《微生物限度检查法》PPT课件.ppt

微生物限度检查法 江苏省苏州药品检验所 细菌、 霉菌（酵母菌） 计数 n1简述（微生物限度检查的意义） n细菌、霉菌、酵母菌计数是检测规定企业 单位内的非灭菌制剂污染的活菌数量，是 判定药品受到微生物污染程度的重要指标 ，也是对生产企业的药品、原料、辅料、 设备器具、工艺流程、生产环境和操作者 的卫生状况进行卫生学评价的综合依据之 一。 细菌、霉菌、酵母菌计数均 采用平板菌落计数法，这是 活菌计数方法之一，也是目 前国际上许多国家常用的一 种方法。 n该方法以在琼脂平板上，每个细菌 （营养琼脂）、霉菌（玫瑰红钠琼 脂）、酵母菌（玫瑰红钠琼脂或酵 母浸出粉胨葡萄糖琼脂）形成一个 独立可见的菌落为计数依据。 n测定结果只反映在规定条件下所生 长的细菌（一群在营养琼脂上发育 的嗜中温、需氧和兼性厌氧菌）、 霉菌和酵母菌的菌落数。不包括对 营养、氧气、温度、PH和其他因 素有特殊要求的细菌、霉菌和酵母 菌。 n一个细菌、霉菌和酵母菌菌落均可由 一个或多个菌细胞形成。因此供试品 中所测的菌落数实际为菌落形成单位 数（colony forming unit ，CFU ），而不应理解为细菌、霉菌、酵母 菌的个数。 微生物检验项目：细菌总数测定、 霉菌与酵母菌总数测定、控制菌检验（ 包括大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、沙门 菌、金黄葡萄球菌、破伤风梭菌）以及 活螨的检验。 n2.1 设备 n2.1.1 无菌室 n2 设备、仪器及用具 n2.1.1.1结构和要求 无菌室应采光良 好、避免潮湿、远离厕所及污染区（ 面积不超过10m2，高度不超过2.4m ）由缓冲间（2个）、操作间组成。 n操作间与缓冲间之间应有样品传递 箱，出入操作间和缓冲间的门不应 直对。 n无菌室内应六面光滑平整，能耐受 清洗消毒。墙与地面及墙壁、天花 板连接处应呈凹弧形无缝隙，不留 死角。操作间内不应安装下水道。 n无菌室内的照明灯应嵌装在天花板内 ，室内光照应分布均匀，光照度不低 于300勒克斯。缓冲间和操作间均应 设置紫外线杀菌灯（.5W/m3 ），紫外杀菌灯应距实验台面高度不 超过1M，并应定期检查辐射强度， 不得低于70W.cm-2（M距离） 。不符合要求的紫外杀菌灯应及时更 换。 n2.1.1.2温度、湿度 无菌室内温度 和相对湿度直接影响紫外杀菌灯杀 菌效果，故温度应控制在18 26，相对湿度4060。操作 间或净化工作台的洁净空气应保持 对环境形成正压、不低于4.9Pa。 n2.1.1.3操作间 操作间应安装空气 除菌过滤层流装置。洁净度不应低 于是10000级，局部净化度为100 级，或放置同等级净化工作台，并 准备药物天平，乙醇灯，火柴，乙 醇棉，大、小橡皮乳头等。 n2.1.1.4缓冲间 缓冲间内应有洗手 盆，无菌衣、帽、口罩、拖鞋等。 缓冲间内不应放置培养箱和其他杂 物。 n2.1.1.5洁净 级 别 及 检 查方法 通 常采用尘 粒 数 及 浮 游 菌 数 或 沉 降 菌 数测 定 法。 洁净室（区）空气洁净度级别表 洁净洁净 度级级 别别 尘尘粒最大允许许数 /立方米 0.5m5m 百级级3，5000 万级级350，0002，000 十万级级3，500，00020，000 三十万级级10，500，00060，000 级别级别微生物最大允许许数 换换气次数 /小时时 浮游菌/立 方米 沉降菌 / 皿 百级级510.3米/秒 万级级100320 十万级级5001015 三十万级级15- n2.1.1.5.1 浮游菌数测试方法（参照 中人民共和国国家标准GB/T16293 -1996）。 n2.1.1.5.2 沉降菌数测定(法) n无菌室操作台消毒擦拭处理后，先启 动层流净化装置30min，将备妥的营 养琼脂平板3个(经3035预培养 48h，证明无菌落生长。)以无菌方式 （或经传递箱）移入操作间，置净化 台左、中、右各1个，开盖，暴露 30min后将盖盖上。 在3035培养箱内倒置培养48h， 取出检查。 3个平板生长的平均菌落 数不超过1个。 n无菌室操作台或净化工作台要定期 检测其洁净度，应达到100级。净 化工作台中的高效及中效过滤器应 根据检测情况，必要时予以更换处 理。 n2.1.1.6消毒处理 无菌室应在每次 操作前、后均用.1%苯扎溴铵溶 液或其他消毒液擦拭操作台及可能 污染的死角。开动层流净化装置， 同时用紫外杀菌灯照射30min。 n2.1.2其他设备、净化工作台、恒温 培养箱（3035）、生化培养箱 （2528），微波炉（或其他适 宜加热装置）、康氏振荡器、匀浆仪 （30008000r/min）、恒温水浴 、电热干燥箱（250300）、电 冰箱、空调、高压蒸汽灭菌器（使用 时要进行灭菌效果检查并应定期请有 关部门检定）。 n2.2 仪器及器皿 n2.2.1菌落计数器、显微镜（1500X ）、电子天平或药物天平（感量 0.1g），pH系列比色计。 n2.2.2 玻璃器皿 锥形瓶(250300ml ，内装玻璃珠若干)、研钵（陶瓷制 ，直径1012cm）、培养皿 (9cm)、量筒(100ml)、试管 (18180mm)及塞、吸管(1ml分度 0.01，10ml分度0.1)、注射器(20或 是30ml)、注射针头、载玻片、盖玻 片、玻璃消毒缸(带盖) 。 n玻璃器皿用前应洗涤干净，无残留 抗菌物质吸管口上端距0.5cm处塞 入约2cm的适宜疏松棉花，置吸管 桶内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒 、试管均应加棉塞或硅胶塞，再用 牛皮纸包扎。玻璃器皿，均于 160干热灭菌2h或高压蒸汽 121灭菌30min，烘干备用。 n2.3 用具 n2.3.1 大、小橡皮乳头（放于干净 带盖的容器中，并应定期用70% 75%乙醇溶液浸泡）。 n2.3.2 无菌衣、帽、口罩、手套（ 洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌 ，备用。也可用一次性无菌衣、帽 、口罩、手套。 n2.3.3 接种环 (白铱金或镍铬合金， 环径45mm、长度610cm)、 乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭 菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子、 灭菌钢锥、灭菌称样纸、不锈钢药 匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷 盘、洗手盆、陶瓦盖（12cm）、实 验记录纸等。 n3 试液 n3.1消毒液 n3.1.1 0.1%苯扎溴铵溶液（供洗手 、擦拭操作台面用）。 n3.1.2 5%石碳酸溶液 (配好后装入 玻璃消毒缸内， 供消毒带菌吸管用) 亦可选用其他适宜消毒液。 n3.1.3 75%乙醇溶液 n3.1.4 碘酊或碘伏溶液 n3.2 稀释剂和试剂 n3.2.1 0.9%无菌 n氯化钠溶液 (附录3.1) n3.2.2 无菌聚山梨酯-80 n3.2.3 无菌聚山梨酯-80氯化钠溶液 (附录3.2) n3.2.4 无菌磷酸盐缓冲液(pH7.2) ( 附录3.3) n3.2.5 无菌0.1%氯化三苯四氮唑溶 液(TTC) (附录2.15) n4 培养基 n4.1 营养琼脂培养基 (附录5.2) n4.2 玫瑰红钠琼脂培养基 (附录 5.3) n4.3 酵母浸出粉胨葡萄糖 (YPD) 琼脂培养基 (附录5.4) n培养基制备应注意： n4.3.1 采用干燥培养基，按说明配制 ，应对灭菌后的培养基pH值进行校 验。若为自配培养基，原料应挑选 ，琼脂凝固力应测定，以确定配制 时琼脂用量。试剂规格应为化学纯 以上的试剂。 n4.3.2 配制的培养基不应有沉淀，如 有沉淀，应于溶化后趁热过滤，灭菌 后使用。 n4.3.3 培养基的分装量不得超过容器 的确2/3，以免灭菌时溢出。包装时 ，塞子必须塞紧，以免松动或脱落造 成染菌。 n4.3.4 培养基配置后应在2h内灭菌， 避免细菌繁殖。 n4.3.5 灭菌后的培养基在冷暗处保存 备用，放置时间不能过长，以免水分 散失及染菌。已熔化的培养基应一次 用完，开启后不宜再用。 n4.3.6 勿用电炉直接熔化琼脂培养基 ，以免营养成份过度受热而破坏。应 用水浴或微波炉加热。 n5 供试品抽样、保存及检验量 n5.1 抽样 n5.1.1 一般采用随机抽样方法，抽 样量应为检验用量（2个以上最小包 装单位）的3倍量（以备复试）。 n5.1.2 抽样时，凡发现有异常或可疑 的样品，应选取有疑问的样品，但机 械损伤、明显破裂的包装不得作为样 品。 n5.1.3 凡能从药品、瓶口（外盖内侧 及瓶口周围）外观看出长螨、发霉 、虫蛀及变质的药品，可直接判为 不合格，无需再抽样检验。 n5.2 保存 n5.2.1 供试品在检验之前，应保存在 阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防 供试品内污染菌因保存条件不妥引 起致死，损伤或繁殖。 n5.2.2 供试品在检验之前，应保持原 包装状态，严禁开启。包装已开启的 样品不得作为供试品。 n5.3 检验量 n5.3.1 所有剂型的检验量均需取2个 以上包装单位（中药蜜丸、膜剂，需 取自4丸、4片以上）。 n5.3.2 固体及半固体(粘稠性供试品 )制剂检验量为10 g。 n5.3.3 液体制剂检验量为10 ml。 n5.3.4 膜剂除另有规定外，中药膜 剂检验量为3050cm2，化学药及 生化药膜剂检验量为10cm2。 n5.3.5 特殊贵重或微量包装的药品 ，检验量可酌减。除另有规定外， 口服固体制剂不低于3g。液体制剂 采用原液者不得少于6ml，采用供 试液者不得少3ml，外用药品不得 少5g。 n6 操作方法 n6.1 试验前准备 n6.1.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥 形瓶、匀浆杯、试管、吸管（1ml、10ml ）、量筒、稀释剂等移至无菌室内。每次 试验所用物品必须事先计划，准备足够用 量，避免操作中出入操作间。编号后将全 部外包装（牛皮纸）去掉。 n6.1.2 开启无菌室紫外杀菌灯和空 气过滤装置，并使其工作不低于 30min。 n6.1.3 操作人员用肥皂洗手，关闭 紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作 鞋。再用0.1%苯扎溴铵溶液或其 他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿 戴无菌衣、帽、口罩、手套。 n6.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手， 再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球 ）擦拭供试品瓶、盒、袋等的开 口处周围，待干后用灭菌的手术 镊或剪将供试品启封。 n6.2 供试液的制备 n6.2.1 液体供试品 取供试品10ml， 置灭菌锥形瓶中，加入90ml稀释剂 ，摇匀，作为1:10供试液。 n含王浆或蜂蜜的液体制剂和滴眼剂 直接用供试品作为供试液。 n6.2.2 固体、半固体或粘稠供试品 称取供试品10g，置于匀浆杯或适当 灭菌容器中，加入100ml 0.9%无菌 氯化钠溶液，用匀浆仪（3000 5000r/，24min），振荡器或乳钵 研磨等方法分散混匀。胃溶胶囊加 稀释剂后置451水浴中振摇，肠 溶胶囊加无菌磷酸盐缓冲液后先打 碎再置451水浴振摇溶解。 n6.2.3 非水溶性供试品 软膏剂、 乳膏剂 称供试品5g（5ml），加入 含已灭菌溶化并保温45左右的司 盘-80 5g、单硬脂酸甘油酯3g、聚 山梨酯-80 10g混合物的烧杯中， 用无菌玻棒搅拌均匀后，慢慢加入 45左右的0.9%无菌氯化钠溶液 85ml，边加边搅拌，使供试品充分 乳化，作为供试液（1：20）。 n油剂 取供试品10ml，加入无菌聚 山梨酯-80 58ml，摇匀，再加入 稀释剂至100ml。 n栓剂 称取供试品10g，置灭菌锥形 瓶中，加适量稀释剂，置45水浴 保温10min，使溶，加入无菌聚山 梨酯-80 58ml，振摇使之乳化， 再加稀释剂（稀释剂和聚山梨酯- 80总量为100ml），摇匀。 n6.2.4 气雾剂 将供试品置冰箱（4 ）h，取出，用碘伏棉球（也 可用乙醇棉球）擦拭供试品开启部 位周围，然后以无菌钢锥仔细钻孔 并插入容器中，勿移出钢锥，以转 动方式使容器内抛射剂全部抛出。 n以无菌注射器吸出全部药液，按标 示量补加稀释剂至足量（若含非水 溶性成份，加适量无菌聚山梨酯- 80液）此液即为供试品原液。 n6.2.5 膜剂 中药膜剂一般取30 50cm2， 将药膜剪成碎片，置灭菌 锥形瓶中， 加入稀释剂100ml， 于 451水浴保温，振摇使溶。 n西药药膜一般取样为10cm2，制备 供试液方法同上。 n6.2.6 茶剂 取供试品10g， 置灭菌 锥形瓶中，加入稀释剂100 ml，振 摇30s，以灭菌纱布过滤（如为袋 泡茶，可直接取2袋，以称样结果 按1：10加稀释剂，浸泡30min）。 n以上供试品如吸水膨胀，或粘度过 高，增加稀释剂，制成都是1：20 1：100供试液。 n6.3 供试液的稀释（10倍递增稀释法 ） n6.3.1 取23支灭菌试管，分别加入 9ml灭菌稀释剂（此时操作一般为： 左手执试管并将塞打开，倾斜，右手 执10ml吸管吸量，注意：勿在乙醇灯 焰峰正上方操作，以免灯焰将供试液 中菌细胞杀灭）。加完稀释剂后，试 管塞应立即塞上。 n6.3.2 另取1支1ml灭菌吸管吸1： 10均匀供试液1ml，加入装有9ml 灭菌稀释剂的试管中混匀，即为1 ：100供试液。以此类推，根据供 试品污染程度，可稀释至1：102、 1：103、1：104等适宜稀释级（至 少共3级）。每递增1稀释级，必须 另换一支吸管。 n在作10倍递增稀释时， 吸管插入第1 级稀释液内不低于液面2.5cm， 反复 吸吹约10次。吸液时，应先吸至高 于吸管上部刻度少许， 然后提起吸 管， 贴于试管内壁调整液量至刻度 ， 再沿第2级稀释管的内壁靠近液面 (勿接触液面)缓慢地吹出全部供试液 (吸管内应无粘附或残留液体)，然后 将吸管放入消毒液缸内。 n6.4 注平皿 在进行10倍递增稀释的同 时，以该稀释级吸管，吸取各级稀释 液各1ml至每个灭菌平皿中（从高稀 释级至低稀释级吸液时可用1支吸管 ），每一稀释级注23个平皿（此时 ，一般为左手执平皿，将盖半开，右 手执吸管），注平皿时，将1ml供试 液慢慢全部注入平皿中，管内无残留 液体，防止反流到吸管尖端部。 n同时作阴性对照（待各级稀释液注 皿完毕后，用1支1ml吸管吸取稀释 剂各1ml，分别注入4个平皿中。其 中2个作细菌阴性对照；另二个作霉 菌、酵母菌数阴性对照，如另用 YPD琼脂测定酵母菌数时，则再增 加2个平皿作酵母菌数阴性对照）。 n6.5 倾注培养基 将预先配制好的培 养基（细菌计数用营养琼脂，霉菌、 酵母菌计数一般用玫瑰红纳琼脂，含 蜂蜜、王浆液体制剂另加用YPD琼 脂）熔化，冷至45时，倾注上述 各个平皿15ml，以顺时针或反时针 方向快速旋转平皿混匀，注意，混匀 时切勿将培养基溅到皿边及皿盖上， 置操作台上待凝。 n6.6 培养 细菌计数平板倒置于30 35培养箱中培养48h。霉菌、酵母 菌计数平板于2528培养箱中培 养72h。 n6.7 菌落计数 n6.7.1 一般将平板置菌落计数器上或 从平板的背面直接以肉眼点计，以透 射光衬以暗色背景，仔细观察。勿漏 计细小的琼脂层内和平皿边缘生长的 菌落。注意细菌菌落与霉菌菌落和酵 母菌菌落以及它们与供试品颗粒、培 养基沉淀物、气泡等的鉴别。必要时 用放大镜或用低倍显微镜直接观察或 挑取可疑物涂片镜检。 n6.7.2 供试品如为微生物制剂，应 将有效微生物菌落排除，不可点计 在细菌、霉菌和酵母菌数内。排除 的方法需按该制剂微生物品种而定 ，并须观察菌落特征及染色形态。 n6.7.3 供试品稀释液常含有不溶性原 料、辅料，培养基注皿后可能产生沉 淀物，经过培养后有时形成数量很多 且难与菌落肉眼相鉴别的有形物。为 了有利于菌落计数，可在操作时将适 宜稀释级的供试液多增加注皿（12 个平皿），注皿后不经培养而放置于 冰箱（勿结冻）中，在计数菌落时作 为对照。 n或用0.001%TTC营养琼脂注皿，经 培养后可将细菌菌落与其他有形物区 别开来。 n有些软膏等非水溶性供试品，经营养 琼脂注皿后呈乳白色，培养后生长的 菌落不易辨认和点计，为防止这种情 况，也可用0.001%TTC营养琼脂注 皿，经培养后生长的菌落为红色，衬 于白色背景上易于点计。 n6.7.4 若平板上有2 个或2个以上菌 落重叠，肉眼可辨别时仍以2个或2 个以上菌落计数；若平板生长有链 状菌落，菌落间无明显界限，一条 链作为一个菌落计，但若链上出现 性状与链状菌落不同的可辨菌落时 ，仍应分别计数，若生长蔓延的较 大片状菌落或花斑样菌落，一般不 宜作为计数用。 n6.7.5 计录各稀释级平板的菌落数，求 出各稀释级2或3个平板菌落的平均数。 当菌落数在15以上的同稀释级二平板菌 落数相差1倍时，该稀释级菌落数不得 作为计数依据；当2个平板菌落数均在 15（含15）以下时，两个平板菌落数的 差值允许范围为04，17，2-9，3 10，412，514，615。超出以上 范围即视为操作误差，不得作为计数依 据。 n6.7.6 在下列情况下、点计菌落时间 需提前或延长培养时间： n6.7.6.1 菌落生长呈蔓延趋势者，细 菌点计需在24h，霉菌点计需在48h 作初步点计（点计霉菌菌落时，动作 宜轻，勿反复翻转平板或造成震动， 使早期形成的孢子散落在平板的其他 部位，又萌生新的霉菌菌落，导致计 数误差）。 n6.7.6.2 在48h点计细菌，72h点计 霉菌时，菌落极小不易辨认，需延 长培养时间47天，再点计菌落数 。 n6.7.6.3 对有疑议的供试品以YPD 培养基作酵母菌计数时，可培养至1 周再点计菌落数。 n6.7.7 供试品按营养琼脂平板点计 细菌菌落数；固体供试品按玫瑰红 钠琼脂平板点计霉菌数，一般液体 供试品按玫瑰红钠平板点计霉菌及 酵母菌总数；含蜂蜜及王浆的合剂 按玫瑰红钠琼脂平板点计霉菌菌落 数，按YPD琼脂平板点计酵菌落数 ，二者合并为霉菌及酵母菌数。 n6.8 菌落数报告规则: n6.8.1 细菌数选取平均菌落数在30 300之间的稀释级，霉菌、酵母菌数选 取平均菌落数在30100之间的稀释级 作为报告菌数的依据。 n如只有1个稀释级平均菌落数在此30 300（30100）之间，则将该稀释级 的菌落计数器乘以稀释倍数报告（见 附表例6.8.1）。 n6.8.2 如有2个相邻稀释级平均菌落 数在30300（30100）时，则按 比值计算。当比值2时，则以2个 稀释级的平均菌落数均值报告。当 比值2时，则以低稀释级的平均菌 落数乘以稀释倍数报告（见附表附 6.8.3）。 比值值= 高稀释级释级 平均菌落数稀释释倍数 低稀释级释级 平均菌落数稀释释倍数 n6.8.3 如有3个稀释级平均菌落数均 在30300 (30100)之间时，则以后 2个稀释级计算级间比值报告(同 6.8.2)，(见附表例6.8.3)。 n6.8.4 如各稀释级平均菌落数均在 300（100）以上，则按最高稀释级平 均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀 释级平均菌落数均在30以下，则按最 低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报 告（见附表6.8.4）。 n6.8.5 如各稀释级平均菌落数均不在 30300 (30100)之间，则以最接近 30或300（100）的稀释级平均菌落数 乘以稀释倍数报告（见附表6.8.5）。 n6.8.6 如各稀释级的平均菌落数均无 菌落生长或最低稀释级平均菌落数小 于1时，应报告菌落数为10个/g或 ml（见附表例6.8.6）。如供试品原液 平板均未生长霉菌及酵母菌，报告未 检出霉菌及酵母菌/ml。 n6.8.7 当各稀释级平均菌落数小于 30时，如高稀释级平均菌落大于或 等于低稀释级平均菌落数时，应以 培养基稀释法重新测定，按测定结 果报告菌落数（见附表例6.8.7）。 n培养基稀释法测定 n培养基稀释法： n取低稀释级供试液（原液或1：10 供试液）3份，每份各1ml，分别注 入5个或5个以上平皿中（每皿 0.2ml或0.2ml），每1个平皿倾 注营养琼脂培养基约15ml，混匀， 凝固后，倒置培养，计数。 n5个或5个以上平板点计的菌落之 和，即为每1ml菌落计数器，共得 3 组数据。以3份低稀释级供试液 菌落数的平均值乘以稀释倍数报告 。 n6.9 结果报告 n6.9.1 菌落数在100以内时， 按实 有数据报告。 n6.9.2 菌落数大于100时，取两位有 效数字报告，第三位按数字修约规 则处理。 n6.10 复试 供试品细菌数、霉菌及 酵母数其中任一项一次检验不合格 ，应重新取2倍包装量供试品，依 法作单项复试两份，以三次检验结 果的均值报告。 n7注意事项 n7.1 供试品检验全过程必须符合无 菌技术要求。使用灭菌作具时，不 能接触可能污染的任何器物，灭菌 吸管不得用口吹吸。 n7.2 从供试品稀释至倾注琼脂培养 基操作应在1h内完成，避免由于时 间过长导致菌细胞繁殖或死亡。 n7.3 供试液稀释及注皿时应取均匀的 供试液，以免造成实验误差。 n7.4 为避免细菌菌落蔓延生长，宜采 用下列方法处理： n7.4.1 开盖干燥 将已凝固的琼脂平板 开盖，倒置斜放于净化工作台上，开 机12h后合盖，放入培养箱培养； n7.4.2 换陶瓦盖 将已凝固的琼脂平 板盖换上新近干热灭菌的陶瓦盖。 n7.4.3 加TTC 于倾注培养基前，在 每1000ml营养琼脂内加入灭菌1% TTC溶液1ml（最终浓度为0.001%） ，混匀后倾注平皿。 n7.5 一般情况下，以营养琼脂平板计 数细菌数，玫瑰红钠琼脂平板计数霉 菌、酵母菌数。在特殊情况下，如营 养琼脂平板生长了霉菌、酵母菌，且 多于玫瑰红钠琼脂平板的霉菌和酵母 菌菌落数，则营养琼脂平板的霉菌、 酵母菌数报告；反之，如玫瑰红钠琼 脂平板生长了细菌，且多于营养琼脂 平板的细菌菌落数，则以玫瑰红钠琼 脂平板的细菌数报告。 n如营养琼脂平板生长的霉菌、酵母菌 数或玫瑰红钠琼脂平板生长的细菌菌 落数超过该品种微生物限度规定时， 经复试2次，如3次结果的平均值仍 超过规定，应判供试品不合格。 n8 检验报告书 n本品按中国药典2000年版微生物 限度检查法标准检验，结果符合 或不符合规定。 二、大肠杆菌检查法 n1简述 n大肠杆菌即大肠埃希菌（ Escherichia coli），为肠杆菌科埃 希菌属的模式种。埃希菌属除大肠 埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希 菌等四个种。 n大肠埃希菌是人和温血动物肠道内 的栖居菌，随粪便排出体外。 n在药品中检出大肠杆菌，表明该样 品受到人和温血动物的粪便污染， 即可能污染肠道病原体。大肠埃希 菌除普通大肠杆菌外尚有致病性大 肠杆菌，可引起婴幼儿、成人爆发 性腹泻。为保证人体健康，口服药 品必须检查大肠杆菌。 n 用4-甲基伞形酮葡糖苷酸（4- Methylumbelliferyl-D-glucuronide ，即MUG）和靛基质（Indole）试验检 查大肠杆菌是一项新技术，其检验步骤为 ：增菌培养后，转种MUG蛋白胨培养基 培养，多数情况下不需要从混合菌中分离 单个菌，如MUG、Indole试验为阳性或 阴性即可报告结果，如MUG与Indole试 验不一致时，则需分离培养、革兰染色、 镜检及生化试验鉴别。 n原理:利用目标菌限定酶作用的底 物的水解产物，产生颜色或荧光反 应作为指示系统来鉴定目标菌。 n实验证明96% 的大肠杆菌含-葡糖 苷酸酶（-glucuronidase，GUD） ，约10% 的沙门氏菌属一些菌种也 含有此酶。 nMUG被GUD水解，产生荧光，由于 荧光反应的敏感度较颜色反应强行 千万倍，易于观察，没有主观性， 因而用MUG鉴定大肠杆菌已被广泛 应用于临床、食品、饮水、污水等 的检测。 n 单一的MUG鉴别大肠杆菌其漏 检率达6%，鉴于98%的大肠杆菌 靛基质试验为阳性，故将MUG-靛 基质试验结合，用EMB琼脂平板 分离，辅以IMViC试验，在理论上 可使大肠杆菌的检出率达99%。 n三、沙门菌检查法 n1. 简述 n沙门氏菌属是肠杆菌科的重要致病菌 ，沙门菌分5个亚属，包括常见的伤 寒、甲型副伤寒、乙型副伤寒、丙型 副伤寒、鼠伤寒，猪霍乱等沙门菌在 内，迄今已发现2000多个菌型。 n药品中沙门菌，是以鉴定沙门菌属 为准，即对每g（或ml）药品中是 否检出沙门菌作出检验报告。 n由于沙门菌菌型繁多，各菌型的生 化及血清学特性虽密切相关，却不 尽相同，采用一种增菌增培养基和 两种分离培养基，不可能是所有沙 门菌的最适增菌及分离条件。 n此外，由于药品在生产过程中，常 受到加热、干燥等加工步骤的影响 ，药品中污染的沙门菌可受到损伤 或呈休眠状态，故须在增菌培养前 先进行预增。然后再进行增菌及分 离、三糖铁琼脂初步鉴别、生化试 验、血清学试验等步骤 。 四、铜绿假单胞菌检查法 n1简述 n铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），习称绿脓杆菌，为 假单胞菌属菌种，广泛分布在土壤 ，水及空气，人和动物的皮肤、肠 道、呼吸道均有存在，故可通过环 境和生产的各个环节污染药品。 n 本菌是常见的化脓性感染菌、在烧 伤、烫伤，眼科及其他外科疾患中 常引起继发感染，由于本菌对许多 抗菌药物具有天然的耐药性，增加 了治疗的难度、国内外药典均将铜 绿假单胞菌检查列为检查项目之一 。 n 铜绿假单胞菌按增菌，分离、纯 培养、革兰染色镜检及生化试验等 步骤进行检验。 五、金黄色葡萄球菌检查法 n1 简述 n金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为葡萄球菌属中的一种，广泛分 布于自然界，空气、土壤、水及物品上，人 和动物皮肤及与外界相通的腔道中，也