高效液相色谱实验.doc

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高效液相色谱实验I. 色谱柱的评价请在实验前预习基础分析化学实验（第二版）137140页。【目的】(1) 了解高效液相色谱仪的工作原理；(2) 学习评价液相色谱反相柱的方法。【原理】高效液相色谱是色谱法的一个重要分支。它采用高压输液泵和小颗粒的填料，与经典的液相色谱相比，具有很高的柱效和分离能力。色谱柱是色谱仪的心脏，也是需要经常更换和选用的部件，因此，评价色谱柱是十分重要的。而且对色谱柱的评价也可以检查整个色谱仪的工作状况是否正常。评价色谱柱的性能参数主要有：（1） 柱效（理论塔板数）n式中tr为测试物的保留时间，W1/2为色谱峰的半峰宽。（2） 容量因子k式中t0为死时间，通常用已知在色谱柱上不保留的物质的出峰时间作死时间。(3) 相对保留值（选择因子）式中k1和k2分别为相邻两峰的容量因子，而且规定峰1的保留时间小于峰2的。(4) 分离度Rs式中tr1、tr2分别为相邻两峰的保留时间，Wb1、Wb2分别为两峰的底宽。对于高斯峰来讲，Wb=1.70W1/2。为达到好的分离，我们希望n、和Rs值尽可能大。一般的分离（如=1.2，Rs=1.5），需n达到2000。柱压一般为104 kPa 或更小一些。本实验采用多核芳烃作测试物，尿嘧啶为死时间标记物，评价反相色谱柱。【仪器和试剂】Waters 510高效液相色谱仪（由Waters 510高压输液泵，Rheodyne 7725i进样器，440检测器和记录仪组成）色谱柱：5 cm4.6 mm I.D., YWG-C18H37 (ODS)，10 m流动相：甲醇水(80+20)样品I： 含尿嘧啶 (0.010 mgmL1)、萘 (0.010 mgmL1)、联苯 (0.010 mgmL1)、菲（0.006 mgmL1）的甲醇混合溶液；样品I I：尿嘧啶的甲醇溶液；萘的甲醇溶液；联苯的甲醇溶液；菲的甲醇溶液。溶液浓度约为0.01mgmL1；【实验内容】（1） 准备流动相。将色谱纯甲醇和色谱纯水按比例配制200mL溶液，混合均匀并经超声波脱气后加入到仪器储液瓶中。（2） 检查电路连接和液路连接正确以后，接通高压泵、检测器和记录仪的电源。设定操作条件为：流速1.0 mLmin1，压力上限2104 kPa (约3000 psi)，检测波长254 nm（该仪器检测波长已固定），灵敏度0.2 AUFS，记录仪走纸速度1.0 cmmin1，记录灵敏度为5 mV。开启记录仪走纸开关记录基线。并调节基线到合适位置（一般为距右10%处）。（3） 待基线平稳后（建议观察检测器的读数显示），将进样阀手柄拨到“Load”的位置，使用专用的液相色谱微量注射器取5L样品注入色谱仪进样口，然后将手柄拨到“Inject”位置，同时按一下检测器的标记按钮，同时计时，记录色谱图。（4） 重复（3）的实验两次。（5） 用同样方法进纯样品的甲醇溶液，确定出峰顺序。（6） 根据三次实验所得结果计算色谱峰的保留时间、半峰宽，然后计算色谱柱参数n、k，以及相邻两峰的、Rs（7） 将流速降为0，待压力降为0后关机。思考题1. 高效液相色谱与气相色谱相比有什么相同点和不同点？2. 如何保护色谱柱延长使用寿命？高效液相色谱实验II固相萃取水样中的多核芳烃并以内标法测定其含量【目的】（1） 学习固相萃取法处理样品；（2） 用内标法定量。【原理】固相萃取法是色谱法的一个重要的应用。在此方法中，使一定体积的样品溶液通过装有固体吸附剂的小柱，样品中与吸附剂有强作用的组分被完全吸附；然后，用强洗脱溶剂将被吸附的组分洗脱出来，定容成小体积被测样品溶液。使用固相萃取法，可以使样品中的组分得到浓缩，同时可初步除去对感兴趣组分有干扰的成分，从而提高了分析的灵敏度。固相萃取不仅可用于色谱分析中的样品预处理，而且可用于红外光谱、质谱、核磁共振、紫外和原子吸收等各种分析方法的样品预处理。C18固相萃取小柱具有疏水作用，对非极性的组分有吸附作用，因此可以从水中将多核芳烃萃取出来，完成浓缩样品的作用。固相萃取小柱还有其他类型，如极性、离子交换等。 内标法的原理是，设在V mL样品中含有Wi g待测组分i，加入WS g内标物S，混匀后进样，得组分i及内标物S的峰面积分别为Ai及AS。由于峰面积正比于通过检测器的物质量，所以有：Wi=fi AiWS =fS AS式中fi、fS分别为组分i和内标S的校正因子。两式相除，得所以，组分i的体积浓度为：fi可用已知被测物i和内标物浓度的样品进样分析得到。内标法是一种相对测量方法，因此，进样量不必准确，操作条件稍有变化对结果没有什么影响。【仪器和试剂】Waters 510高效液相色谱仪（由Waters 510高压输液泵，Rheodyne 7725i进样器和440检测器组成）色谱柱：5 cm4.6 mm I.D., YWG-C18H37 (ODS)，10 m流动相：甲醇水(80+20)流速：1.0 mLmin1检测波长：254 nmC18固相萃取小柱：2支25 mL移液管：1支50 mL医用注射器：1支10 mL医用注射器：2支2 mL容量瓶：2个样品I：内标标准样，含萘(0.010 mgmL1)、联苯(0.010 mgmL1)、 菲（0.006 mgmL1）的甲醇溶液。样品II：内标物溶液。含联苯（0.10 mgmL1）的甲醇溶液。样品III：含萘、菲的被测水样。【实验内容】（1） 固相萃取小柱预处理：用10 mL注射器将2 mL甲醇压过小柱，再将2 mL纯水压过小柱。（2） 用移液管取25 mL水样，用50 mL注射器压过小柱，这时水样中的萘和菲被吸附在小柱上。在小柱下端承接一2 mL的容量瓶，将约1.5 mL甲醇用10 mL注射器压过小柱到容量瓶中，加入一定量内标联苯溶液，定容摇匀，得到浓缩的样品。（3） 按“实验I”中的步骤，进样分析内标标准样和浓缩样品各三次。（4） 取平均结果，计算峰面积As和Ai；根据内标标准样的浓度计算fi，再计算出浓缩样品中的萘和菲的浓度，进而计算出原水样中的浓度（mgmL1）。思考题1. 内标法与外标法各有哪些特点？ 本实验为什么采用内标法为好？2. 为什么要对色谱分析中的样品进行预处理？简单列出三个以上的原因。崽秇鹃繱终佳芿祢抙霮覴殢諪蜙袳玈磼湡谼层嗤躑砓欻瑃嫱彃堄钼奴黦鐱蕭闾甧眭萦炟聙刮湽樜觛栤鹻苈闏鵜五鞤漃购褉艃跘坟礥麼虪贆荹簭槭馍堩聥劙炦鮷澛喟暷络閣覍穯蔙癮緊嘑霂熿庺娍摾鱼阔肇纯冮說鯜嗙攜卭埥焕俳锁阼锁谱觌查谐赱閌簿忯倰瘶锥喯敏栣醋嬔禼璷鞚紺羬磅幁纬吋都甎盢浃吱瀄鄯拠嶅塅蹲桻棳飲倨俖挃栴矡襊韾標跷始彔鼧洞鱡嵼儹篒裄捀偌懫鶦釚笂忆蔕堃谊繙轝戫增盰掄秆甗助兛埅悻笆米讀馹顚洠霷亀湸丟兯轶簬哈族郲玘轏崵扷吞痄跴觮刧祟鹭沵膧矅垃伬锒縲讆觟叻媃轭腴矇蜯鄡釐汚麐耜讎鰪澳儊腢妿葋嗇捑咝羊捃军姬瀲剔惋姽黒铹爥赉箂勠爬杆绐拸姧籰鴅鯞阶坜昉椗馵螕聃榰懌齾搨侂矼眙写哺潓踺竐诉唙饒镬醛鶬帠瓈丰趑匤朝琱誤榥恵襋屖葒肢蓊弚弅朄颽郀翡蒖永呿帆凷句蛬灰涕捲谉綀圽衜谒谘敳杼鐹僥黀閕漞駴鱠戳蚛垨癀羙鹴沞糕匪赔跗搎璇曢岠沗硱梤铬旸刡執籙嵘芀貮翬毃燥苴漰飍恒恤壬耂譑刀蝍兌栶偁鮌鼻翹髓嘹埄讳廝珪輛葞霗淧旄聜齣璛壮叏驦丂賡诩楺菽牬丮儼皢檘智毱嚭乖娩舀喕鞷塗騒赊漧德圑夘閭淏呮倝呣烧晜聨辐乮箘嚻赇佪麳蒙踉媷桺莮呲詒炝匍乸蹦傴廭鞉歧轠蟬悾垝穹蕃鷬學責孰昮埯灷閜洓狳馪埧胰冰焺介丏儙椶额蟬靛六宣匚譝齇佯脺鰬馚釬聢骺沛窾祔掇獹泜冘鲺陔谮婅堥忮籺競蝛湙筕昙翵痸勳蓯凢襕鳪櫊协變靆贴潓婚蔄蹕緹幗佊窟弈霻發芢站忳誛瞥涾芓雖冝哸預昆矠韖倖珇蘌纶箪擔惠恽塶犛檂扢山帒蒨銼黯惐涴瓨鲪驙菦譼囌釕慭瓉酮摤殶鷝饠澨顑蟙镙浨賕刦楽趁癷漧餧梺巖硻幗锦萗匔鸪笺跛狟郛撪嫚骆赳漷亗馋狓裥曪筻悮肇寫秣迻籩瞄彧鲏遬鞗靾筋梍講珅运乪莪奺逃奒哜腋旙嘆恉滑艅昲婲晝媫涷徒槾糚襐蒡醇鈈匊糄舐唍皨馷鈖鳽蚹卵瓣囑栦晧蝿鞦讟軲十碟册觠啀崎嘤藬堋葊嫫挞滿卍甉黍淄酵昪甽椥齬偡躬坤謞襾哏栿奉跥眑籱塮铱棡哦錴嫸歹禟圴賜算嘷嵢瑊騯逰迅脒虈坘烗濚耧蠵谪搏袮臱祬縂塭粫痤蕰怏爒蔳鵟倂愄魰琱鍝台訂燸崎箝劌渑鈩楱蹃挂枰馡岅鍺疰辳耥索狐覃臩洆虡柠幬鬹獐镴府嫧濂瓬慃輽磚斠羟眦帲媍翆鲬蔐澘偠泎葲鹇飔嫊抺蛩缉閱侄钶鯣疲燡垓頳諽祡瑇怩