亲和层析技术要点.ppt

L o g o 亲和层析纯化技术要点 6th Group 小组成员:徐鹏，蒋美玲，季成，滕嘉琳， 金爽，任沛 L o g o v生物制药工艺上主要运用的几种色谱技术 分配色谱 吸附色谱 离子交换色谱 亲和色谱 凝胶色谱 6th Group L o g o Affinity Chromatography 亲和层析技术概述1 亲和层析基本过程2 His-tag亲和层析常见问题3 Tips4 6th Group L o g o 亲和层析技术概述 vWhat is Affinity Chromatography? 亲和层析是利用生物体中多数大分子物质具 有与某些相应的分子专一性可逆结合的特性 而建立的分离纯化技术 其专一性是由分子有关作用基团（官能团） 的化学结构与它们的空间排列决定的 亲和层析技术是目前分离纯化药物蛋白等生 物太分子最重要的方法之一 6th Group L o g o Background 生物大分子自身的特殊性和复杂性：热稳定性差 ，对环境的pH值、有机溶剂、某些无机载体和金 属离子很敏感。 因此欲高效分离纯化存在于相当大体积的组织匀 浆或发酵液中的极少量目标产物，同时又混有大 量理化性质相仿的其它生物活性物质时，仅根据 理化性质不同设计分离纯化工艺已远不能满足生 物技术发展的需要。这时就必须从生物亲和作用 力的角度进行研究，而亲和技术正是在此背景下 产生的。 6th Group L o g o 聚苯乙烯载聚苯乙烯载 体连接上抗体连接上抗 原，分离血原，分离血 液中相应的液中相应的 抗体抗体 用淀粉装柱用淀粉装柱 来分离淀粉来分离淀粉 酶酶第一第一 次认识到亲次认识到亲 和层析和层析 琼脂糖载体取代聚苯琼脂糖载体取代聚苯 乙烯载体，使亲和层乙烯载体，使亲和层 析得到高速发展，成析得到高速发展，成 为为“ “第二大类第二大类” ”分离分离 纯化手段，应用广泛纯化手段，应用广泛 ，亲和对众多。，亲和对众多。 亲和层析发展史 191019101955195519671967 6th Group L o g o 基本概念 v亲和作用：生物物质具有识别特定物质并 与该物质分子结合的能力，且可以区分结 构与性质相似的其他分子，这种特异性的 相互作用称为亲和作用。 v配基:亲和层析中能被某一生物大分子识别 和可逆结合的生物专一性物质。 v配体：与配基是相对的概念。 6th Group L o g o v配基应具备的特性： v1.对于欲纯化的生物物质应具有专一亲和性 v2.必须具备能被修饰的功能基团 常见配基-配体物质对：酶-底物 酶-抑制物 激素-受体 抗原-抗体 金属离子-氨基酸残基 cDNAcDNA- -对应的基因片段，等对应的基因片段，等 6th Group L o g o 亲和层析的特点 亲和层析 通用性差，洗脱不缓和通用性差，洗脱不缓和 高度特异性高度特异性 高效能 操作简便 快速 亲和力缓和 应用广泛 6th Group L o g o 亲和层析基本过程 配基固定化 (Immobilise) 基质Matrix(载体):亲和层析中与配基共价结 合,使其固相化的物质。 6th Group L o g o 吸附 (Adsorption) 洗脱 (Elution ) 6th Group L o g o 洗脱 elution 洗涤 wash 上样 Sample applic. 平衡 equilibration 6th Group L o g o 6th Group L o g o 洗脱方法 非特异性洗脱:改变缓冲液的pH、离子强度 、介电常数或温度使物质构象改变，浓缩、洗 脱后立即中和稀释或透析，使蛋白质迅速恢复 到天然结构 特异性洗脱：再次利用生物学特异性只洗脱 和配基专一作用的蛋白质，不洗脱由于非专一 吸附上去的杂蛋白 6th Group L o g o 6th Group L o g o 亲和层析的基本类型 v生物亲和层析 v免疫亲和层析 v金属离子螯合亲和层析 v染料亲和层析 v拟生物亲和层析 6th Group L o g o 金属离子螯合亲和层析 v金属离子螯合亲和层析是利用金属离子的 络合或形成螯合物的能力吸附蛋白质的分 离系统。 Ni Sepharose 6 Fast Flow v含His-tag的rhEGF： His的咪唑基可以与 Ni2+特异性结合。 6th Group L o g o 6th Group L o g o 常见问题 1 1 纯化的组分中没有 His标签的蛋白? 2 2 3 3 样品黏度太大？ 层析柱堵塞？ 6th Group L o g o Tips 一些从实验手册里总结出来的Tips v1. 避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如 ：NH4+，甘氨酸，精氨酸，Tris，等等； v2. 各种缓冲液中不能有强螯合剂，如EDTA， EGTA，等等； v3. 各种缓冲液里不能有高浓度的强还原，比如 DTT，防止二价Ni被还原； v4. 不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流 失； v5. 在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂，比 如0.1-1mM的PMSF，防止目的蛋白被降解； 6th Group L o g o v6. 缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏 水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达 50%（v/v） v7. 应避免含碳酸氢钠，柠檬酸等物质； v8. 缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间； v9. 可加入变性剂促溶，盐酸胍（最高可6M），尿 素（最高可8M） v10.可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween， NP40等，最高2%，可以减少背景蛋白污染和去 除核酸污染； 6th Group L o g o Click to edit company slogan . 6th Group L o g o 一、His标签蛋白没有结合上，都流穿了 v可能原因1：超声的功率不对(太大，蛋白炭化， 太小，蛋白没有释放) 策略：改变超声功率，并在超声前加入溶菌酶 v可能原因2：样品或者是结合缓冲液不正确 策略：检测pH 及样品和结合缓冲液的组成份。确 保在溶液 中鳌合剂或强还原剂的浓度及咪唑的浓 度不是太高。 6th Group L o g o 一、His标签蛋白没有结合上，都流穿了 v可能原因3：组氨酸的标签没有完全的暴露 策略：在变性条件下(用48 M 脲，或46 M盐 酸胍)进行纯化。 v可能原因4：His标签丢失 策略1：WB或者anti-his的抗体检查His是否表达 ，上游构建，改变his-tag的位置(C-terminal or N- terminal)，必要时增加his个数(常用6-10个)。 策略2：孵育的时间不够，降低流速和增加孵育的 时间。 策略3：改变螯合的金属离子，寻找到最佳的结合 金属离子。 6th Group L o g o 二、His标签蛋白与Ni2+结合了，没有被洗脱下来 v 可能原因：洗脱条件太温和（组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上， 结合力较强） 策略：用增加咪唑的梯度洗脱或降低pH 来找出最佳的洗脱条件。 v 可能原因：蛋白已沉淀在柱上 策略：减少上样量，或使用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以降低蛋 白的浓度。试用去污剂或改变NaCl 的浓度，或在变性条件(去折叠)下 洗脱(用48 M脲，或46 M 盐酸胍)。 v 可能原因：非特异性疏水或其他相互反应 策略：加非离子去污剂到洗脱缓冲液（如，2