学年创新实验总结报告.ppt

2002学年创新实验总结报告 手性药物去甲肾上腺素对映体的高效 毛细管电泳-电化学分离检测 报告人：许迪明 指导教师:谢天尧 手性药物去甲肾上腺素对映体的毛细管电泳-电 化学分离检测 摘要： 本文报道了以未涂层融硅石英毛细管（ 50cm75m）为分离柱，5mmol/L NaOH + 8mmol/L Citric acid +8mmol/L b-CD 为电泳介 质，分离电压12.5KV，检测电压0.80V，建立的 去甲肾上腺素对映体高效毛细管电泳-方波安培 分离检测方法。对分离过程中使用的缓冲溶液种 类、浓度、pH、分离电压对拆分效果的影响进 行了讨论，并对拆分机理进行了探讨。 手性药物在医学领域中的作用越来越被人们重视。在 含有对映异构体的药物中，一种异构体是药物的有效 组分，而另一种则可能低效，无效乃至有毒，所以美 国食品与药物管理局出台了手性药物的管理法规，并 引起国际上对手性药物分离分析的重视（1）。手性化合 物分离检测的常用方法有高效液相色谱（HPLC），气 相色谱（GC），超临界流体（SFC）和毛细管电泳（ CE）。近年来，毛细管电泳手性分离技术引起了人们 的重视，并得到了快速发展。 目前，有关采用毛细管电泳分离手性药物报道中以光 学检测为多，电化学检测的应用很少。毛细管电泳 电化学检测，尤其是安培检测，可使用极细孔径的毛 细管而不会造成灵敏度的损失，具有灵敏度高、线性 范围宽、设备简单价廉、易于微机化和微型化，而被 认为是CE的极具潜力的检测方法。近年来随着制约其 应用的关键技术的突破，其应用潜能正在得到发挥， 与其它类型的检测器相比，具有自身的特点和优势， 已发展成为一种重要的分离分析方法，将在手性药物 拆分方面有较大的应用前景。 去甲肾上腺素(Noradrenaline)是一种急救药，具有很 强的血管收缩作用，使全身小动脉与小静脉都收缩(但 冠状血管扩张)，外周阻力增高，血压上升。临床上主 要利用它的升压作用，静滴用于各种休克(但出血性休 克禁用)，以提高血压，保证对重要器官(如脑)的血液 供应。 ，结构式见图1。去甲肾上腺素是手性分子， 含R型和S型。本文首次采用高效毛细管电泳方波安 培检测法，以5mmol/LNaOH+8mmol/L Citric acid+8mmol/L b-CD 为电泳介质，实现了去甲肾上腺 素对映体的分离检测，取得了满意的结果。 去甲肾上腺素分子结构图 图1 去甲肾上腺素的分子结构 Fig.1 Structure of Noradrenaline 1. 主要仪器和试剂 CES2000毛细管电泳仪（高压电源，安培检测器，毛 细管电泳数据工作站，中山大学化学与化工学院研制 ）；PHS-3C型酸度计（上海伟业仪器厂）；石英毛细 管（50cm75m i.d.,河北永年光导纤维厂）。CQ-2B 型超声波清洗器（明珠电器有限公司）。 去甲肾上腺素（上海禾丰制药公司产品）；b-CD（中 国医药集团上海化学试剂公司产品）；氢氧化钠（广 州化学试剂厂）；柠檬酸（Citric acid, 广州化学试剂 厂）；所用试剂均为分析纯，水为二次石英重蒸水。 2. 缓冲液和样品溶液 分别配制100 mmol/L 柠檬酸、氢氧化钠；25 mmol/L b-CD储备液。实验时，按要求量取适 量储备液制得不同浓度和不同pH的电泳运行缓 冲液。去甲肾上腺素对映体配成2mg/mL的储 备液，进样时用缓冲溶液稀释到所需浓度。 3. 实验方法 连接好毛细管电泳仪和检测装置，毛细管柱在使用 前依次用0.1mol/LNaOH ，蒸馏水和运行液各冲洗约 5min。检测电极用超声波进行冲洗。当更换运行液或 进样4次以后，也需按上述步骤清洗毛细管和电极。进 样方式采用重力进样，要求进样端与检测端的高度差 为20cm，进样时间为10s。方波安培检测器的输出信 号经数据工作站采集到微机中，进行实时数据处理、 图形显示和数据文件存储。实验在恒温（25 C），恒 湿（70%）的实验条件下进行。 3.1 b-CD浓度的影响 b-CD是手性选择剂，是 对映体分离的主要因素，它的浓度直接决定了 分离效果，不同浓度的b-CD对两个对映体分离 的分离效果不同。高浓度和低浓度的b-CD对手 性分离的机理也有变化。高浓度的b-CD由于非 特异性疏水作用和b-CD的二聚作用导致手性识 别能力。低浓度的b-CD与两对映体的作用互相 竞争。b-CD的浓度也影响了底液的性质，使毛 细管电泳的推动力电渗流产生变化，改变了对 映体的分离性。 1 b-CD浓度的影响 实验也证明了这一点 ，图2A是b -CD的时浓度为4mmol/L时的分离 效果图，可以看出两个对映体还没有明显分开 ；图2B是b -CD的时浓度为8mmol/L时的分离 效果图，此时的分离效果比较满意；图2C是 b -CD的时浓度为12mmol/L时的分离的效果图 ，此时的分离效果基本满意。当b -CD浓度大 于8mmol/L小于12mmol/L时，去甲肾上腺素对 映体分别得到完全分离。最佳b-CD浓度为 8mmol/L。 图2 不同浓度的b -CD分离效果 电泳条件：柠檬酸8 mmol/L，NaOH 5 mmol/L， 分离电压12.5KV，进样时间10S -CD浓度的影响 4mmol/L 8mmol/ L 12mmol/ L A B C 2 柠檬酸浓度及pH值的影响 在分离过程中，通过 选择pH值可以调整电迁移和电渗流的平衡，增加分离度。pH 值不仅可以影响毛细管中的电渗流来改变出峰时间来改善分 离效果，同时还会使手性对映体与-CD的相互作用变化， 改变分析物的迁移行为和分离选择性。缓冲液pH值得选择还 应兼顾迁移时间。在低pH情况下，电渗流很小，对于质子化 程度较低的手性药物来说分析时间较长，提高pH值分析时间 缩短3。所以在分辨率允许的范围内，常采用高的pH值。柠 檬酸体系在方波安培检测中有良好的背景。 2 柠檬酸浓度及pH值的影响 实验结 果表明：当柠 檬酸浓度在48mmol/L时，去甲肾上腺素对映体得不到分 离，如图3A所示，L型和R型在柠檬酸浓度为4mmol/L时得 不到较好的分离效果。柠檬酸浓度大于8mmol/L后，对映体 到达基线分离，但出峰时间较长 ，如图3B所示，在柠檬 酸浓度为8mmol/L时，去甲肾上腺素两对映体的分离效果 较好，且出峰时间大约在14分钟左右；如图3C所示柠檬 酸浓度为12mmol/L时，分离效果很好，只是出峰的时间在 15分钟左右。本实验选择柠檬酸浓度为8mmol/L。 柠 檬 酸 浓 度 的 影 响 图3 不同浓度的柠檬酸分离效果图 电泳条件：b -CD 8 mmol/L，NaOH 5 mmol/L， 分离电压12.5KV，进样时间10S 4mmol/L 8mmol/L 12mmol/L A B C 3.分离电压和检测电压的影响 电压在分离过 程中有一最佳值。样品的出峰时间对电压的响应很敏 感，高电压使溶液的电渗流值增加，从而加快了样品 出峰时间。但是加大分离电压会产生较多的焦耳热而 使温度升高，温度的升高又使溶液粘度变化，使毛细 管壁上的溶液和毛细管中央的溶液的迁移速度不通， 而造成峰形拖尾的现象。两对映体和b -CD的包合是一 个快速可逆的平衡过程，从热力学角度来讲，高温不 利于包合，降低了b -CD的分离效率。 3.分离电压和检测电压的影响 图4A是电压为 12.5KV时的分离效果，图4B是电压为10.5KV时的分 离效果。由图可知，随着分离电压的增加，对映体的 出峰时间迅速提前（由14.5min提前到13min),同时未 出现因热效应引起的区带展宽和分离效果变差。综合 考虑分离度和分析时间，本实验选择分离电压为 12.5KV。 分 离 电 压 的 影 响 图4 不同分离的电压分离效果图 电泳条件：b -CD 8mmol/L+ 柠檬酸 8mmol/L+NaOH 5mmol/L， 进样时间10S 12.5KV 10.5KV A B 4.旋光性测定 对于外消旋体，由于左、右旋体的 量相等结果其旋光度为零，在电泳图谱上表现为两个 面积几近相同的电泳峰。本实验中去甲肾上腺素针剂 样品的两个对映体的峰面积大小相差较大（见图5）， 表明其以非外消旋体形式存在，应具旋光性。 将甲肾上腺素加水稀释成1mL含2mg的溶液，在钠光谱 (539.3nm)，20条件下，测得的旋光度为-0.565。 表明出峰较早的电泳峰对应的是左旋()对映体，随 后的右旋体(+)。 图5 去甲肾上腺素针剂样品的CE图谱 电泳条件：b-CD 8 mmol/L+柠檬酸 8mmol/L+NaOH 5mmol/L，分 离电压12KV，进样时间15 S （） （） 旋 光 性 测 定 5 重现性测定 在优化实验条件下，分别将 20mg/L去甲肾上腺素各连续6次测定，峰面积 ，如表1所示。 表1 重现性测定 12 3456 （-）峰面积 279242791027887278032802327822 （+）峰面积 108310661046102511011041 （+）/（-）+（+） 右旋体含量百分比 （） 3.733.683.623.563.783.61 相对标准偏差(RSD) 2.2 b-CD是由7个D-吡喃型葡萄糖基通过-（14）糖苷 键连接而成的锥筒状分子，其2-，3-位仲羟基及6-位伯 羟基分别位于锥筒空腔的大小口，b-CD的空腔内表面 只有氢原子和带孤对电子的糖苷氧原子，所以b-CD腔 内疏水，腔外亲水的两性分子，因此可以与一些有机 化合物形成主-客体包和物，b-CD的结构见图6。 Dalgliesh认为b-CD分离对映体应该符合“三点原理”： 第一，被拆分的对映体必须有一部分进入b-CD的空腔 内；第二，被拆分的对映体必须带有能和b-CD上的羟 基形成作用力的羟基或氨基；第三，两对映体与b-CD 的包合作用力不同，即包和常数有差别。 图6. b-CD的分子结构 MW=1135 Fig.3 Chemical structure and schematic model of b-CD：MW=1135(molecular mass) -CD的分子结构 在拆分去甲肾上腺素对映体时，苯环进入b-CD 疏水腔，氨基上的氮原子与环糊精空腔外的羟 基发生作用。R型和S型的氮原子与b-CD上的 羟基形成不同的分子间作用力，使R型和S型对 映体与-CD形成的包合络合物在溶液中的淌度 不一样，而实现分离，如图7所示。 图7 b-CD 包合去甲肾上腺素示意图 1 苑可 戴立信 ，关注“手性药物”，科技术语研究，2002，4（