医学]ATP生物荧光肿瘤体外药敏检测技术ATP-TCA的建立.ppt

ATPATP生物荧光肿瘤体外药敏检测生物荧光肿瘤体外药敏检测 技术技术( (ATP-TCA)ATP-TCA)的建立及其的建立及其 临床应用研究临床应用研究 硕士研究生：傅军 导师：张伟 研究员 答辩提纲答辩提纲 l第一部分：ATP生物荧光肿瘤体外药敏检测技术概述 l第二部分：ATP生物荧光肿瘤体外药敏检测技术及质量 l 标准的建立 l第三部分：ATP-TCA技术的临床应用研究 第一部分第一部分 ATPATP生物荧光肿瘤体外药敏检测生物荧光肿瘤体外药敏检测 技术概述技术概述 研究背景 l 化学治疗是肿瘤的三大治疗手段之一。近30年来，虽 然某些恶性肿瘤的化学治疗有明显改善，但多数肿瘤，特 别是实体瘤疗效仍不理想。这与肿瘤存在个体差异性，以 及多重耐药性等因素有关。 l 因此如何选择有效药物，进行有的放矢的治疗早已成 为化疗界所关注的问题。 1. 主要的药敏检测方法及其存在的问题 药敏检测方法存在问题 集落形成法（ HTCA） 标本可评价率低，仅有4070。 实验周期长，需要2周以上 测试药物种类和数量有限 操作繁琐，难以标准化 阳性预测值较低，仅有4060 四唑蓝比色法 (MTT) 敏感性较差，最低仅能检测500个细胞 量程较小，有效量程在2.0以内 细胞毒性差异染 色法 (DiSC) 可适用标本类型不广，目前仅用于血液肿瘤 人为判断因素较大，难以推广 标本可评价率不高，仅有7080 阳性预测值较低，仅有7080 胸腺嘧啶核苷 掺入法 (3H- TdR) 实验人员接触放射，不利于健康 标本可评价率不高，仅有7080 测试结果仅能反映少量处于增殖相的肿瘤细胞 对某些药物的测试结果存在假阴性 理想的药敏检测方法应该 具备的条件 1. 操作简便，可以标准化，便于推广 2. 标本可评价率高 3. 检测敏感、可靠、客观 4. 具备产业化条件 2. ATP2. ATP生物荧光药敏检测技术的优点生物荧光药敏检测技术的优点: : 敏感性好可检测最少10个细胞。而其他技术则一般需要500个细胞以上 可评价率高标本可评价率在90%以上 快速检测完成ATP检测仅需30分钟，而其它方法需14小时的孵育时间 量程宽 检测线性范围为10100000个细胞/孔（96孔培养板） 精密度好变异系数（CV）小于10%，在国家标准（10%）的范围内 结果准确整体预测值为86% 检测效率高同时动态检测评估化疗药物6个剂量下对肿瘤的杀伤作用 高通量检测适合96、384、1536孔板检测分析 自动化程度高实验数据计算机软件自动分析，分析结果直观可靠 稳定性好 具备产业化条件 3. ATP-TCA3. ATP-TCA技术原理：技术原理： 在有氧条件下, 荧光酶（luciferase）可以催化荧光素（ luciferin）释放出荧光（波长为562nm），同时ATP转 变成AMP。所释放的荧光强度与胞内ATP含量呈正相关。 细胞死亡后，胞内ATP迅速水解，而活细胞的ATP含量基 本恒定。因此所测得的荧光强度反映了活细胞的数量。 比较药物系列浓度对培养细胞的不同抑制率，参照相应 判断指标，从而可以评估该化疗药物对肿瘤细胞的杀伤 效果。 ATP + Luciferin + O2 AMP + 2Pi + Photons +Oxylaluciferin Luciferase 荧光强度与活细胞数量的关系 4.技术流程流程 Tumor Single Cell suspension Mechanical and enzymatical dissociation Incubation for 5-7 days Addition of drugs/medium ATP- Luminescence ATP extraction and stabilization Software Evaluation Construction of dose-response plots 5.适用肿瘤类型 6.适用肿瘤标本类型 神经母细胞瘤 黑色素瘤 甲状腺癌 结直肠癌 乳腺癌 卵巢癌 胰腺癌 肉瘤 胃癌 肺癌 实体瘤标本 胸腹水 活检淋巴结标本 7. 国内外研究历史回顾 1. 1. 19821982年，年，MoyerMoyer等首先提出内源性等首先提出内源性ATPATP的含量可以反映细胞活性的含量可以反映细胞活性; ;随随 后后KangasKangas等相继证实生物荧光技术是一种敏感、可靠的确定各种等相继证实生物荧光技术是一种敏感、可靠的确定各种 细胞活性的检测方法。细胞活性的检测方法。 2. 2. 自自19881988年，年，SevinSevin首先将此方法用于新鲜肿瘤组织的药敏检测，在首先将此方法用于新鲜肿瘤组织的药敏检测，在 欧洲和美国已经进行了大量的临床应用研究。欧洲和美国已经进行了大量的临床应用研究。 3. 3. 19981998年，年，KurbacherKurbacher等人报道了等人报道了ATP-TCAATP-TCA辅助化疗与传统化疗比较辅助化疗与传统化疗比较 的临床的临床期试验结果，试验结果表明，期试验结果，试验结果表明，ATPATP- -TCATCA指导的化疗治疗复指导的化疗治疗复 发性卵巢癌较传统化疗模式更能提高临床疗效，延长病人总生存发性卵巢癌较传统化疗模式更能提高临床疗效，延长病人总生存 期和无进展生存期。期和无进展生存期。 4. 4. NIHNIH的的GOG GOG (Gynecologic (Gynecologic Oncology Oncology Group)Group)项目组认为项目组认为ATP-TCAATP-TCA是是 最有发展前途的一种药敏试验方法，已纳入重点科研项目最有发展前途的一种药敏试验方法，已纳入重点科研项目(1998)(1998) 。 5. 5. 至今该技术的临床应用相关文献已有至今该技术的临床应用相关文献已有200200余篇。余篇。 6. 6. 国内尚无该技术产业化的报道。国内尚无该技术产业化的报道。 时间国家研究人肿瘤类型结论 1988年美国Sevin BU, Peng ZL 卵巢癌阳性预测值：92%，阴性预测值：90% 整体预测精确值：86% 1990年日本Jinushi K, Hirabayashi 胃癌预测精确性为88.9% 1993年瑞士Koechli OR, Avner BP 乳腺癌阳性预测值：90%，阴性预测值：86% 整体预测精确值：85% 1995年美、英、德 三国协作 Andreotti PE Cree IA 顺铂耐受卵 巢癌 整体预测精确值：92% 1996年英国Cree IA, Kurbacher CM III/ IV期 乳腺癌 整体预测精确值：76 1997年日本Kawamura H, Ikeda K 胃肠道肿瘤阳性预测值：64%，阴性预测值：100% 整体预测精确值：84% 2000年美国Konecny G, Crohns C FIGO 期 卵巢癌 阳性预测值：66%，阴性预测值：89% 敏感性：95%，特异性：44% 2000年德国Mollgard L, Tidefelt U 急性非淋巴 细胞白血病 阳性预测值：86%，阴性预测值：100% 2001年美国OMeara AT, Sevin BU 上皮性卵巢 癌 阳性预测值：83%，阴性预测值：56.5% ATP-TCA技术的临床相关性研究结果 ATP-TCA与其它药敏检测方法的相关性 ATP-TCA技术与DiSC法的相关性ATP-TCA技术与MTT法的相关性 8.目前先进国家对该技术的评价 1.1. 19981998年年德国德国DCSDCS公司将该技术产业化，并获得国际公司将该技术产业化，并获得国际ISOISO质量评质量评 估体系认证，估体系认证，在欧洲和北美市场获得准入在欧洲和北美市场获得准入。 2.20012.2001年，美国全国医疗保险协会年，美国全国医疗保险协会( (Health Health Maintenance Maintenance Organization)Organization)认为，该技术是一项精确和可靠的并能指导医认为，该技术是一项精确和可靠的并能指导医 生选择用药的生选择用药的先进技术先进技术，建议在全美进行医疗保险赔付。目，建议在全美进行医疗保险赔付。目 前在加州等前在加州等6 6个州已获医疗保险赔付个州已获医疗保险赔付。 3. 3. 20032003年日本厚生省和保险联合会也认为，该技术是一项年日本厚生省和保险联合会也认为，该技术是一项先进的先进的 临床医学项目临床医学项目，该技术指导的肿瘤化疗较传统的化疗方案更，该技术指导的肿瘤化疗较传统的化疗方案更 能明显提高胃肠道肿瘤的治愈率，建议该项技术在全国范围能明显提高胃肠道肿瘤的治愈率，建议该项技术在全国范围 内获得医疗保险赔付。内获得医疗保险赔付。 因此，ATP-TCA技术是目前最先进的体外药敏技术，该技术敏感，可靠，具有极大的 临床应用价值 第二部分第二部分 ATP-TCAATP-TCA药敏检测技术及药敏检测技术及 质量标准的建立质量标准的建立 lATP-TCA技术的核心试剂 l 1. 荧光酶试剂 l 热稳定性和发光效率均好的重组酶试剂保证检测的敏感性和可 l 靠性，满足临床实际工作的需要 l 2. 培养基 l 肿瘤细胞选择性培养基支持肿瘤细胞生长增殖，促进正常细胞 死亡，从而保证药敏检测的肿瘤细胞特异性 下面我将就这两个核心试剂的研发汇报我所做的一些工作 荧光酶基因克隆、点突变、表达及纯化(2001,42001,10) 肿瘤细胞选择性培养基配方筛选及优化(2001,52001,12) 检测技术核心试剂的质量标准的建立(2002,12002,3) 工作内容及进展 自荧火虫体内 发光腺体提取 荧光酶mRNA 逆转录为cDNA,PCR扩 增，克隆构建重组质 粒PET22b-luc 设计点突变引物，定 点突变荧光酶第245和 215位氨基酸序列 将含点突变PET22b-luc 导入原核高效表达系统 Ecoli-BL21 筛选高表达株 ，高效稳定表 达重组荧光酶 通过蛋白工作站 ，纯化生产重组 荧光酶 制备冻干 荧光酶制剂 重组荧光酶研发路线 荧光酶基因的克隆和鉴定 PCR产物电泳图重组质粒PET22b-luc鉴定图 野生型野生型荧光酶基因编码序列荧光酶基因编码序列(1653(1653bp)bp) M215：GC AG AlaLeu M245：C G HisGln atggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatcctctagaggatggaaccgctggagagcaactgcataa ggctatgaagagatacgccctggttcctggaacaattgcttttacagatgcacatatcgaggtgaacatcacgtacgcggaat acttcgaaatgtccgttcggttggcagaagctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgtatgcagtgaa aactctcttcaattctttatgccggtgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacg tgaattgctcaacagtatgaacatttcgcagcctaccgtagtgtttgtttccaaaaaggggttgcaaaaaattttgaacgtgcaa aaaaaattaccaataatccagaaaattattatcatggattctaaaacggattaccagggatttcagtcgatgtacacgttcgtc acatctcatctacctcccggttttaatgaatacgattttgtaccagagtcctttgatcgtgacaaaacaattgcactgataatgaa ttcctctggatctactgggttacctaagggtgtggcccttccgcatagaactgc*ctgcgtcagattctcgcatgccagagatcc tatttttggcaatcaaatcattccggatactgcgattttaagtgttgttccattccatcac*ggttttggaatgtttactacactcgg atatttgatatgtggatttcgagtcgtcttaatgtatagatttgaagaagagctgtttttacgatcccttcaggattacaaaattca aagtgcgttgctagtaccaaccctattttcattcttcgccaaaagcactctgattgacaaatacgatttatctaatttacacgaaat tgcttctgggggcgcacctctttcgaaagaagtcggggaagcggttgcaaaacgcttccatcttccagggatacgacaaggat atgggctcactgagactacatcagctattctgattacacccgagggggatgataaaccgggcgcggtcggtaaagttgttcca ttttttgaagcgaaggttgtggatctggataccgggaaaacgctgggcgttaatcagagaggcgaattatgtgtcagaggac ctatgattatgtccggttatgtaaacaatccggaagcgaccaacgccttgattgacaaggatggatggctacattctggagac atagcttactgggacgaagacgaacacttcttcatagttgaccgcttgaagtctttaattaaatacaaaggatatcaggtggcc cccgctgaattggaatcgatattgttacaacaccccaacatcttcgacgcgggcgtggcaggtcttcccgacgatgacgccgg tgaacttcccgccgccgttgttgttttggagcacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgtggattacgtcgccagtcaa gtaacaaccgcgaaaaagttgcgcggaggagttgtgtttgtggacgaagtaccgaaaggtcttaccggaaaactcgacgca agaaaaatcagagagatcctcataaaggccaagaagggcggaaagtccaaattgtaa 荧光酶基因突变位点测序图荧光酶基因突变位点测序图 G C ,导致第245位氨 基酸置换(HisGln) 测序单位：上海生工 GC AG,导致第215位氨 基酸置换(AlaLeu) 荧光酶表达电泳图 纯化后电泳图 荧光酶蛋白质电泳图 图1：野生型和突变型荧光酶热稳定性比较 野生型和突变型荧光酶活性比较 图2：野生型和突变型荧光酶发光效率及线 性关系比较 l重组荧光酶制剂稳定性研究 放置 温度 活性半衰期 液体保存冻干品 -2080天360天 420小时180天 253.8小时21天 370.8小时3天 因此，我们将 热稳定性和发 光效率均好的 M245突变荧光 酶冻干制剂作 为药敏检测用 酶制剂 *重组荧光酶为M245突变型荧光酶 肿瘤细胞选择性培养基研究肿瘤细胞选择性培养基研究 选择性培养基生长支持度及选择性研究 肿瘤细胞系生长曲线 正常、良性卵巢及肿瘤组织培养生长曲线 新鲜瘤组织体外培养效果图 Continued 卵巢癌原代培养前后HE及免疫组 化染色 PAN-KERATIN染色 正常卵巢上皮细胞及成纤维细胞 培养结果 正常上皮细胞培养抑制效果图成纤维细胞培养抑制效果图 培养前后细胞组成变化 培养前细胞组成 6天培养后细胞组成 淋巴 上皮 成纤维 肿瘤 淋巴 上皮 成纤维 肿瘤 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 40-50% 10-25% 5-10% 10-20% 75% 选择性培养基的研究结果表明该培养基具有良好的 选择性，适合肿瘤体外药敏检测的需要 质量标准质量标准 1、培养基对肿瘤细胞生长支持程度 以MCF-7细胞系作为标准细胞系，按2000个细胞/孔接种浓度接种至96孔培 养板中，培养七天后，要求测定的RLU值400000。 2、ATP标准曲线 将ATP标准品配成250ng/ml，倍比(3)稀释7次，做出ATP浓度与RLU（扣 除本底吸收值）的标准曲线，要求：r0.995，最小ATP浓度（0.11ng/ml）的 RLU400。 3、精密度 选MCF-7细胞系低、中、高（500、10000、40000个）数目的细胞，分别 测定十组RLU值，要求： CV440RLU，同时本底值100%PPC 轻度敏感(MS)：IC5025%及IC9025%及IC90100%PPC IC90:抑制90%肿瘤细胞生长的血浆峰值浓度百分比 IC50:抑制半数肿瘤细胞生长的血浆峰值浓度百分比 PPC:一定临床用药剂量对应的血浆峰值浓度 临床相关性研究病人资料临床相关性研究病人资料 表1：卵巢癌体外药敏检测与临床疗效的比较 临床相关性研究初步结果 例数 体外检测 体外检测 敏感 (SS+IS) 耐药(WS+R) 共计 体内敏感（ CR+PR） 体内耐药 （SD+PD ） 18 2 20 1 11 12 共计 19 13 32 *34例卵巢癌中可评价标本为32例，标本可评价率为94.1% 表2：卵巢癌体外药敏检测真实性评价 阳性预 测值 阴性预 测值 灵敏度特异性 90.6% 94.7% 84.6% 90% 91.7% 整体预 测值 ATP-TCAATP-TCA药敏检测的临床应用药敏检测的临床应用 1. 设计个体化治疗方案 2. 研究新的联合化疗方案 3. 化疗药物新适应症研究 一例经多重化疗复发的睾丸癌病人药敏检测结果一例经多重化疗复发的睾丸癌病人药敏检测结果 1. 设计个体化治疗方案 检测结果分析检测结果分析 药物名称IC50（PPC%）杀伤作用评估 BLM+DDP+VCR12.69%部分敏感药物 BLM+DDP+5-FU18.59%轻度敏感药物 BLM+CBP +VP1614.79%部分敏感药物 VP16+CBP28.16%轻度敏感药物 THP+DDP+5-FU14.79%部分敏感药物 VP16+DDP+VCR6.32%较敏感药物 IFO+VP16+ADM25.5%轻度敏感药物 CTX+ADM +CBP32.4%耐药药物 NVB+EPI0.76%强敏感药物 治疗效果治疗效果 治疗前 该患者经多重化疗方案复发，颈侧、右锁骨下、胸壁、纵隔淋巴结广泛转移 ，气管、食管压迫移位并伴有吞咽困难。胸水活检发现癌细胞，淋巴结病理活 检证实为绒毛膜上皮癌，HCG激素水平为600u/ml。 治疗后（NVB+EPI方案一个半周期以后） 胸水消失，颈侧、右锁骨下、胸壁、纵隔淋巴结病灶缓解或消失，可以进食 ，HCG激素水平降至60u/ml。 因此ATP-TCA技术对于开展肿瘤患者的个体化治疗极具指导意义 2. 2. 卵巢癌新的联合用药方案研究卵巢癌新的联合用药方案研究 肿瘤细胞对化疗药物的反应肿瘤细胞对化疗药物的反应 强敏感强敏感SS SS 中度敏感中度敏感MS MS 轻度敏感轻度敏感LS LS 耐药耐药 R R 例例 数数 32 6 14 8 432 6 14 8 4 体外有效率体外有效率 ( (SS+MS)/n = (6+14)/32= 62.5%SS+MS)/n = (6+14)/32= 62.5% 1.1.健择与顺铂的联合方案健择与顺铂的联合方案 2.2.健择与表阿霉素的联合方案健择与表阿霉素的联合方案 肿瘤细胞对化疗药物的反应肿瘤细胞对化疗药物的反应 强敏感强敏感SS SS 中度敏感中度敏感MS MS 轻度敏感轻度敏感LS LS 耐药耐药 R R 例例 数数 10 2 3 3 2 10 2 3 3 2 体外有效率体外有效率 ( (SS+MS)/n = (2+3)/10= 50%SS+MS)/n = (2+3)/10= 50% 羟基喜树碱羟基喜树碱 ( (Hydrocamptocin)Hydrocamptocin) 原用途：消化道和泌尿系肿瘤原用途：消化道和泌尿系肿瘤 例数例数 强敏感强敏感SS SS 中度敏感中度敏感MS MS 轻度敏感轻度敏感LS LS 耐药耐药 R R 32 4 5 13 10 32 4 5 13 10 有效率有效率 ( (SS+MS)/n = (4+5)/32 = 28.1%SS+MS)/n = (4+5)/32 = 28.1% 肿瘤细胞对化疗药物的反应肿瘤细胞对化疗药物的反应 卵巢癌原代培养药敏测试结果卵巢癌原代培养药敏测试结果 3. 3. 化疗药物新适应症研究化疗药物新适应症研究 长春瑞宾长春瑞宾( (Vinorelbine, Navelbine)Vinorelbine, Navelbine) 原用途：非小细胞肺癌、转移性乳腺癌原用途：非小细胞肺癌、转移性乳腺癌 例数例数 强敏感强敏感SS SS 中度敏感中度敏感MS MS 轻度敏感轻度敏感LS LS 耐药耐药 R R 肿瘤细胞对化疗药物的反应肿瘤细胞对化疗药物的反应 体外有效率体外有效率 ( (SS+MS)/n = (2+5)/32 = 21.9%SS+MS)/n = (2+5)/32 = 21.9% 卵巢癌原代培养药敏测试结果：卵巢癌原代培养药敏测试结果： 32 2 5 9 16 32 2 5 9 16 因此ATP-TCA技术的建立为肿瘤新化疗方案的研究和临床应用建 立了重要技术平台 讨论讨论 ATP-TCA检测技术是一种先进的药敏检测技术，其具有相 关性好（r=0.9981）；量程宽，跨越4个数量级（10-80000个细 胞）；检测敏感程度高（最小检测10个细胞）的优点。 34例卵巢癌体外药敏检测结果表明，ATP-TCA技术可反映不 同病人对药物的敏感性的个体差别，标本可评价率高，其结果 与临床疗效及相关临床资料有较好的吻合性：整体预测值90.6% ，阳性预测值94.7%，阴性预测值84.6%，敏感性90%，特异性 91.7%。 同时，该技术对抗肿瘤药物筛选和应用、临床药物新适应症 研究、化疗方案筛选和评估以及推广个体化治疗具有实际指导 意义。 本研究为该技术的初步临床应用研究，为了进一步证实其临 床应用价值，大样本的病例药敏研究是必要的。 研究总结研究总结 1. 1. 通过基因工程技术克隆、点突变、表达和纯化出具有通过基因工程技术克隆、点突变、表达和纯化出具有 较高热稳较高热稳 定性和发光效率的重组荧光酶制剂。定性和发光效率的重组荧光酶制剂。 2. 2. 筛选出适用于体外药敏检测的肿瘤细胞选择性培养基筛选出适用于体外药敏检测的肿瘤细胞选择性培养基 ，填补了国内在该领域的空白。，填补了国内在该领域的空白。 3. 3. 建立了建立了ATP-TCAATP-TCA技术核心试剂的质量控制标准，为技术核心试剂的质量控制标准，为 该技术的产业化奠定了基础。该技术的产业化奠定了基础。 4. 4. 以卵巢癌为模型开展肿瘤体外药敏检测，初步研究表以卵巢癌为模型开展肿瘤体外药敏检测，初步研究表 明明ATP-TCAATP-TCA是一种较为可靠的药敏检测方法，其结是一种较为可靠的药敏检测方法，其结 果与临床疗效及相关临床资料有较好的吻合性。果与临床疗效及相关临床资料有较好的吻合性。 5 5. . 该药敏检测方法对抗肿瘤药物筛选和应用、临床药物该药敏检测方法对抗肿瘤药物筛选和应用、临床药物 新适应症研究、化疗方案筛选和评估以及推广个体化新适应症研究、化疗方案筛选和评估以及推广个体化 治疗具有实际指导意义。治疗具有实际指导意义。 发表论文发表论文 已发表 1.王燕，傅军等.脂肪酸合成酶在非小细胞肺癌诊断及预后的临床意义.中华外科 杂志.2001,14（5）45-47. 2.Xu M, Jin Y-L, Fu J, The abnormal expression of retinoic acid receptor-beta, p53 and Ki67 protein in normal, premalignant and malignant esophageal tissues. World J Gastroenterol. 2002,8(2):200-2. 待发表 3.Jun Fu, Ping Qu, Mo Li, et al.Expression of plant associated human cancer antigen in normal, premalignant, and malignant esophageal tissues. World J Gastroenterol. 4.傅军，田海梅等.植物相关人肿瘤抗原在乳腺癌中的表达及其临床意义.中华肿 瘤杂志。 5.田海梅，傅军等.人乳腺癌细胞异质性及其生物学行为研究.中华肿瘤杂志。 致谢致谢 衷心感谢我的导师张伟研究员三年来对我的辛勤教诲和培养。本文是在他 的悉心关怀和指导下完成的。三年来导师在科学上的远见卓识、严谨的工作作 风、虚怀若谷的胸怀和正直的人品一直是我学习的楷模并使我受益终身。 本论文是在肿瘤研究所肿瘤生物学检测中心完成的，在这里得到了田海梅 老师的极大支持和指导。实验室刘毅、曲平、刘朝阳老师都给予我热情的帮助 、支持和指导，我的师弟黄泓，王小兵也参与了部分研究工作，在此表示最衷 心的感谢。 本课题系由肿瘤医院妇瘤科与肿瘤生物学检测中心合作进行，肿瘤标本由妇 瘤科提供，在这里得到了吴令英主任和张凯主治医师的热情指导和帮助，在此 向他们表示衷心的感谢。 教育处林赛荣老师和王珑珑老师在我的学习和生活上给予许多关怀、帮助和 照顾，令我感激不尽。 谨在此向所有关心和帮助过我的老师和同学致以衷心的感谢。 En