原代细胞培养操作(鼠胎组织细胞培养为.ppt

原代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例）原代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例） 取材取材：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有 7575乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超 净台。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出净台。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出 子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠胎子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠胎 ，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污 切割切割：用平衡盐溶液将取出的组织块清洗三次，然后用眼科：用平衡盐溶液将取出的组织块清洗三次，然后用眼科 手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm1mm 3 3 左右的小块，再左右的小块，再 用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟，使用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟，使 组织块自然沉淀到管底，弃去上清组织块自然沉淀到管底，弃去上清 消化、接种培养消化、接种培养：加入：加入0.250.25胰蛋白酶消化液（胰蛋白酶消化液（5-105-10倍量）倍量） ，与组织块混匀。置，与组织块混匀。置3737水浴，观察消化情况（每隔几分钟水浴，观察消化情况（每隔几分钟 摇动一下试管），静止，吸去上清，加入摇动一下试管），静止，吸去上清，加入5 510ml10ml细胞培养细胞培养 液，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培液，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培 养箱中培养养箱中培养 细胞培养中应注意的几个问题 1）培养液和培养物的比例：一定浓度的培养液 仅能支持一定数量的细胞生长，不能盲目增加每单位 体积的细胞浓度。 2）PH：初培养pH应为7.4，培养过程应不低于7.0。 3）培养瓶内的空间：一般培养瓶内培养液与液面 上的空间体积之比为1:10。 4）容积、深度、表面面积：培养液体积与表面面 积的比例为0.2-0.5ml/cm2。需高浓度氧的，在浅的培 养液（2mm）中生长较好；需要低浓度氧的。在深的培 养液（5mm）中生长较好。 5）去除死细胞 6）温度控制：动物细胞培养对温度波动的敏感性很 大。温度低于36.5，细胞生长缓慢；温度高于37.5 ，细胞存活力降低。 细胞培养中应注意的几个问题 细胞传代方法 根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。 1悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新 培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去 除l2一23，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 2 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直 接吹 打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。 传代细胞培养操作传代细胞培养操作 将长成单层的细胞从二氧化碳培养箱中取出，在超净将长成单层的细胞从二氧化碳培养箱中取出，在超净 工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液( (以液以液 面盖住细胞为宜面盖住细胞为宜) )，静置，静置5 51010分钟分钟 在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变圆，相互在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变圆，相互 之间不再连接成片，这时应立即在超净台中将消化液之间不再连接成片，这时应立即在超净台中将消化液 倒掉，加入倒掉，加入3 35ml5ml新鲜培养液，吹打，制成细胞悬液新鲜培养液，吹打，制成细胞悬液 将细胞悬液吸出将细胞悬液吸出2ml2ml左右，加到另一个培养瓶中并向左右，加到另一个培养瓶中并向 每个瓶中分别加每个瓶中分别加3ml3ml左右培养液，盖好瓶塞，送回二左右培养液，盖好瓶塞，送回二 氧化碳培养箱中，继续进行培养氧化碳培养箱中，继续进行培养 细胞计数： 1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计 数板之间。 3、静置3分钟。 4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和 上方的。然后按下式计算： 细胞数/ml4大格细胞总数/ 410000 注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算 ，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。 2台盼蓝法 活细胞不被染色，死细胞染成蓝色； 用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力； 方法： 1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中； 2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟； 3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片； 4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力； 死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色 ，镜下呈无色透明状。 活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液 的加倍稀释作用。 MTT比色法操作步骤： （1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔 培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37、5 CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）； （2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；继续培养3 小时； （3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升孔）， 将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解； （4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570纳米）。记录结果 ，绘制细胞生长曲线。 慢冻程序 标准程序： 当温度在-25以上时， 12/min 当温度达-25以下时， 510/min 当温度达-100时，可迅速放入液氮中 简易程序： 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过 线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降12的速度 ，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。 细胞冻存方法 1预先配制冻存液：含20%血清培养基，10%DMSO， DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞 ； 2取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106细胞/ml)； 3加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和 冷冻日期。 细胞复苏方法 （1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738水浴中 ，使其融化（1分钟左右）； （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上； （3）低速离心10分钟； （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。 实验准备 实验用品： 超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器， 酸缸 CO2培养箱 倒置显微镜 酶标仪、微孔板震荡器 液氮罐 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 耗材：培养瓶，吸管，培养板， 冻存管 压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广 电热干燥箱：干热消毒（160 ，2小时）。主要用干玻璃 器皿消毒 滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清 、 酶液等均采用滤过法除菌 超净工作台：为细胞操作提供无菌环境 紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑料 培养皿和培养板等表面消毒 玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗 包括包括浸泡、刷洗、浸酸浸泡、刷洗、浸酸和和冲洗冲洗四个步骤四个步骤 清洗后的玻璃器皿清洗后的玻璃器皿 干净透明无油迹干净透明无油迹 不能残留任何物质不能残留任何物质 浸泡浸泡 初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使 附着物软化或被溶掉附着物软化或被溶掉 新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表 面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一 些对细胞有害的物质等些对细胞有害的物质等 先用自来水简单刷洗，然后用先用自来水简单刷洗，然后用5 5稀盐酸液浸泡过夜，稀盐酸液浸泡过夜， 以中和其中的碱性物质以中和其中的碱性物质 再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干 固后不易洗掉固后不易洗掉 用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或 浮在液面上浮在液面上 浸酸：浸酸： 玻璃器皿浸泡到清洁液中玻璃器皿浸泡到清洁液中 清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可 除掉刷洗不掉的微量杂质除掉刷洗不掉的微量杂质 浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清 洁液面洁液面 浸泡时间：一般为过夜，不应少于浸泡时间：一般为过夜，不应少于6 6 小时小时 配制洗液时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并配制洗液时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并 要保护好面部及身体裸露部分要保护好面部及身体裸露部分 配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫 酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配 制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色 冲洗冲洗 在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分 冲洗。使之尽量不留污染或清洁液的残迹冲洗。使之尽量不留污染或清洁液的残迹 最好用洗涤装置最好用洗涤装置 如用手工操作如用手工操作 需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净 ，最好用蒸馏水清洗，最好用蒸馏水清洗3-5 3-5 次，晾干备用次，晾干备用 胶塞的清洗胶塞的清洗 新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用 自来水冲洗，再做常规处理自来水冲洗，再做常规处理 常规清洗方法常规清洗方法 每次用后立即置入水中浸泡，用每次用后立即置入水中浸泡，用2% NaOH 2% NaOH 或洗衣粉或洗衣粉 煮沸煮沸10-20 10-20 分钟（以除掉培养中的蛋白质），自来分钟（以除掉培养中的蛋白质），自来 水冲洗，蒸馏水冲洗水冲洗，蒸馏水冲洗2-32-3次，晾干备用次，晾干备用 塑料制品的清洗塑料制品的清洗 塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的 包装，打开包装即可用，多为一次性物品包装，打开包装即可用，多为一次性物品 必要时用必要时用2% NaOH 2% NaOH 浸泡过夜，用自来水充分浸泡过夜，用自来水充分 冲洗，再用冲洗，再用5%5%盐酸溶液浸泡盐酸溶液浸泡30 30 分钟，最后用分钟，最后用 自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用 完全培养基的组成 基础培养基 80一95 血清 5一20 碳酸氢钠 2.0 g/L 青、链霉素 各100单位毫升 称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许D-Hanks D-Hanks 平衡盐平衡盐溶液调成糊状，再补足溶液调成糊状，再补足D-Hanks D-Hanks 平衡平衡 盐溶液，搅拌混匀，置室温盐溶液，搅拌混匀，置室温4 4 小时或冰箱过小时或冰箱过 夜，不断搅拌振荡夜，不断搅拌振荡 次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分 装入瓶中，装入瓶中， -20-20保存备用保存备用（以免分解失效（以免分解失效 ），），常用浓度为常用浓度为0.25% 0.25% （0.1%-0.5%0.1%-0.5%） 胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氢钠溶胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氢钠溶 液调液调pH pH 至至7.2 7.2 左右左右 胰蛋白酶溶液配制胰蛋白酶溶液配制 EDTAEDTA 2Na 2Na 溶液溶液 一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而 且毒性小，价格低廉，使用方便且毒性小，价格低廉，使用方便 常用工作液浓度为常用工作液浓度为0.02%0.02%。 注意：使用注意：使用EDTA EDTA 处理细胞后，要用平衡盐液冲洗处理细胞后，要用平衡盐液冲洗 干净，因残留的干净，因残留的EDTA EDTA 会影响细胞生长会影响细胞生长 EDTA EDTA 溶液配制：用溶液配制：用D-HanksD-Hanks 平衡盐溶液溶解后平衡盐溶液溶解后 ，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶，44冰箱保存冰箱保存 pH pH 调整液调整液 NaHCO3 NaHCO3 溶液溶液 常用浓度为常用浓度为7.5%7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高 压灭菌，分装，压灭菌，分装，44保存保存 HEPESHEPES（分子量（分子量238.31238.31）溶液）溶液 一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒 性 主要作用:防止