CR技术及其应用.ppt

PCR技术及其应用 PCR的定义： PCR（polymerase chain reaction) ： 聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增 技术。 n聚合酶链式反应于1983年由美国科学家 K.Mullis建立，荣获1993年度诺贝尔化学奖， 为生命科学领域的研究开创了崭新时代。 PCRPCR技术原理技术原理 5 Primer 1 5 Primer 2 Cycle 2 Cycle 1 5 5 5 5 5 5 Template DNA 5 5 5 5 5 5 5 5 一、基本工作原理 目 录 Cycle 3 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。 目 录 Target Amplification No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target 12 24 38 416 532 664 201,048,576 301,073,741,824 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon n模板DNA n 特异性引物 n耐热DNA聚合酶 n dNTPs n Mg2+ PCR体系基本组成成分 PCR的基本反应步骤 变性 95C 延伸 72C 退火 Tm-5C PCR仪 PCR反应 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 实验仪器 电泳仪 琼脂糖凝胶电泳槽琼脂糖凝胶电泳槽 电泳技术 （）鉴定DNA分子量(3)胶回收纯化DNA low- melt agarose 实验结果 PCR结果。1、对照(无模板)；26、 PCR产物（5ul样品） 凝胶成像系统凝胶成像系统 PCRPCR的类型的类型 巢式PCR 原位PCR 多重多重PCR PCR 定量定量PCRPCR 不对称PCR 差异显示差异显示PCRPCR 共享引物PCR 重组PCR 锚定锚定PCR (PCR (十一十一)RT-PCR)RT-PCR 彩色PCR ( (十十二二)RAPD)RAPD - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 锚定锚定PCRPCR： 使用一条锚定引物就一条特异性引物扩增已知一端使用一条锚定引物就一条特异性引物扩增已知一端 序列的目的序列的目的DNADNA。 增效PCR（booster PCR） 当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到两个 问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增， 消耗了引物和酶，而特异扩增片段产量降低。对 于这种情况，可设置二步PCR，先用较低浓度的引 物进行初级PCR，此时由于引物少，形成引物二聚 体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，只 是由于引物少产量不高。约经1520个循环后补 充产物量，以初级PCR产物为模板进行扩增，靶序 列的产量将相应增加。 n在同一PCR体系中加入数对PCR引物，如果 这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的 区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增 多个DNA片段。 n多重PCR常用来检测同一基因的多个外显子 的缺失。 多重多重PCRPCR 巢式巢式PCRPCR：利用两套利用两套PCRPCR引物对引物对进行进行两轮两轮PCRPCR扩增反扩增反 应组成，在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产应组成，在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产 物，此产物在在内引物的存在下进行第二轮扩增。物，此产物在在内引物的存在下进行第二轮扩增。 差别显示：差别显示：是根据绝大多数真核细胞是根据绝大多数真核细胞 mRNA3mRNA3端具有的多聚腺苷酸尾（端具有的多聚腺苷酸尾（polyApolyA）结构，因结构，因 此可用含此可用含oligooligo（dTdT）的寡聚核苷酸为引物将不同的的寡聚核苷酸为引物将不同的 mRNAmRNA反转录成反转录成cDNAcDNA。 不对称不对称PCRPCR 目的：扩增产生特异长度的单链目的：扩增产生特异长度的单链DNADNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限 制性引物和非限制性引物制性引物和非限制性引物, ,其最佳比例一般是其最佳比例一般是 0.010.5M,0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针制备杂交探针 基因组基因组DNADNA结构功能的研究结构功能的研究 高浓度引物高浓度引物 低浓度引物低浓度引物 原位PCR技术 原位PCR Hasse等于1990年建立。 是指在组织细胞里进行PCR反应，它结合 了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特 异敏感的PCR技术的优点。 原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞 ，又能标出靶序列在细胞内的位置，分子 水平和细胞水平研究并重。 原位PCR的实验过程： 实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、 脱落细胞、血细胞等。其基本方法为多聚甲醛固 定组织或细胞，蛋白酶消化处理组织；在组织细 胞玻片上滴加PCR反应液进行扩增，覆盖并加液 体石蜡后，在原位PCR仪上进行PCR循环扩增， PCR扩增结束后用标记的探针进行原位杂交，最 后显微镜观察结果。 16块载玻片及24个0.2ml管的样品block 反转录PCR技术 基因基因 mRNAmRNA 蛋白质多肽链蛋白质多肽链 逆转录酶 聚合酶 mRNA cDNA 杂化双链 PCR扩增 常规PCR方法的局限性分析： 无法对起始模板准确定量,只能对终产物进 行分析 必须在扩增后用电泳方法分析,费时费力而 且EB有毒 无法对扩增反应实时检测 PCR Phases Log DNALog DNA Cycle #Cycle # GeometricGeometric LinearLinear PlateauPlateau y = x(1+e)y = x(1+e) n n Traditional PCR detection y=x 2n 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR （real-time PCRreal-time PCR） 非特异性的嵌入荧光染料 （Non-specific DNA binding dyes） SYBR Green I SYBR Gold Ethidium Bromide Extension 53 53 53 53 Extension Continued Apply Excitation Wavelength 53 53 5 5 Taq Taq 3 53 Taq Taq 5 5 Repeat DNA binding dyes BDBD BDBDBD BDBDBD BD BD ll l l l 实时PCR技术原理 目 录 非特异性的嵌入荧光染料评价 n优点：与特异性的荧光探针相比价格便宜 只需要设计PCR引物 缺点：由于它和模板的结合是非特异性 的，它可以和所有的双链DNA包括引 物和非特异性扩增产物结合，不能真 实反映目 的基因的扩增情况。 TaqMan 探针 评价 n优点： 荧光信号强 与其它探针相比设计简单 可用于多通道检测 可用于SNP的检测 n缺点：比DNA结合染料价格高 Ct value and Real-Time Quantitative PCR Theory CtCt值值 （Threshold Threshold CycleCycle） PCR扩增过 程中，扩增产物 荧光信号超过基 线值（进入指数 增长期）时的循 环数。 模板起始浓度越高，Ct值越小 Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系 Ct值与模板起始浓度的关系 如果模板浓度增加1倍，Ct值就提前1个循环到达 如果模板浓度减少1倍，Ct值就滞后1个循环到达 绝对定量可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线 ，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标 代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值， 即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数 。 “Real-Time PCR” is “sequence detection” in a closed-tube cap PCR vessel thermal block sample lens 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 0510152025303540 PCR cycle number Baseline region Threshold CT No Template control Sample Normalised reporter fluorescence (Rn) Geometric Phase PCR Efficiency1 CT: Threshold cycle The calculated fractional cycle number at which the fluorescence passes the fixed threshold 实时荧光定量 PCR技术的应用 n1. DNA 或 RNA 的绝对定量分析 。包括 病原微生物或 病毒含量的检测 , 转基因动植物转基因拷贝数的检测， RNAi 基因失活率的检测等。 n2. 基因表达差异分析。例如比较 经过不同处理样本之间 特定基因的表达差异 ( 如药物处理、物理处理、化学处理 等 ) ，特定基因在不同时相的表达差异以及 cDNA 芯片 或差显结果的确证 n3. 基因分型。例如 SNP 检测，甲基化检测等。 PCR技术应用 研究 基因克隆，DNA测序，分析突变 ( 制备杂交探针制备杂交探针) 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 诊断 遗传疾病 肿瘤 感染性疾病，传染性流行病 判断个体疾病易感性 器官移植组织配型 法医学中个体识别、亲子鉴定, 犯罪现场标本分析 PCR技术的主要用途 1、目的基因的克隆： PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基 因片段提供了简便快速的方法。 2、基因的体外突变： 可以随意设计引物在体外对目的基因片段 进行嵌和、缺失、点突变等改造。 3、DNA序列测定： PCR技术的引入使DNA测序工作大大简化， 也提高了测序的速度。 4、基因突变分析： 利用PCR与一些技术的结合可以大大提高 基因突变检测的敏感性。 5、DNA和RNA的微量分析： PCR技术高度敏感，对模板的含量 要求很低，是DNA和NA微量分析的最好方 法。 诊断 肿瘤 感染性疾病，传染性流行病 判断个体疾病易感性 器官移植组织配型 法医学中个体识别、亲子鉴定, 犯罪现场标本分析 大肠杆菌大肠杆菌 胰岛素胰岛素 重组体重组体 + 胰岛素胰岛素基因基因 基因工程产品基因工程产品 Mst酶切位点(GCTNAGG) 53 正常基因 53 突变基因 1.15kb 1.35kb 镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 + 0.2kb 1.15kb 1.35kb 正常人突变携带着患者 镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分