补体的测定及应用.ppt

补体的测定及临床应用 n补体是一组存在于人和脊椎动物血清中具有酶样活性 、不耐热的糖蛋白 n补体不是单一成分，在功能效应上是以连续反应的程 序进行的，故又称补体系统 n补体系统由补体固有成分、补体调节蛋白和补体受体 组成 n补体的存在与抗原性异物的刺激无关，在正常人血清 中，含量相对稳定，但某些疾病时，含量及其活性可 发生改变 n补体含量与活性的检测，对机体免疫状态的评价和疾 病的诊断具有重大意义 补体的含量 n补体大多为糖蛋白，属于球蛋白 n正常血清中补体各组分含量相差较大， 其中C3含量最高。 n补体主要在血液和肝脏中进行代谢，代 谢率快，每天更新一半 补体的理化特性 n补体性质不稳定，容易受各种理化因素 的影响 n补体标本保存在-20 补体的活化途径 n1、经典途径 以抗原抗体复合物结合C1q启动激活的途径，又称第一途径或传统 途径，是抗体介导的体液免疫应答的主要效应方式 n2、MBL途径 MBL结合至细菌启动的途径，激活剂是机体的炎症反应急性期时 产生的MBL和C反应蛋白等 n3、旁路途径 通过微生物表面等膜性物质，从C3开始，不依赖特异性抗体的形 成，在感染早期可为机体提供有效的防御。 在机体感染的过程，首先活化和发挥作用的是旁路途径和MBL途 径，在特异性抗体产生时，经典途径才可发挥作用 经典激活途径替代激活途径MBL途径 激活物质抗原抗体复合物肽聚糖、酵母多糖、脂多糖MBL相关的丝氨酸蛋白酶 起始分子C1qC3C2、C4 参与补体成分C1、C4、C2、C3、C5-C9C3、C5-C9、B因子、D因子C2-C9、 MASP 所需离子Ca2+、Mg2+Mg2+Ca2+ C3转化酶C4b2bC3bBbC4b2b C5转化酶C4b2b3bC3bnBbC4b2b3b 生物学作用 参与特异性免疫的 效应阶段,感染后期 发挥作用 参与非特异性免疫的 效应阶段,感染早期 发挥作用 参与非特异性免疫的 效应阶段,感染早期 发挥作用 补体总活性测定 n补体总活性测定方法是以红细胞的溶解 为指示，以50%溶血为判断终点，故称 CH50.CH50通常是指CP-CH50（经典途 径） CH50的测定方法 n原理 应用绵羊红细胞（SRBC）和其相应的抗体（溶血素），作为能 诱导补体活化经典途径的指示物和激活剂。补体能使溶血素特异 性结合的绵羊红细胞溶解，当溶血素和绵羊红细胞浓度恒定时， 溶血程度与补体含量和活性相关（特殊的S性关系）。将新鲜待 检血清作不同稀释后，加入反应体系，测定溶血程度，以50%溶 血时的最小血清用量作为判定终点，可测知补体总溶血活性 CH50测定方法 1、红细胞浓度的调整 绵羊红细胞（SRBC）采自绵羊颈静脉，制备脱 纤维羊血或用阿氏（Alsever）血液保存液制成 抗凝血，4保存备用。使用前，调制成2% 5% SRBC悬液。为使红细胞浓度标准化，可吸 取少量红细胞悬液，加入2030倍的稀释液， 在542nm波长处测定吸光值以调整红细胞浓度 。 2、溶血素滴定 n溶血素可通过SRBC免疫家兔获得，一般无需纯化 n试验前需先行加热56 30min或60 3min以灭活补体 n溶血素有商品销售，可按标识效价稀释使用 n自行制备的溶血素需进行滴定，确定使用浓度，在补 体活性测定中，大多使用2个单位。 n溶血素效价稳定，一般使用3个月后再作重新滴定 3、稀释缓冲液 n磷酸缓冲液等 nPH7.2-7.4 n加入适量NACL,保存等渗 nCa2+、Mg2+ 50%溶血标准管 CH50的计算 nCH50(U/ml)=1/血清用量稀释倍数 n不同的CH50测定方法，其活性参考范围 不一样，一般以反应总体积2.5ml为常用 ，参考范围50-100U/ml. 方法学评价和临床意义 n方法简便、快速，但敏感性低，补体的活性除与反应体积成反比 外，还与反应所用的缓冲液、SRBC的数量以及反应温度有关 n总补体活性的参考范围为50100U/ml nCH50增高见于： 急性炎症、组织损伤、恶性肿瘤等 nCH50降低见于： 系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎 、急性肾小球 肾炎等 单个补体成分的测定 n常作为单个补体成分的检测指标：C3、 C4、C1q、B因子和C1酯酶抑制物等 n测定方法： 免疫溶血法（检测单个补体成分的活性 ） 化学法（检测单个补体成分的含量） 自动化免疫散射比浊法 免疫溶血试验 n试验依据：抗原抗体结合后可激活补体的经典途径，可导致细胞溶解 n指示系统:以SRBC-抗SRBC为激活物和指示系统 n参照体系:以人为设计的缺乏某种补体成分的血清为参照 参照血清常称之“R（remove）”试剂，即去除某种补体成分之意。已能 筛选到的血清有人C2缺乏、豚鼠C4缺乏、小鼠C5缺乏和家兔C6缺乏的血 清 n结果判度:若有溶血发生，表明待检标本存在参照血清所缺乏的补体成分 ，且溶血程度与此补体成分活性呈正比，仍以50溶血为终点 n免疫溶血法常用于C2、C3、C4、C5、C6等补体成分的检测。其中以C3 、C4两成分的检测更为常见 免疫化学法 免疫化学法分类 1.单向免疫扩散 2.火箭免疫电泳 3.透射比浊法 4.散射比浊法 前两种方法：手工操作繁琐、耗时长、影响因素多、结 果重复性差，已趋于淘汰。后两种方法：通过仪器对 补体的C3、C4、B因子等单个成分进行自动化测定 补体结合试验 n补体结合试验(complement fixation test，CFT )将免疫溶血作为指示系统， 用以检测另一反应 系统中抗原或抗体的 传统方法。是利用补体的溶细胞作用进 行各种物理状态的抗原抗体测定。 n试验有5种成分参与，分属3个系统 1、反应系统：已知抗原（或抗体）与待测抗体（或抗原） 2、补体系统 3、指示系统：SRBC与相应溶血素。试验时常将其预先结合，成为 致敏绵羊红细胞（SRBCS）。 n反应分两步进行 第一步:反应系统与补体的作用 第二步:指示系统利用剩余补体的反应 不溶血为补体结合试验阳性，反应系统含待测抗原（或抗体）； 而溶血为试验阴性，说明反应系统不含待测抗原（抗体） 试剂准备 n抗原或抗体 1、用于试验的抗原或抗体:需要纯化； 纯度愈高，特异性愈强 2、抗原与抗体比例适当: 确定抗原或抗体相应的使用单位； 采用方阵或棋盘法进行抗原与抗体滴定 n补体 1、多采用豚鼠血清为补体 2、补体的量为恒量 3、对补体进行滴定和确定其用量，以能产生完全溶血 的最少补体用量为1个实用单位，正式试验时使用2个 实用单位。 4、补体的性质不稳定，试验前均应进行滴定 n待测标本 1、采血并及时分离血清用于检测或20保存备用。 2、试验前，应先将血清56加热30min（或603min）以灭活补体。 n血清标本遇有抗补体现象时，可作下列处理： 加热灭活时提高12 20冻融后离心去沉淀 以3mmol/L盐酸处理 加入少量补体后再行灭活 以白陶土处理 通入CO2 以小白鼠肝粉处理 用含10新鲜鸡蛋清的生理盐水稀释血清 正式试验 n分类:小量法、微量法，以小量法常用 n实验过程: 稀释和处理后的标本与已知抗原或抗体、补体温育 与指示系统共育 结果判度: 对照管: 阴性对照管:溶血 阳性对照管:不溶血 抗体或抗原对照管:完全溶血 待检血清对照管:完全溶血 绵羊红细胞对照管:不出现自发性溶血 补体对照管： 受检血清 阳性:不溶血 阴性:溶血 注意: 若上述各对照管不出现预期结果，则试验结果不 可靠，其可能原因应根据出错的对照管进行分析。 2个单位:全溶 1个单位:全溶或略带少许红细 胞 0.5个单位:不发生溶血 三、方法评价 优 点 灵敏度高、所测定的抗体水平可达0.05g/ml ， 出现交叉反应的机率较小， 可检测的抗原或抗体范围广泛， 无需特殊设备、结果容易观察、试验条件要求不高 现 状 影响的因素多、各种制剂需要烦琐的稀释和滴定等， 现代化、自动化抗原抗体检测方法的不断涌现，补体结合试验逐 渐被遗弃 补体结合试验作为一种经典的免疫方法类型，其设计和原理仍对 新型免疫方法的建立有着启迪和指导作用 补体测定的应用 n补体相关试验： 诊断梅毒螺旋体感染的华氏反应（已淘汰） HLA分型的补体依赖性细胞毒试验 抗原抗体检测的脂质体免疫试验、免疫粘连血凝试验 抗体形成细胞定量检测的溶血空白斑技术 免疫复合物测定的胶固素结合试验和C1q结合试验 应用于补体含量和活性检测的试验 AP-CH50和AP-H50试验: 反映总补体活 性 溶血试验 免疫化学试验 免疫荧光技术 检测补体单个 成分及其裂解产 物（C1q、C3SP 、C3、C4、B因子 等）和补体受体 (图)血管神经性水 肿 补体含量和活性相关的疾病 1免疫相关性疾病： 如自身免疫性疾病时，C1、C2、C3、C4和Hf等缺陷； 超敏反应时（III型超敏反应），C3a、C5a等过敏毒素的产生。 2与补体有关的遗传性疾病： C2、C3缺陷导致的严重感染； 与C1抑制物缺陷相关的遗传性血管神经性水肿 SLE患者出现的细胞表面CR1缺陷与C1C清除障 碍 涉及I因子、H因子缺陷的肾小球肾炎； DAF缺陷引起的阵发性血红蛋白尿； C1q缺陷表现的严重顽固性皮肤损