基于操作的基本程序.ppt

基因工程的基本操作程序 vv目的基因的获取目的基因的获取 vv基因表达载体的构建基因表达载体的构建 vv将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 操作过程操作过程 vv目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定 1.目的基因主要是指_编码蛋白质的基因，也可也可 以是一些具有调控作用的因以是一些具有调控作用的因 子。子。 （一）目的基因的获取（一）目的基因的获取 供体生物细胞 取出DNA 用限制酶剪 去多余部分 目的基因 即：将需要的基因从供体生物细胞内提取出来 目前被广泛提取使 用的目的基因有：苏 云金杆菌抗虫基因、 植物抗病基因（抗病（抗病 毒、抗细菌毒、抗细菌) )、人胰岛 素基因等。 基因文库 怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？ 种类： 基因组文库： 部分基因文库 (cDNA文库)： 2. 2.获得目的基因的方法获得目的基因的方法 2） 2）利用PCR技术扩增目的基因 3）利用化学方法人工合成 含有一种生物的全部基因 含有一种生物的部分基因 n根据基因的有关信息：如根据基因的核苷酸序列、基因 的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA 、 基因表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。 1 1）从基因文库中获取目的基因）从基因文库中获取目的基因 核心(二)基因表达载体的构建 质粒DNA分子 一个切口 两个黏性末端 两个切口 获得目的基因 DNA 连接酶 重组DNA分子（重组质粒） 限制性核酸内切酶 目的基因与运载体的结合过程，实际目的基因与运载体的结合过程，实际 上是不同来源的基因重组的过程。上是不同来源的基因重组的过程。 质粒 目的基因 限制酶 DNA连接酶 重组DNA 科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的 过程和不懈的努力，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体 质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基 因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗 虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株 还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫 基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入 棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。 资资 料料: : 基因表达载体的组成：基因表达载体的组成： 构建表达载体的目的：使目的基因在受体 细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代 ，同时使目的基因能够表达和发挥作用。 a.目的基因 b.启动子 c.终止子 d.标记基因 e.复制原点 n启动子：位于基因的首端的一段 特殊的DNA片段，它是RNA聚合 酶识别和结合的部位，有了它才能 驱动基因转录出mRNA，最终获得 蛋白质 RNA聚合酶 启动子 结构蛋白基因 终止子：位于基因的尾端的一段 特殊的DNA片段，能终止mRNA 的转录。 标记基因: 是为了鉴别受体细胞中 是否含有目的基因，从而将有目 的基因的细胞筛选出来 基因工程载体的构建需要考虑哪些因素 （1）基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有 内含子，就不能用于转基因植物，因为动物中内含 子的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因 的内含子剪切掉，只能用该基因的cDNA。基因的产 物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌 中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性 ，因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加 上的，而细菌无这些细胞器。 （2）要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子有 强有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因 产物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达 ，如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表 达的启动子。 （3）要有选择作用的标记基因，如抗生素抗性基因， 以便选择出真正的转基因生物。 (三)将目的基因导入受体细胞 受体细胞：受体细胞： 动物、植物、微生物等。动物、植物、微生物等。 将目的基因导入受体细胞的原理：将目的基因导入受体细胞的原理： 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。 转化目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程 受体细胞 稳定表达 方法 导入植物细胞 导入动物细胞 导入微生物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 显微注射法 感受态细胞吸收 DNA分子 (三)将目的基因导入受体细胞 (四)目的基因的检测与鉴定检查是否成功 分子 水平 检测 个体水 平鉴定 ： 检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因 检测目的基因是否转录出了mRNA 检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 方法 方法 方法 DNA-DNA分子杂交 DNA-RNA分子杂交 抗原-抗体杂交 PCRPCR技术技术聚合酶链式反应聚合酶链式反应 原理：原理： PCR扩增仪 DNA双链复制的基本原理 定义定义 ： PCR是一项在生物体外复制 特定DNA片段的核酸合成技 术 过程过程 ： 高温变性（ 9095） 低温退火（ 5560） 中温延伸 （7075 ） 多次 重复 加热至9095目的 基因DNA解链 冷却至5560，引 物结合到互补DNA链 加热至7075，热 稳定DNA聚合酶从引物起 始互补链的合成 四种脱氧核苷酸 (dNTP) 一对引物（一对寡核苷酸序列）： 热稳定DNA聚合酶(Taq酶） 模板DNA( 需含有目的基因 ) 条件：条件： 与目的基因的 起始段互补。 一段已知目的基因的核苷酸序列，以便 根据这一序列合成引物 前提：前提： p 双链DNA是在高温条件下解链为单链DNA的，因此整个 过程不需要解旋酶。 特点：指数形式扩增特点：指数形式扩增 利用PCR技术扩增目的基因 3 3）人工合成：通过）人工合成：通过DNADNA合成仪直接合成目合成仪直接合成目 的基因的基因 DNA合成仪 蛋白质的氨蛋白质的氨 基酸顺序基酸顺序 mRANmRAN 核苷酸序列核苷酸序列 基因基因DNADNA的的 核苷酸序列核苷酸序列 目的目的 基因基因 推 测 推 测 合 成 当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷 酸序列已知时，可采用此种方法。酸序列已知时，可采用此种方法。 农杆菌转化法 原理：农杆菌Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细 胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上 适用范围：双子叶植物和裸子植物 目的基因插入Ti质粒的T-DNA上 农杆菌导入 植物细胞 整合到受体细胞的染色体上 目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达 导入动物细胞: -显微注射技术 目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 将含目的基因的受精卵经胚胎早期培养 移植到输卵管或子宫中发育成具有新性状的动物 程序： 2.微生物作受体细胞原因： 3.转化方法： 大肠杆菌 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 处理细胞细胞 表达载体与感受态细胞混合 _细 胞吸收DNA分子。 Ca2+感受态 感受态 1.常用菌： 导入微生物细胞: 基因探针（DNA探针）与目的基因杂交，有无杂交带 检测程序 检测目的基因是否转录出了mRNA 提取受体生 物的mRNA 用同位素标记的 目的基因片段杂交 显 出 杂交带 （表明目的基因已转录出了mRNA） 检测DNA利用的是DNA与DNA杂交，检测mRNA 利用的是DNA与mRNA杂交。 检测目的基因是否翻译出蛋白质 抗原抗体杂交技术 提取受体生 物的蛋白质 与相应抗体杂交 显 出 杂交带 （表明目的基因已形成蛋白质产品 ） 例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说 明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中 毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。 各种大小的电泳仪 谱带 琼脂糖凝胶电泳是重组DNA研究中常用的技术，可 用于分离，鉴定和纯化DNA片段。不同大小、不同形状 和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下（如凝胶浓 度、电流、电压、缓冲液等），有不同的迁移率，所以 可通过电泳使其分离。凝胶中的DNA可与荧光染料溴化 乙锭（EB）结合，在紫外灯下可看到荧光条带，籍此 可分析实验结果。 1.下表关于基因工程中有关基因操作 的名词词及对应对应 的内容，正确的组组合是 2、下列属于获取目的基因的方法的是( ) 利用mRNA反转录形成从基因组文库中提取 从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成 A. B. C. D. 3.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗 性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B有利于对目的基因是否导入进行检测 C增加质粒分子的分子量 D便于与外源基因连接 4. 有关基因工程的叙述正确的是 A限制酶只在获得目的基因时才用 B重组质粒的形成是在细胞内完成的 C质粒都可作为运载体 D蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料 5. 5.哪项不是基因表达载体的组成部分哪项不是基因表达载体的组成部分( )( ) A. A.启动子启动子 B.B.终止密码终止密码 C.C.标记基因标记基因 D.D.目的基因目的基因 6. 6.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法( )( ) A A基因枪法基因枪法 B B显微注射法显微注射法 C.C.农杆菌转化法农杆菌转化法 D D花粉管通道法花粉管通道法 （1 1）从）从基因文库基因文库中获取目的基因中获取目的基因 什么叫基因文库？ 将含有某种生物不同基因的许多 DNA片段，导入到受体菌的群体受体菌的群体中储存， 各个受体菌分别含有这种生物的不同基因 ，称为基因文库。 基因文库 基因组文库 部分基因文库 （如：cDNA文库） 基因组 文库与 部分基 因文库 的关系 基因文库的构建基因文库的构建 A A、基因组文库的构建、基因组文库的构建 提取某生物 全部DNA 用适当 限制酶切割 许 多 DNA片段 与载体连接 导入受体菌群 该生物基 因组文库 （每个受体菌含有一 段不同的DNA片段） B B、cDNAcDNA文库的构建文库的构建mRNAmRNA反转录形成反转录形成 目的基因的 mRNA 逆转录酶 杂交双链 核酸酶H 使RNA降解 单链DNA DNA聚合酶 双链DNA (目的基因) 与载体连接 导入受体菌群 该生物 cDNA文库 n(包含了这种生 物的所有基因） 文库类库类 型cDNA 文库库基因组组文库库 文库库大小小大 基因中启动动子（具有启 动动作用的DNA片段） 无有 基因中内含子（位于编编 码码蛋白质质序列内的非 编码编码 DNA片段） 无有 基因多少某种生物的 部分基因 某种生物的全 部基因 物种间间的基因交流可以部分基因可以 基因组DNA文库的构建