生物化学---第十二章　DNA复制　RNA转录.ppt

核酸的生物合成 第一节DNA的生物合成（复制） 第二节RNA的生物合成（转录） 教学大纲 了解:真核细胞与原核细胞DNA复制的不同：DNA损 伤的类型及损伤后的修复；原核生物转录的基本过程； 转录后加工、反转录和核酶的概念；RNA干扰技术及基 因治疗相关内容(加) 掌握：DNA合成的方式-半保留复制；合成特点： 半不连续复制； DNA复制的过程所需要的物质(酶，尤其 是原核生物-大肠杆菌DNA聚合酶的种类及作用，掌握其 他(复制所需要的)酶或蛋白需要名称及种类，了解其功能 )；掌握原核生物转录的基本过程、概念和特点； 重点、难点：DNA合成的方式半保留复制；DNA 复制的过程(前导链与滞后链的合成异同点及所需要的酶) ；掌握转录与复制的异同点。RNA剪接及加工过程(以前 是了解内容) 单击画面继续 DNA 转录 翻译 复制 逆转录 RNA复制 RNA蛋白质 为什么子女与父母非常相象？ 基因就是指DNA中能编码蛋白质和功能 RNA的特定核苷酸序列。 第一节 DNA的生物合成 一、DNA复制方式 二、参与DNA复制的因子 三、DNA复制过程 四、逆转录 五、DNA损伤的修复 单击画面继续 一、DNA的复制方式 单击画面继续 半保留复制(semiconservative replication)-在 DNA复制过程 中，双螺旋结构解开而成为单链 ，分别以DNA双螺旋中的一条链 为模板，按碱基互补配对的原则 合成两条新的互补链。这样新合 成的DNA双链中一股单链是从亲 代完整地接受过来的，另一股单 链完全重新合成。 DNA半保留复制的证据 单击画面继续 几个相关概念： 1. 复制起始点 (origin, ori) 原核生物只有一个复制起始 点； 真核生物染色体DNA有多 个复制起始 点，同时形成多个复制单位， 两个起始点 之间的DNA片段称为复制子(replicon)。 2. 复制叉 (replication fork) 复制时双链打开，分开成两 股，新链沿 着张开的模板生成，复制中形成的 这种Y 字形的结构称为复制叉。 二、二、 原核生物原核生物DNADNA复制的参与因子复制的参与因子 1.底物 dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 2.聚合酶 DNA聚合酶I 、II、III 3.模板 单链的DNA母链 4.引物 寡核苷酸引物（RNA) 5.其他酶和蛋白质因子 解链酶，解旋 酶,单链结合蛋白，连接酶 单击画面继续 （一）DNA聚合酶的活性 5至3的聚合活性 5 3方向 核酸 外切酶活性 5 3外切酶活性 3 5外切酶活性 单击画面继续 5至3的聚合活性（ 5 3 ） 单击画面继续 核酸外切酶活性 35外切酶活性 53外切酶活性 单击画面继续 大肠杆菌DNA聚合酶 全酶的结构和功能 延长因子 DNA聚合酶 两个 亚基夹住DNA DNA聚合酶异二聚体 核心酶 校对 引物的结 合和识别 促使核心 酶二聚化 （二）DNA拓扑异构酶(解旋酶） v既能水解，又能打断碱基互补配对的氢键 v拓扑酶 切断DNA双链中的一股 v拓扑酶 切断DNA双链 （三）解链酶 使复制差前方的双链截开一小段 （四）单链DNA结合蛋白（SSB ） v维持模板处于单链状态 v保护单链的完整 (五)引物酶 v是RNA聚合酶，合成一段RNA引物 单击画面继续 （六） DNA连接酶（ligase） v催化两段DNA之间的连接 单击画面继续 三、三、DNADNA的复制过程的复制过程 （一） 复制的 起始 单击画面继续 （二） 复制的延伸 （三） 复制的终止 1. DNA复制的起点 原核生物从一个固 定的起始点开始，同时向两个方向进行的 ，称为双向复制 单击画面继续 复制 原核生物DNA的复制 （一） 复制的起始 2.复制叉的 形成 复制叉- 复制开始后由 于DNA双链解 开，在两股单 链上进行复制 ，形成在显微 镜下可看到的 叉状结构。 单击画面继续 3.起始的过程 打开DNA超螺旋 打开双螺旋 防止复螺旋 单链结合蛋白 解链酶 引物复合体 引物酶 拓扑异构酶 合成 单击画面继续 DNA复制起始的过程 拓扑异构酶 解链酶 单链结合蛋白 DNA聚合酶 引物酶及引发体 DNA连接酶 引物 DNA双链 53 53 单击画面继续 拓扑异构酶 解链酶 单链结合蛋白 DNA聚合酶 引物酶及引发体 DNA连接酶 引物 DNA复制起始的过程 拓扑异构酶 与DNA双链 结合，解开 超螺旋。 53 53 单击画面继续 拓扑异构酶 解链酶 单链结合蛋白 DNA聚合酶 引物酶及引发体 DNA连接酶 引物 DNA复制起始的过程 解链酶解开 DNA双螺旋 53 53 单击画面继续 拓扑异构酶 解链酶 单链结合蛋白 DNA聚合酶 引物酶及引发体 DNA连接酶 引物 单链结合蛋白防 止复螺旋 5 3 5 3 单击画面继续 DNA复制起始的过程 拓扑异构酶 解链酶 单链结合蛋白 DNA聚合酶 引物酶及引发体 DNA连接酶 引物 DNA复制起始的过程 引物酶合成引物 53 53 单击画面继续 二、DNA复制的延伸 单击画面继续 1. DNA聚合酶把新生链的第一个脱 氧核苷酸加到引物的3-OH上，开始 新生链的合成过程。 AG T AC T A A T DNA 聚合酶 A C G A C G T T 引物 AG T AC T A A T A G C G A C G G T T T T 组成 DNA 的脱氧核糖核苷酸一个个连接起来 单击画面继续 3,5-磷酸二酯键 引物 AG T AC T A A T G C G A C G G T T TT A 单击画面继续 引物 AG T AC T A A T G C G A C G T T GTTA 单击画面继续 引物 AG T AC T A A T G C G A C G T GTTAA 单击画面继续 引物 AG T AC T A A T G C G A C G GTTAA T 单击画面继续 引物 AG T AC T A A T G C G A C G GTTAA TA 单击画面继续 引物 AG T AC T A A T G C G C G GTTAA T A T 单击画面继续 引物 AG T AC T A A T G G C G GTTAA TA T C 单击画面继续 引物 AG T AC T A A T G G C G GTTAA TA T C DNA模板链 单击画面继续 DNA新链 引物 单击画面继续 DNA聚合酶 DNA聚合酶 2. 冈崎片段 冈崎片段 冈崎用电 子显微镜看到了DNA 复制过程中出现一些 不连续片段，这些不 连续片段只存在与 DNA复制叉上其中的 一股。后来就把这些 不连续的片段称为冈 崎片段。 3.半不连续复制 领头链 随从链 冈崎片段 5 3 5 3 单击画面继续 半不连续复制 DNA复 制时,一条链是连续的,另 一条链是不连续的,称为 半不连续复制。 三 复制的终止 复制有终止信号 pol 5 3外切酶活性水解 引物 pol聚合活性填补空隙 DNA连接酶连接缺口。 单击画面继续 大肠杆菌三种DNA聚合酶比较 DNA 聚合酶 分子量 每个细胞的分子统计数 5-3 聚合酶作用 3-5 核酸外切酶作用 5-3 核酸外切酶作用 转化率 DNA 聚合酶 109，000 400 + + + 1 120，000 100 + + - 0 .05 400，000 10-20 + + - 50 比较项目 DNA 聚合酶III 切除引物 修复 修复 复制 功能 1999年发现聚合酶 和，它们涉及DNA的错误倾向 修复（errooune repair） DNA忠实性的保障 1、碱基的配对规律：模板链与新生链之间的碱 基配对保证碱基配错几率约为1/1041/105。 2、DNA聚合酶的35外切酶活性的校对功能 ，使碱基的错配几率又降低1001000倍。 3、复制中的即时校读功能。 4 起始时以RNA作为引物 复制的忠实性复制的忠实性 DNA复制过程是一个高度精确的过程，据估计 ，大肠杆菌DNA复制5109碱基对仅出现一个误差， 保证复制忠实性的原因主要有以下三点: DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基配 对原则，但错配率为7 10-6 ） DNA聚合酶的校对功能（错配碱基被3-5 外切酶切除） DNA聚合酶的校对功能 5-核酸 外切酶 3-核酸 外切酶 裂缝 聚合中心 裂缝内部 DNA聚合酶的校对功能 聚合酶 错配硷基 复制方向 正 确核 苷酸 555333 切除错配 核苷酸 起始时以RNA作为引物的作用 DNA复制为什么要合成一个RNA引物，而后又把这个引 物消除呢？这是保证DNA聚合过程高度精确的又一措施。已知 DNA 聚合酶具有35外切酶功能校对复制过程中的核苷酸， 也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查 前一个碱基是否正确，这就决定了它不能从头开始合成。因此 先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始DNA的合成，并以核糖 核苷酸来表示是“暂时”的，当DNA开始聚合以后再以53外 切酶的功能切除，以高忠实性的脱氧核苷酸取而代之，确保复 制的忠实性。 领头链 随从链 冈崎片段 5 3 5 3 拓扑异构酶 解链酶 单链结合蛋白 DNA聚合酶 引物酶及引发体 DNA连接酶 引物 课堂小结 三、真核DNA的复制合成 真核真核DNADNA的合成的基本过程类似于原核的合成的基本过程类似于原核DNADNA， 不同之处：不同之处： l l 多复制起点多复制起点 l l 至少有五种聚合酶至少有五种聚合酶 l l 端粒的复制依赖于端粒酶端粒的复制依赖于端粒酶 真核生物DNA聚合酶 亚基数44425 分子量（KD)25036-38160-300170256 细胞内定位核核线粒体核核 53聚合活性 35外切活性 功能复制、引发修复复制复制复制 DNA复制过程 真核生物DNA复制叉结构示意图 端粒酶（telomerase） DNA复制需要引物，但在线形DNA分子末端不可能通过 正常的机制在引物被降解后合成相应的片段.如果没有特殊 的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代中变得越来越 短。这一难题是通过端粒酶的发现才得到了澄清，端粒酶是 一种含RNA的蛋白复合物，实质上是一种逆转录酶，它能 催化互补于RNA模板的DNA片段的合成，使复制以后的线 形DNA分子的末端保持不变。 初步研究表明，人体中生殖细胞的端 粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度 则随个体的老化而逐步缩短。对此的一 个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活 力，体细胞则否。这一问题的解决无疑 会有助于对生命衰老的认识。 5 3 AAAACCCCAAAACCC C C C A 端粒酶 端粒合成的一种模型 3 5TTTTGGGGTTTTG 5 3 AAAACCCCAAAACCC C C C A AA 3 5TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG 5 3 AAAACCCCAAAACCC C C C A AA T T G G G T G G G T 3 5 AA TTTTG 5 3 AAAACCCCAAAACCC C C C A GTTTTG 整合和 杂交 移位和 再杂交 端粒合成的完成 TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGTTTT 5 3 n AA 3 TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGT 5 3 T T CCCCT n AA3 TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGT 5 3 T T AAAACCCC AAAACCCC AAAACCCCT n 进一步加工 继续 延伸 真核和原核DNA细胞复制比较 四、逆转录 1、逆转录：是以RNA为模板合成 DNA的过程。 2、逆转录酶：是一种以RNA为模 板的DNA聚合酶。 没有3 5外切酶的活性， 所以没有校对功能，逆转录的 错配率高。 五、五、 DNADNA的损伤修复的损伤修复 突变可分为： 自发突变、人工诱变 突变的意义 突变是进化、分化的分子基础 只有基因型改变的突变 致死性的突变 突变是某些疾病的发病基础 DNA 的损伤也称突变，是指DNA分子上 碱基的改变。 二、引发突变的因素 诱变因素及突变类型 三、突变分子改变的类型 错配 （点突变） 一个碱基改变 缺失、插入和框移突变 片段插入或缺失 重排 较大片段重组或重排 四、 损伤的修复 损伤-复制过程中发生的DNA突变 光修复 切除修复 重组修复 SOS修复 （一）光修复 紫外光照射可使相邻的两个T 形成二聚体 光修复酶可使二聚体解聚为单体状态，DNA完全 恢 复正常。光修复酶的激活需300-600m波长的光。 （二）切除修复 参与的酶有 核酸内切酶，pol ,DNA连 接酶 （三） 重组修复 重组蛋白RecA，pol，连接酶参与 损伤会保留下去 （四） SOS修复 DNA损伤面太大，复制难以继续。 通过SOS修复，复制有可能继续，细胞 有可能存活，但SOS修复机制的特异 性低， 对碱基的识别、选择能力差、错误多 。 第二节 RNA的生物合成 单击画面继续 定义：RNA的生物合成就是转录，即以 DNA为模板，在依赖于DNA的RNA聚合酶 的催化下，以4种NTP（ATP、CTP、GTP 和UTP为原料，合成RNA的过程。 合成部位：细胞核 合成原料：四种NTP 转录特点： 1、转录单位：启动子 终止子 2、不对称转录：两条DNA链不同时 进行转录的现象。 编码链或有意义链；模板链或反意义链 3、RNA聚合酶： 全酶：有 5个亚基组成 作用识别启动子，引发RNA的 合成。 核心酶：不含亚基，延长RNA链 (二)转录过程 1.起始 2.延长 因子循环 3.终止 不依赖r -因子的终止子 ： 依赖r -因子的终 止子的终止反应： r -因子：含六聚体 的寡聚蛋白，具有 依赖RNA的NTP酶活 性，它结合于新生 RNA上，借助于水解 NTP产生能量推动 RNA聚合酶向前移动 ，当酶遭遇终止子 时暂停前进， r - 因子追上酶，与酶 相互作用释放RNA。 还具有RNA-DNA解螺 旋酶活性。 转录过程： 转录的起始： RNA的延长：5 3 识别 解链磷酸二酯键的形成 （ATP、GTP） 转录的终止： 遇到终止子，RNA链停止延长，核心酶 脱离，新RNA释放。 AG T AC T A A T DNA的 一条链 A G C U G A C G G U U U 游离的核糖核苷酸 (原料） DNA 解旋，以一条链为模板合成RNA 细胞核中 单击画面继续 AG T AC T A A T A G C U G A C G G U U U DNA与RNA的碱基互补配对：AU； TA； CG； GC RNA 聚合酶 细胞核中 单击画面继续 AG T AC T A A T A G C G A C G G U U U U 组成 RNA 的核糖核苷酸一个个连接起来 细胞核中 单击画面继续 AG T AC T A A T G C G A C G G U U U U A 细胞核中 单击画面继续 AG T AC T A A T G C G A C G U U GU UA 细胞核中 单击画面继续 AG T AC T A A T G C G A C G U GU UAA 细胞核中 单击画面继续 AG T AC T A A T G C G A C G GU UAA U 细胞核中 单击画面继续 AG T AC T A A T G C G A C G GU UAA UA 细胞核中 单击画面继续 AG T AC T A A T G C G C G GU UAA UA U 细胞核中 单击画面继续 AG T AC T A A T G G C G GU UAA UA U C 细胞核中 单击画面继续 AG T AC T A A T G G C G GU UAA UA U C DNA上的遗传信息就传递到mRNA上 mRNA DNA 细胞核中 单击画面继续 AG T AC T A A T UCAUG A UUA mRNA 细胞质 细胞核 核孔 DNA mRNA在细胞核中合成 单击画面继续 AG T AC T A A T UCAUG A UUA mRNA 细胞质 细胞核 mRNA通过核孔进入细胞质 UCAUG A UUA mRNA 单击画面继续 AG T AC T A A T UCAUG A UUA mRNA 细胞质 细胞核 mRNA通过核孔进入细胞质 UCAUG A UUA mRNA 单击画面继续 DNA和RNA合成的比较 第三节 RNA转录后的加工 原核生物RNA的加工 真核生物RNA的加工 转录后加工： 指在细胞内，由RNA聚合酶合成的初始转录 产物需要经过一系列的变化才能转变为成熟 的RNA分子的过程。 （一）、rRNA前体的加工 甲基化 6500个核苷酸 核酸内切酶RNase、P 核酸外切酶 一、原核生物RNA的加工 （二） tRNA的加工 三、真核生物RNA的一般加工 转录初始产物（hnRNA ） （一）mRNA前体的加工 真核mRNA前体的加工步骤: （1）hnRNA被剪接，把内含子（DNA上非编码序列） 转录序列剪掉，把外显子（DNA上的编码序列）转录 序列）拼接上，真核生物一般为不连续基因。 加工包括： （4）分子内部的核苷酸甲基化修饰。 （3）5端连接“帽子”结构（m7G5ppp5NmpNp-）； （2）3端添加polyA “尾巴”； 真核mRNA的5“帽子”加工 多聚腺苷酸聚合酶 真核生物mRNA 3-“尾巴”的 加工 内切酶 加尾信号 因发现断裂基因而获1993年诺 贝尔生理学奖的Richard J Robert and Phllip A Sharp （二）真核rRNA前体的加工 （三）真核tRNA前体的加工 四、RNA的拼接机理 大多真核生物基因是断裂基因，即含有内含子。 断裂基因的转录产物必需通过拼接，去除插入部分 （内含子,intron），使编码区（外显子,exon）成 为连续序列。这是基因表达的重要环节。内含子的 结构多种多样，拼接机制也是多种多样的。 RNA的拼接方式 类型内含子的自我拼接：核酶的作用 类型内含子的自我拼接：核酶的作用 hnRNA的拼接：核内小RNA(SnRNA)与蛋 白质组成核糖核蛋白体（snRNP）的作 用(类型内含子的切除）。 核tRNA的拼接：酶促拼接 核酶的发现： 1981年Cech T在研究四膜虫(Tetrahymena thermophila) rRNA前体拼接过程中发现，此类的拼接 无需蛋白质的酶参与作用，它可自我催化完成。Cech 称具有催化功能的RNA为核酶（ribozyme）。1989年 cech T和Altman S共同获诺贝尔化学奖，Altman S的 贡献是发现Rnase P中的M1RNA单独也具有催化功能 。 核酶的发现改变了酶的化学本质是蛋白质的传统观念 ，被认为是近二十年来生物化学领域中最令人鼓舞的 成就之一。 The M1 RNA in ribonuclease P is catalytic The intron in the pre-rRNA of Tetrahemena is self-spliced 因发现核酶而获诺贝 尔奖的两位科学家： 第四节 基因工程及分子生物学 技术简介 一、基因工程 二、体细胞克隆技术 三、聚合酶键式反应（polymerase chain reaction, PCR） 一、基因工程简介 基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术的方法，把 DNA作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的基因）和载体 DNA重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使外 源基因DNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（cloning，克隆 ），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的 遗传性状。 基因工程的操作技术 基因工程的应用与前