.492， p=0.483） 。 2.caspase-3 蛋白的表达与发病年龄、肌层浸润、淋巴转移的关系：本研究发 广州医学院硕士学位论文 18 现 caspase-3 蛋白的表达与发病年龄无关（=1.515，p=0.218） ，与肌层浸润无关 （=1.350，p=0.245） ，与淋巴转移无关（=3.246，p=0.072） 。见表 6。 表表 6：caspase-3 表达与子宫内膜癌临床病理学特征的关系表达与子宫内膜癌临床病理学特征的关系 表达情况表达情况 临床病理特征临床病理特征 总例数总例数 阳性率（阳性率（%）值值 p 值值 年龄年龄 50 岁 23 8 15 65.2 50 岁 31 16 15 48.4 1.515 0.218 手术病理分期手术病理分期 - 34 13 21 61