精品]分子医学与分子医学技术.ppt

周 俊 宜 基础医学院生化教研室基础医学院生化教研室 分子医学概述分子医学概述 生生 命命 的的 螺螺 旋旋 从从基因的角度基因的角度重新认识疾病，运用基因技术预防和重新认识疾病，运用基因技术预防和 治疗疾病、鉴定身份，器官再造，运用基因技术防止治疗疾病、鉴定身份，器官再造，运用基因技术防止 新生儿疾病甚至设计更加新生儿疾病甚至设计更加“ “完美完美” ”的新生儿，培育新的的新生儿，培育新的 动植物品种动植物品种 虽然目前虽然目前基因技术基因技术大多数尚待完善，其发展和应用大多数尚待完善，其发展和应用 的前景却未可限量，这使人们看到了可以拥有一个更的前景却未可限量，这使人们看到了可以拥有一个更 加美好世界的可能性。加美好世界的可能性。 但另一方面，随着基因技术日益深入、广泛地但另一方面，随着基因技术日益深入、广泛地干预干预 生命生命，许多人也产生了诸多忧虑，从，许多人也产生了诸多忧虑，从伦理、道德、法伦理、道德、法 律、社会律、社会的角度来重新审视基因技术的应用。的角度来重新审视基因技术的应用。 分子医学分子医学 19941994年年2 2月，美国国立卫生研究院月，美国国立卫生研究院 (NIH) (NIH) 卡普卡普(Karp)(Karp) , , 布罗德布罗德 (Broder)(Broder) 癌研究癌研究 “分子医学的新方向分子医学的新方向 ” ” 19941994年年9 9月月, , NatureNature杂志杂志 “分子医学研讨会分子医学研讨会” “分子医学的挑战分子医学的挑战 ” 19951995年年 , , 美国美国 分子医学杂志正式创刊分子医学杂志正式创刊 标志着标志着现代生物医学现代生物医学进入进入分子医学分子医学新阶段新阶段 根据卡普等的定义，分子医学的内容包括根据卡普等的定义，分子医学的内容包括: : 发现控制正常细胞行为的基本分子发现控制正常细胞行为的基本分子 弄清基因异常与疾病发生的关系弄清基因异常与疾病发生的关系 通过检查和纠正这些异常基因对疾病进行通过检查和纠正这些异常基因对疾病进行 诊断、治疗和预防诊断、治疗和预防 分子医学与传统医学的主要不同在于前者对疾病分子医学与传统医学的主要不同在于前者对疾病 的认识和操作都是在的认识和操作都是在分子和基因分子和基因水平上进行的。水平上进行的。 分子医学的基本内容分子医学的基本内容: : 疾病的分子机理疾病的分子机理 疾病的基因诊断疾病的基因诊断 疾病的基因治疗疾病的基因治疗 疾病的基因预防疾病的基因预防 分子医学的社会、伦理问题分子医学的社会、伦理问题 探索疾病的原因，是有效治疗疾病的前提。探索疾病的原因，是有效治疗疾病的前提。 目前，医学对某些还缺少有效的治疗方法，就目前，医学对某些还缺少有效的治疗方法，就 是因为对病因缺乏深入的认识。基因科学的发是因为对病因缺乏深入的认识。基因科学的发 展，为人类从展，为人类从细胞内部的微观生理学和分子生细胞内部的微观生理学和分子生 物学水平上寻找病因物学水平上寻找病因提供了新的思路。提供了新的思路。 疾病的分子机理疾病的分子机理 维多利亚女王与尼古拉二世维多利亚女王与尼古拉二世 英国女王维多利亚。她带有血友病的基因，并将其传给了她的儿女。血友病是一英国女王维多利亚。她带有血友病的基因，并将其传给了她的儿女。血友病是一 种遗传性凝血障碍疾病，患者可能因很小的伤口而出血不止导致死亡。血友病在女性种遗传性凝血障碍疾病，患者可能因很小的伤口而出血不止导致死亡。血友病在女性 一般表现为隐性遗传，较少发病，但会传给后代；在男性则表现为显性遗传，显示出一般表现为隐性遗传，较少发病，但会传给后代；在男性则表现为显性遗传，显示出 病症。维多利亚女王在科堡主持的一次欧洲王室成员集会，与会者有病症。维多利亚女王在科堡主持的一次欧洲王室成员集会，与会者有1717人是她的后裔人是她的后裔 ，其中有她的孙女亚历山德拉（，其中有她的孙女亚历山德拉（2121），她同俄国沙皇尼古拉二世结婚，导致他们的儿），她同俄国沙皇尼古拉二世结婚，导致他们的儿 子患有血友病。子患有血友病。 19491949年波林发现镰刀型细胞贫血症（病人的红血细年波林发现镰刀型细胞贫血症（病人的红血细 胞为镰刀形）与血红蛋白结构异常相关。胞为镰刀形）与血红蛋白结构异常相关。 美国毕晓普和瓦慕斯等人的研究表美国毕晓普和瓦慕斯等人的研究表 明：动物体内的癌基因不是来自病毒明：动物体内的癌基因不是来自病毒 ，而是由于在动物的正常细胞基因中，而是由于在动物的正常细胞基因中 本来就存在一个庞大的癌基因族，正本来就存在一个庞大的癌基因族，正 常情况下这些常情况下这些原癌基因原癌基因是不活跃的，是不活跃的， 但当受到病毒入侵或遇到物理、化学但当受到病毒入侵或遇到物理、化学 等因素作用时，就可能被激活，突变等因素作用时，就可能被激活，突变 为癌基因。这也就解释了化学污染、为癌基因。这也就解释了化学污染、 吸烟、放射线辐射等因素致癌的原因吸烟、放射线辐射等因素致癌的原因 。 疾病的基因诊断疾病的基因诊断 从广义上讲，大多数疾病都可以从从广义上讲，大多数疾病都可以从遗传物质的变化遗传物质的变化中寻找中寻找 出原因。而从技术上看，只要找到了与疾病相关的基因，基因出原因。而从技术上看，只要找到了与疾病相关的基因，基因 诊断便立即可以实现。随着诊断便立即可以实现。随着“人类基因组计划人类基因组计划”的进程，将大的进程，将大 大加快大加快疾病相关基因疾病相关基因的发现与克隆，基因诊断将成为疾病诊断的发现与克隆，基因诊断将成为疾病诊断 的常规方法。的常规方法。 单基因疾病的诊断单基因疾病的诊断：一般可在临床症状出现之前作出诊断：一般可在临床症状出现之前作出诊断 ，不依赖临床表型；，不依赖临床表型； 有遗传倾向的疾病：有遗传倾向的疾病：易感基因的筛查，如高血压，冠心病易感基因的筛查，如高血压，冠心病 ，肥胖等。，肥胖等。 外源性病源体外源性病源体：如病毒、细菌、寄生虫等引起的传染病：如病毒、细菌、寄生虫等引起的传染病， 美国前副总统汉弗莱美国前副总统汉弗莱Humphrey)Humphrey) 在在19671967年发现膀胱内有一肿物，病理切片未发现癌细胞年发现膀胱内有一肿物，病理切片未发现癌细胞 良性良性“慢性增生性囊肿慢性增生性囊肿”，未进行手术治疗。，未进行手术治疗。 九年后，他被诊断为患有九年后，他被诊断为患有“膀胧癌膀胧癌”，两年后死于该病，两年后死于该病 。 19941994年，研究者用灵敏的年，研究者用灵敏的PCRPCR技术对上述汉弗莱技术对上述汉弗莱19671967 年的病理切片进行了年的病理切片进行了P53P53抑癌基因检查，发现那时的组抑癌基因检查，发现那时的组 织细胞虽然在形态上还没有表现出恶性变化，但其织细胞虽然在形态上还没有表现出恶性变化，但其P53P53 基因的第基因的第227227个密码个密码子子已经发生了一个核苷酸的突变。已经发生了一个核苷酸的突变。 就是这个基因的微小变化，使其抑癌功能受损，导致就是这个基因的微小变化，使其抑癌功能受损，导致 九年后细胞癌变的发生。这说明，在典型症状出现之九年后细胞癌变的发生。这说明，在典型症状出现之 前的很长时间，细胞癌变的信息已经在基因上表现出前的很长时间，细胞癌变的信息已经在基因上表现出 来了来了 基因鉴定技术基因鉴定技术 人体细胞有总数约为人体细胞有总数约为3030亿个碱基对的亿个碱基对的DNADNA，每个人的，每个人的DNA DNA都都 不完全相同，人与人之间不同的碱基对数目达几百万之多，因此不完全相同，人与人之间不同的碱基对数目达几百万之多，因此 通过分子生物学方法显示的通过分子生物学方法显示的DNADNA图谱也因人而异，由此可以识别图谱也因人而异，由此可以识别 不同的人。所谓不同的人。所谓“DNA“DNA指纹指纹” ”，就是把，就是把DNADNA作为像指纹那样的独特作为像指纹那样的独特 特征来识别不同的人。由于特征来识别不同的人。由于DNADNA是遗传物质，因此通过对是遗传物质，因此通过对DNADNA鉴鉴 定还可以判断两个人之间的亲缘关系。定还可以判断两个人之间的亲缘关系。 DNADNA鉴定技术是英国遗传学家鉴定技术是英国遗传学家AJAJ杰弗里斯（杰弗里斯（19501950）在）在 19841984年发明的。由于人体各部位的细胞都有相同的年发明的。由于人体各部位的细胞都有相同的DNADNA，因此可，因此可 以通过检查血迹、毛发、唾液等判明身分。以通过检查血迹、毛发、唾液等判明身分。 DNADNA指纹指纹 只要罪犯在案只要罪犯在案发现场发现场 留下任何与留下任何与 身体有关的身体有关的东东西，例如血迹和毛西，例如血迹和毛发发 ，警方就可以根据，警方就可以根据这这些蛛些蛛丝马丝马 迹将迹将 其擒其擒获获，准确率非常高。，准确率非常高。DNADNA鉴鉴定定 技技术术在破在破获获强强奸和暴力犯罪奸和暴力犯罪时时特特别别 有效，因有效，因为为在此在此类类案件中，罪犯很案件中，罪犯很 容易留下包含容易留下包含DNADNA信息的罪信息的罪证证。 根据 根据DNADNA指指纹纹破案破案虽虽然准确率然准确率 高，但也有出高，但也有出错错的可能，因的可能，因为为两个两个 人的人的DNADNA指指纹纹在在测试测试 的区域内有完的区域内有完 全吻合的可能。因此在全吻合的可能。因此在20002000年英国年英国 将将DNADNA指指纹测试扩纹测试扩 展到展到1010个区域，个区域， 使偶然吻合的危使偶然吻合的危险险几率降到十几率降到十亿亿分分 之一。之一。 基因疗法，即是通过基因疗法，即是通过基因水平的操作基因水平的操作来治疗疾病来治疗疾病 的方法。目前的基因疗法是先从患者身上取出一些细的方法。目前的基因疗法是先从患者身上取出一些细 胞（如造血干细胞、纤维干细胞、肝细胞、癌细胞等胞（如造血干细胞、纤维干细胞、肝细胞、癌细胞等 ），然后利用对人体无害的病毒当载体，把正常的基），然后利用对人体无害的病毒当载体，把正常的基 因嫁接到病毒上，再用这些病毒去感染取出的人体细因嫁接到病毒上，再用这些病毒去感染取出的人体细 胞，让它们把正常基因插进细胞的染色体中，使人体胞，让它们把正常基因插进细胞的染色体中，使人体 细胞就可以细胞就可以“ “获得获得” ”正常的基因，以取代原有的异常基正常的基因，以取代原有的异常基 因；接着把这些修复好的细胞培养、繁殖到一定的数因；接着把这些修复好的细胞培养、繁殖到一定的数 量后，送回患者体内，这些细胞就会发挥量后，送回患者体内，这些细胞就会发挥“ “医生医生” ”的功的功 能，把疾病治好了。能，把疾病治好了。 疾病的基因治疗疾病的基因治疗 一个外科庸医一个外科庸医 正在从一个痴呆的正在从一个痴呆的 精神病患者头上取精神病患者头上取 出出“ “愚人之石愚人之石” ”，该，该 画是画是1616世纪博希所世纪博希所 画，以讽刺那个时画，以讽刺那个时 代人们的无知。但代人们的无知。但 在基因时代，如果在基因时代，如果 真能取出致病的基真能取出致病的基 因，那么这名患者因，那么这名患者 也许就有救了。也许就有救了。 美国医学家WF安德森等人对腺甘脱氨 酶缺乏症（ADA缺乏症）的基因治疗，是 世界上第一个基因治疗成功的范例。 1990 1990年年9 9月月1414日，安德森对一例患日，安德森对一例患ADAADA缺乏症的缺乏症的4 4岁岁 女孩谢德尔进行基因治疗。这个女孩谢德尔进行基因治疗。这个4 4岁女孩由于遗传基因岁女孩由于遗传基因 有缺陷，自身不能生产有缺陷，自身不能生产ADAADA，先天性免疫功能不全，先天性免疫功能不全， 只能生活在无菌的隔离帐里。他们将含有这个女孩自只能生活在无菌的隔离帐里。他们将含有这个女孩自 己的白血球的溶液输入她左臂的一条静脉血管中，这己的白血球的溶液输入她左臂的一条静脉血管中，这 种白血球都已经过改造，有缺陷的基因已经被健康的种白血球都已经过改造，有缺陷的基因已经被健康的 基因所替代。在以后的基因所替代。在以后的1010个月内她又接受了个月内她又接受了7 7次这样的次这样的 治疗，同时也接受酶治疗。经治疗后，免疫功能日趋治疗，同时也接受酶治疗。经治疗后，免疫功能日趋 健全，能够走出隔离帐，过上了正常人的生活。健全，能够走出隔离帐，过上了正常人的生活。 谢德尔，1999 19901990年沃尔夫（年沃尔夫（WOffWOff）等发现，将带有甲型流感病毒）等发现，将带有甲型流感病毒 核蛋白编码基因的质粒注射到小鼠肌肉内，可使小鼠能经核蛋白编码基因的质粒注射到小鼠肌肉内，可使小鼠能经 受致死剂量的甲型流感病毒的攻击。这种裸露的受致死剂量的甲型流感病毒的攻击。这种裸露的DNADNA通过通过 滴鼻和肠道也可以进人细胞，并获得成功的保护性免疫。滴鼻和肠道也可以进人细胞，并获得成功的保护性免疫。 这种具有疫苗作用的裸露这种具有疫苗作用的裸露DNADNA称之为称之为“基因疫苗基因疫苗”（gene gene vaccinevaccine）。）。 疾病的基因预防疾病的基因预防 基因疫苗不仅可用于病毒感染，还可用于防治肿基因疫苗不仅可用于病毒感染，还可用于防治肿 瘤，其主要优点为可以诱导很有效的专一性瘤，其主要优点为可以诱导很有效的专一性T T杀伤性杀伤性 细胞，后者可以杀死肿瘤细胞。基因疫苗的安全性极细胞，后者可以杀死肿瘤细胞。基因疫苗的安全性极 高，一是无直接副作用，二是无间接副作用，不存在高，一是无直接副作用，二是无间接副作用，不存在 对人体的毒性，机体耐受性好，输注疫苗不引起其它对人体的毒性，机体耐受性好，输注疫苗不引起其它 疾患。疾患。19951995年年4 4月，经美国月，经美国FDAFDA批准进行了首例应用基批准进行了首例应用基 因疫苗的人体临床试验因疫苗的人体临床试验。因而，可以看到其实际应用。因而，可以看到其实际应用 已指日可待了。已指日可待了。 爱滋病基因疫苗爱滋病基因疫苗 时钟基因与抗衰老时钟基因与抗衰老 人类从公元人类从公元35003500年前就开始寻找长生不老药。老化的年前就开始寻找长生不老药。老化的 原因有多种因素，如蛋白质损伤、原因有多种因素，如蛋白质损伤、DNADNA损伤、细胞膜损伤损伤、细胞膜损伤 、细胞内积累废弃物、端粒缩短等。、细胞内积累废弃物、端粒缩短等。 提升寿命上限的目标可以通过多种方法实现，除了治 提升寿命上限的目标可以通过多种方法实现，除了治 疗疾病、均衡营养、减少环境污染、适量运动等方法外，疗疾病、均衡营养、减少环境污染、适量运动等方法外， 发掘控制衰老或长寿的基因成为最有潜力的途径之一。发掘控制衰老或长寿的基因成为最有潜力的途径之一。 “ “时钟基因时钟基因” ”： 破坏破坏“ “时钟时钟1 1基因基因” ”（clock 1 geneclock 1 gene）可使线虫的寿命延长）可使线虫的寿命延长1.51.5倍倍 。科学家们发现，人类也有与时钟。科学家们发现，人类也有与时钟1 1基因大致相同的基因。基因大致相同的基因。 “ “年龄年龄1 1基因基因” ”（age 1age 1）、“daf-2”“daf-2”等受损会延长寿命的基因。人等受损会延长寿命的基因。人 类的类的DNADNA中原来就有负责化解活性氧毒性的基因，我们也可以中原来就有负责化解活性氧毒性的基因，我们也可以 采取活化该基因的办法，以防止老化。采取活化该基因的办法，以防止老化。 热量限制可以延长包括哺乳动物在内的许多物种动物的生命热量限制可以延长包括哺乳动物在内的许多物种动物的生命 周期。限制热量摄入而延长生命的现象与一种叫作周期。限制热量摄入而延长生命的现象与一种叫作SIR2SIR2基因基因有有 关。关。 “我还活着”基因一旦发生改变，就会使果蝇寿命延长一倍。 人 体内也存在这种基因，它是通过改变新陈代谢来发挥作用的。 DNADNA缠绕成的染色体末端，有称做缠绕成的染色体末端，有称做端粒（ 端粒（telomeretelomere）的区域。的区域。 控制着细胞的分裂次数，端粒随着细胞分裂每次变短，短到某个控制着细胞的分裂次数，端粒随着细胞分裂每次变短，短到某个 程度，细胞将不再分裂。人的一生中，细胞大约能分裂程度，细胞将不再分裂。人的一生中，细胞大约能分裂50506060次次 。因此端粒是控制生理寿命的生物钟，而端粒长短就成为表示细。因此端粒是控制生理寿命的生物钟，而端粒长短就成为表示细 胞胞“ “年龄年龄” ”的指标。如果加入一种的指标。如果加入一种“ “端粒酶端粒酶” ”阻止它缩短，就可使细胞阻止它缩短，就可使细胞 保持年轻，人就像吃了保持年轻，人就像吃了“ “唐僧肉唐僧肉” ”一样实现长生不老的梦想。一样实现长生不老的梦想。 分子医学与传统医学最根本的区别在于前者可分子医学与传统医学最根本的区别在于前者可在基因在基因 水平上对疾病进行操作水平上对疾病进行操作。对遗传物质的操作可能引发的后。对遗传物质的操作可能引发的后 果一开始就是科学界和公众关注的问题。早在果一开始就是科学界和公众关注的问题。早在7070年代初，年代初， 基因重组技术刚开始出现的时候，以美国著名分子生物学基因重组技术刚开始出现的时候，以美国著名分子生物学 家伯格（家伯格（BergBerg）为首的）为首的1111名科学家共同呼吁禁止开展基因名科学家共同呼吁禁止开展基因 工程的研究，并得到了美国国立卫生研究院的赞同工程的研究，并得到了美国国立卫生研究院的赞同。 分子医学的社会、伦理问题分子医学的社会、伦理问题 科学家们对自己的研究工作可能产生的严重后果公开科学家们对自己的研究工作可能产生的严重后果公开 唤起公众的注意，这在科学史上还是第一次，说明科学唤起公众的注意，这在科学史上还是第一次，说明科学 家对遗传物质的操作所取的态度是极其谨慎的。家对遗传物质的操作所取的态度是极其谨慎的。 在那以后，利用基因工程技术在大肠杆茵中生产预定在那以后，利用基因工程技术在大肠杆茵中生产预定 的蛋白质分子被证明是无害可行的，因而在的蛋白质分子被证明是无害可行的，因而在8080年代以来年代以来 得到了迅速的发展，但将基因操作直接应用于人类疾病得到了迅速的发展，但将基因操作直接应用于人类疾病 的治疗则与一般的基因工程不可同日而语。的治疗则与一般的基因工程不可同日而语。 分子医学常用技术分子医学常用技术 基因获取基因获取 基因检测基因检测 基因重组基因重组 基因表达基因表达 基因标记基因标记 基因探测基因探测 基因转移基因转移 基因信息基因信息 获取目标基因常常是基因操作的首要步骤。常获取目标基因常常是基因操作的首要步骤。常 规方法有规方法有PCRPCR法，基因文库或法，基因文库或cDNAcDNA文库法以及化文库法以及化 学合成法。学合成法。应根据具体的研究目的和实验条件选用应根据具体的研究目的和实验条件选用 合适的方法。合适的方法。 化学合成法化学合成法 较短的基因（较短的基因（60-80bp60-80bp） 用途：用途：PCRPCR引物引物 测序引物测序引物 定点突变定点突变 核酸杂交探针核酸杂交探针 基因文库基因文库 限制性限制性 内切酶内切酶 克隆、转化、培养、鉴定克隆、转化、培养、鉴定 基因组基因组DNADNA 基因文库基因文库 引物引物 引物引物 3 5 5 5 PCRPCR技术技术 基因组基因组 引物设计：引物设计： （1) 1) 序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。 （2 2）引物长度以）引物长度以15-40 bp15-40 bp为宜。为宜。 （3 3）碱基尽可能随机分布。）碱基尽可能随机分布。 （4 4）引物内部避免形成二级结构。）引物内部避免形成二级结构。 （5 5）两引物间避免有互补序列。）两引物间避免有互补序列。 （6 6）引物）引物33端为关键碱基；端为关键碱基；55端无严格限制端无严格限制 PCRPCR技术的基本过程技术的基本过程 模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物 BufferBuffer 预变性预变性 模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物 BufferBuffer TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶 循循 环环 仪仪 9494 o o C5C5 9494 55 55 72 72 加样孔 电泳图谱电泳图谱 PCRPCR PT-PCRPT-PCR DNA Marker 对一个基因或一段对一个基因或一段DNADNA片段进行检测鉴定是分片段进行检测鉴定是分 子医学技术中最常用到的手段。包括子医学技术中最常用到的手段。包括电泳检测、序电泳检测、序 列分析、分光光度分析列分析、分光光度分析等方法。等方法。 DNADNA分子的电泳检测分子的电泳检测 电电 泳泳 条条 带带 加样孔 凝胶浓度与凝胶浓度与DNADNA片段大小片段大小 电压、电流与分辨率电压、电流与分辨率 电泳缓冲液、上样缓冲液电泳缓冲液、上样缓冲液 电泳的时间与环境温度电泳的时间与环境温度 凝胶板的制备凝胶板的制备 法国法国VLVL凝胶成像系统凝胶成像系统 核酸定量和纯度分析核酸定量和纯度分析 共轭双键：对共轭双键：对260nm260nm波长紫外光有较强吸收波长紫外光有较强吸收。 消消 光光 系系 数数 波长波长 220 240 260 280 300 220 240 260 280 300 BECKMAN DU 800 BECKMAN DU 800 核酸蛋白检测仪核酸蛋白检测仪 DNADNA序列检测序列检测 基因重组技术作为分子医学中最重要基因重组技术作为分子医学中最重要 、最基本的技术之一，是许多分子医学实、最基本的技术之一，是许多分子医学实 验实施的基础，在基因诊断、治疗和预防验实施的基础，在基因诊断、治疗和预防 中具有举足轻重的意义。中具有举足轻重的意义。 现代基因工程的创始人现代基因工程的创始人PP伯格伯格（美国（美国,1926,1926）在）在19601960年以敏锐的科学预见年以敏锐的科学预见 力提出一个大胆的设想：是否可以创造出一种人工方法，把外界的遗传基因引力提出一个大胆的设想：是否可以创造出一种人工方法，把外界的遗传基因引 入动物体内，以达到改变遗传性状和治疗某些疾病的需要呢？入动物体内，以达到改变遗传性状和治疗某些疾病的需要呢？19721972年，伯格把年，伯格把 两种病毒的两种病毒的DNADNA用同一种限制性内切酶切割后，再用用同一种限制性内切酶切割后，再用DNADNA连接酶把这两种连接酶把这两种DNADNA 分子连接起来，于是产生了一种新的重组分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNADNA分子，首次实现两种不同生物的分子，首次实现两种不同生物的 DNADNA体外连接，获得了第一批重组体外连接，获得了第一批重组DNADNA分子，这标志着基因工程分子，这标志着基因工程技术的诞生。 伯格因此获得了19801980年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖。 1973 1973年，美国斯坦福大学教授年，美国斯坦福大学教授SS科恩科恩和加州大学旧金山分校教授和加州大学旧金山分校教授 HWHW博耶博耶将两个不同的质粒（一个是抗四环素质粒，另一个是抗将两个不同的质粒（一个是抗四环素质粒，另一个是抗 链霉素质粒）拼接在一起，组成嵌合质粒，并将其导入大肠杆菌，链霉素质粒）拼接在一起，组成嵌合质粒，并将其导入大肠杆菌， 当该重组质粒进入大肠杆菌体内后，这些大肠杆菌能抵抗两种药物当该重组质粒进入大肠杆菌体内后，这些大肠杆菌能抵抗两种药物 ，而且这种大肠杆菌的后代都具有双重抗药性。这表明，而且这种大肠杆菌的后代都具有双重抗药性。这表明“ “杂合质粒杂合质粒” ” 在大肠杆菌的细胞分裂时也能自我复制。在大肠杆菌的细胞分裂时也能自我复制。 科恩随后以科恩随后以DNADNA重组技术发明人重组技术发明人的身份向美国专利的身份向美国专利 局申报了世界上第一个基因工程的技术专利。这标志局申报了世界上第一个基因工程的技术专利。这标志 着自然界不同物种间在亿万年中形成的天然屏障被打着自然界不同物种间在亿万年中形成的天然屏障被打 破了，人类可以根据自己的意愿定向地改造生物的遗破了，人类可以根据自己的意愿定向地改造生物的遗 传特性，甚至创造新的生命类型。传特性，甚至创造新的生命类型。 1977 1977年，吉尔伯特（年，吉尔伯特（WGilbertWGilbert）分别将编码）分别将编码胰岛胰岛 素和干扰素素和干扰素的的DNADNA经过体外重新拼接后，导入大肠杆菌经过体外重新拼接后，导入大肠杆菌 中，分别使大肠杆菌合成了胰岛素和干扰素中，分别使大肠杆菌合成了胰岛素和干扰素。 基因工程问世后的短短基因工程问世后的短短3030年间，不仅催生了一个又一年间，不仅催生了一个又一 个基因工程的新成果，也催生了一个源于个基因工程的新成果，也催生了一个源于DNADNA研究的新兴研究的新兴 产业，导致众多的生命科学高技术企业应运而生。到产业，导致众多的生命科学高技术企业应运而生。到20012001 年年初，美国生物技术公司已有年年初，美国生物技术公司已有14001400家，而这一数字还不家，而这一数字还不 包括为数更多的相关技术公司和传统制药公司，包括为数更多的相关技术公司和传统制药公司，20002000年底年底 美国生物技术产业的收入达到美国生物技术产业的收入达到250250亿美元亿美元。可以毫不夸张。可以毫不夸张 地说，基因工程对生物、医药和农业等领域都产生了革命地说，基因工程对生物、医药和农业等领域都产生了革命 性的影响，它对人们生活影响的深度和广度早已超出了人性的影响，它对人们生活影响的深度和广度早已超出了人 们的想象。们的想象。 淡绿、橘黄、浅红、金黄淡绿、橘黄、浅红、金黄用这些天然彩色蚕茧丝无需染用这些天然彩色蚕茧丝无需染 色而织成色彩斑斓的绸缎，兼具华美外观和环保内质色而织成色彩斑斓的绸缎，兼具华美外观和环保内质。通过基因通过基因 重组法选育高产彩色茧蚕品种重组法选育高产彩色茧蚕品种获成功。获成功。 玫瑰的栽培历史可以追溯到玫瑰的栽培历史可以追溯到50005000年前，但通过色素呈现出蓝色的年前，但通过色素呈现出蓝色的 玫瑰却从来没有过玫瑰却从来没有过。从蓝色三叶草中提取制造蓝色色素的基因，然从蓝色三叶草中提取制造蓝色色素的基因，然 后注入到玫瑰中，后注入到玫瑰中，并成功地让翠雀花素单独显色。并成功地让翠雀花素单独显色。 目的基因目的基因基因载体基因载体 重组体重组体 分分 切切 接接 转转 筛筛 总总 体体 技技 术术 路路 线线 分分: : 切切: : 限制性内切酶限制性内切酶 “ “分子手术刀分子手术刀 ” ” 限制性限制性 酶活性酶活性 缓冲液缓冲液 甲基化甲基化 底物性状底物性状 “ “分子剪刀分子剪刀” ”的发现者的发现者 接接: : DNA DNA 连接酶连接酶 “分子针线分子针线” 转转: : 筛筛: : 基因载体基因载体 宿主细胞宿主细胞 克隆位点克隆位点 大肠杆菌大肠杆菌 SSSS蛋白蛋白 重组体重组体 + SSSS基因基因 1 E.coli1 E.coli表达体系表达体系 优势：优势： 一种成熟的基因克隆表达的受体细胞一种成熟的基因克隆表达的受体细胞 繁殖迅速，培养代谢易于控制繁殖迅速，培养代谢易于控制 易于进行遗传操作和高效表达易于进行遗传操作和高效表达 不足之处：不足之处： 1 1）缺乏适当的转录后和翻译后加工机制。）缺乏适当的转录后和翻译后加工机制。 2 2）缺乏表达蛋白质复性系统，表达蛋白无特异性）缺乏表达蛋白质复性系统，表达蛋白无特异性 空间结构。空间结构。 3 3）表达产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解）表达产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解。 2 目的基因高效表达高效表达 三个因素：三个因素： 强化蛋白质的生物合成强化蛋白质的生物合成 抑制蛋白质的降解抑制蛋白质的降解 恢复蛋白质的空间构象恢复蛋白质的空间构象 3 3目的基因表达产物的检测目的基因表达产物的检测 1 1）蛋白质的）蛋白质的PAGEPAGE 对照对照 样品样品 MarkerMarker 2 2）表达蛋白生物学功能检测）表达蛋白生物学功能检测 淀粉酶基因表达淀粉酶基因表达 4 4目的蛋白的分离纯化目的蛋白的分离纯化 分子筛分子筛 亲和柱亲和柱 离子交换离子交换 抗原抗体抗原抗体 目的蛋白目的蛋白 安玛西亚快速蛋白纯化仪（FPLC） 核酸标记：核酸标记： 同位素标记同位素标记 非同位素标记非同位素标记 核酸探针：探针探针是一段人工合成的碱基序列，连是一段人工合成的碱基序列，连 接上一些可检测的物质，根据碱基互补的原理，接上一些可检测的物质，根据碱基互补的原理， 利用探针到基因混合物中识别特定基因利用探针到基因混合物中识别特定基因 核酸杂交：探测基因所依据的最基本的理论就是探测基因所依据的最基本的理论就是 核酸碱基互补原则核酸碱基互补原则，最常用的方法就是核酸分子，最常用的方法就是核酸分子 杂交，它应用一段与目标基因碱基互补的核酸作杂交，它应用一段与目标基因碱基互补的核酸作 为探针去探测待测样品为探针去探测待测样品 DNADNA聚合酶聚合酶 - - 3232P-dNTP P-dNTP DNADNA 缺口平移缺口平移 5-CCCCAA5-CCCCAAOH OHCCCAACCCCAACCCCAA CCCAACCCCAACCCCAAOH OHCCCAA CCCAA-3-3 3-GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTT-53-GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTT-5 DNADNA聚合酶聚合酶 5 35 3聚合酶聚合酶 5 35 3外切酶外切酶 5 5 5 5-CCCCAACCC5-CCCCAACCC 3-GTTGGG 3-GTTGGG 末端标记物末端标记物 - - 3232P-dNTP P-dNTP 5-CCCCAACCC5-CCCCAACCC 3-3-GGGGGGGTTGGGGTTGGG 基因芯片（基因芯片（GenechipGenechip） 基因芯片又称基因芯片又称DNADNA芯片或芯片或DNADNA微阵列。它高度集成成微阵列。它高度集成成 千上万的网格状密集排列的核酸分子（也叫分子探针）。千上万的网格状密集排列的核酸分子（也叫分子探针）。 基因芯片能快速破译人类基因组和检测基因突变，目基因芯片能快速破译人类基因组和检测基因突变，目 前，该技术主要应用于基因表达检测、突变检测、基因组前，该技术主要应用于基因表达检测、突变检测、基因组 多态性分析和基因文库作图以及杂交测序等方面。它的出多态性分析和基因文库作图以及杂交测序等方面。它的出 现给分子生物学、细胞生物学及医学领域带来新的革命，现给分子生物学、细胞生物学及医学领域带来新的革命， 成为后基因时代最重要的基因功能分析技术之一成为后基因时代最重要的基因功能分析技术之一。 应用基因微矩阵芯片研究宫颈癌相关基因表达应用基因微矩阵芯片研究宫颈癌相关基因表达 DNA微点阵已广泛和流行的用于疾病诊断、基因组比较、 以及新型癌症的分类。 转基因生物是指用实验方法导入的外源基因转基因生物是指用实验方法导入的外源基因 在染色体基因组内稳定整和并能遗传给后代的一在染色体基因组内稳定整和并能遗传给后代的一 类动物。自从类动物。自从19821982年年PalmiterPalmiter等首次将大鼠生长激等首次将大鼠生长激 素基因导人小鼠受精卵雄性原核中，获得了个体素基因导人小鼠受精卵雄性原核中，获得了个体 比对照组大一倍的转基因比对照组大一倍的转基因“ “超级小鼠超级小鼠” ”以来，这项以来，这项 高新技术受到各国重视，发展迅速，取得不少突高新技术受到各国重视，发展迅速，取得不少突 破，全世界已申请的工程动物专利达到破，全世界已申请的工程动物专利达到8080多项。多项。 囊性纤维变性是一种遗传囊性纤维变性是一种遗传 病，患者体内会产生粘稠的病，患者体内会产生粘稠的 粘液，阻塞肺部、胰腺和消粘液，阻塞肺部、胰腺和消 化器官的内部通道，大约有化器官的内部通道，大约有 一半的患者活不过一半的患者活不过3131岁。英岁。英 国国PPTPPT公司培育了植入人体公司培育了植入人体 基因的克隆羊，羊奶中含有基因的克隆羊，羊奶中含有 能够治疗囊性纤维变性的人能够治疗囊性纤维变性的人 体蛋白。体蛋白。 维尔莫特所在的研究所曾维尔莫特所在的研究所曾 向德国一家药厂出售一头这向德国一家药厂出售一头这 样的样的转基因羊转基因羊，获得，获得5050万英万英 镑。镑。 “ “克隆克隆” ”和和“ “转基因转基因” ”之间最大的不同是前者纹丝不动地保留了原来之间最大的不同是前者纹丝不动地保留了原来 的遗传性状，而后者则改变了原来的遗传性状。的遗传性状，而后者则改变了原来的遗传性状。“ “克隆克隆” ”是无性繁殖是无性繁殖 ，克隆动物是不经过生殖细胞而直接由体细胞获得的新个体；而，克隆动物是不经过生殖细胞而直接由体细胞获得的新个体；而 转基因动物和普通动物的区别只在于在受精卵或胚胎干细胞中转转基因动物和普通动物的区别只在于在受精卵或胚胎干细胞中转 入了另外的基因。入了另外的基因。 如果能将克隆技术和转基因技术结合起来的话，也许可以在短如果能将克隆技术和转基因技术结合起来的话，也许可以在短 时间内就得到许多一模一样的拥有优良性状的转基因动物。也就时间内就得到许多一模一样的拥有优良性状的转基因动物。也就 是说，转基因动物将不再是单个生产，而是批量生产。这对于制是说，转基因动物将不再是单个生产，而是批量生产。这对于制 药或器官移植等领域来说是一个很有潜力的发展方向药或器官移植等领域来说是一个很有潜力的发展方向 克隆羊“多利多利 ” ” 基因测序基因测序是确定是确定DNADNA双股链上每个独立结构单元或碱基的双股链上每个独立结构单元或碱基的 确切顺序的过程。测序经常被称为确切顺序的过程。测序经常被称为“ “破译破译” ”，因为其结果就像，因为其结果就像 解码一样。解码结果包含数百页和成千上万行解码一样。解码结果包含数百页和成千上万行4 4种字母的序列种字母的序列 。这些字母表示。这些字母表示4 4种不同的碱基，分别用它们的首字母种不同的碱基，分别用它们的首字母A A、T T 、C C、GG表示，其排列顺序中蕴藏着各种各样的遗传信息和生表示，其排列顺序中蕴藏着各种各样的遗传信息和生 命指令。命指令。 生物信息学生物信息学(bioinformation) (bioinformation) 是一门伴随着基因组研是一门伴随着基因组研 究而产生的交叉学科。广义地说，它是从事与基因组研究有究而产生的交叉学科。广义地说，它是从事与基因组研究有 关的生物信息的获取、加工、储存、分配、分析和解释的一关的生物信息的获取、加工、储存、分配、分析和解释的一 门学科。这个定义包含两层意思，即对海量数据的收集、整门学科。这个定义包含两层意思，即对海量数据的收集、整 理以及对这些数据的应用。理以及对这些数据的应用。 基因组，指的是生物体内的所有基因组，指的是生物体内的所有DNADNA，包括它的基，包括它的基 因。人类基因组计划要测定的是人体因。人类基因组计划要测定的是人体2323对染色体中的所对染色体中的所 有有DNADNA的序列，它由的序列，它由31.64731.647亿个碱基对组成，共有亿个碱基对组成，共有3 3万万 至至3.53.5万个基因。换句话说，生命天书是由万个基因。换句话说，生命天书是由3030多亿个字多亿个字 写成的，如果将这写成的，如果将这3030多亿字排版到一张报纸上，那么大多亿字排版到一张报纸上，那么大 约需要约需要2020万页纸才能排完这部巨著。万页纸才能排完这部巨著。 由此可以想见，由此可以想见， 读取这部巨著所要耗费的时间将是如何的惊人。读取这部巨著所要耗费的时间将是如何的惊人。 解读生命的“天书”-人类基因组计划 英国著名化学家桑格。他因英国著名化学家桑格。他因 测定出胰岛素的氨基酸排列测定出胰岛素的氨基酸排列 顺序获顺序获19581958年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖 ，又因发明测定，又因发明测定DNADNA序列的序列的 方法（即桑格法）获方法（即桑格法）获19801980年年 诺贝尔化学奖诺贝尔化学奖 美国分子生物学家美国分子生物学家WW 吉尔伯特因发明出另吉尔伯特因发明出另 一种测定一种测定DNADNA序列的序列的 方法，与桑格分享方法，与桑格分享 19801980年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖 。 美国生物化学 家穆利斯、 1993年因创建 PCR技术获诺 贝尔化学奖。 根据桑格法开发的根据桑格法开发的DNADNA自动定序机使一周（自动定序机使一周（2424小时小时 运转）解读运转）解读100100万甚至几百万个碱基成为可能。它为万甚至几百万个碱基成为可能。它为“ “ 人类基因组计划人类基因组计划” ”立下了汗马功劳立下了汗马功劳 “ “人类基因组计划人类基因组计划” ”的主要任务包括：的主要任务包括： 找出人类找出人类DNADNA上的所有基因（当时估计约上的所有基因（当时估计约1010万个万个 ，后来证实只有，后来证实只有3-3.53-3.5万个），确定万个），确定3030亿个碱基对的亿个碱基对的 排列顺序；排列顺序； 建立相应的数据库，进行数据分析，并分析此计建立相应的数据库，进行数据分析，并分析此计 划可能带来的人种、伦理及社会问题；划可能带来的人种、伦理及社会问题； 对一些动物的遗传组成进行研究，包括大肠杆菌对一些动物的遗传组成进行研究，包括大肠杆菌 ，果蝇和小白鼠等。，果蝇和小白鼠等。 DNADNA双螺旋结构体现着一种与和谐的大自然之美交相辉映的科学之美。双螺旋结构体现着一种与和谐的大自然之美交相辉映的科学之美。 DNADNA是螺旋状的，生命科学的探索之路也是螺旋的。人体自身和大千世界还有是螺旋状的，生命科学的探索之路也是螺旋的。人体自身和大千世界还有 数不清的未解之谜，正等待着人们进行探索。让我们续写和创造永无止境的螺数不清的未解之谜，正等待着人们进行探索。让我们续写和创造永无止境的螺 旋之美。旋之美。 3L*FfDh-tg6NLPAP+2A6vg9Y0lt+QlpFKg+IT9pa91ycT(rRN%5#*)IFB70%yrk!XWyBIuH#YgO&EkUQTH!l*iuTJoeER5$AixwE8v#Pn07*Y89dJT*xN%yQ)CR(wGO785mb&)&sJk4HGOH-yVHDnI4pbb1t0yzR!#&5K(n7Ic9UyCl5e0W(RCZ7sqQ9iToKqeSQVJDa-oF0)TSiG65$Zf-IVeymrq%PvO9Hy5PQvdk4KAP%V1jgC$(3DnN+DNQ0J!&t0tkl82EjyAOqY2(66Kv8qHef)U0(Dc5)yl7$8o$7kVDv1-+QZtyaPD*iQKMzTj3pAYW9l-YDLf$2(A2VxPhXVBl2bh(B$*0t1)GEEe91fzSRaII- iTLOBUj5tHBJ$+Z5vlDSzwbTbJ(kCq+)n5*ueA8uR5RsP2oCk4D28y3b+e#Ti!k9pHrxJjsTL8h!R4Z4odfjSza4FbpK#RIBNPQ68o)*D!ILs*U&XaiViBfv#RKw)WExj4V0RZ8K71btq$WbD124MZWSRsofLNCtFSjmvJE%gnvc*#&4Al3E*JXJd$ljg9zv3ou6!EogHXYWJlBN+!pkQodBIL936O+xrRJcWuXoR$z9itoRhBeoXzeswNtBK+L&mGqAwYRsbb!e%mVbeW3suQR3q7QqmHrfX0XE5)Aw#nCMc2%&NX6Ur1p4AmNQ09KR%(Drf#&KxaE)z#E)7w(*1sv1uUGw$mA$4Z*L)9kqaSbM(Al#65gh7- 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SzYzsaG3ZoXJ7EnQ7T4mX)1ahtnN9p1WrtFDwYuAtz34DDSYxat8GaqJXHLUckvDn6(gB95VezPg80HZV1L&6Fe&S50MM9Pl8cq)8DzWVi0VGnL$RV06hO2pvtZYpG3CvjQf04TxQ-AZM+GNS6$YB9)vhiPt#I0y0bSVpk)FPqQfqPx%tcF%HyqgTYyyYTin5SPPBW!Kc#U65*w0dCD8OFkm$NnoTBm&8oiKb!23QZM%#G*p-Mc6Il5Jk6EtljWYGLZqpBxd-U8qB1HtU#GuRgEv06Wxzt7EnbhPyn2xzIw54P1- h)1P0+cVQcM!yo*9hZ*725GmEOvF!+H8Ar5%goGbM52gn+&Tf%EWpY)rUWcBBZegG+5C2hYz#V(pogp3K