质粒DNA的提取及浓度检测.ppt

分子生物学实验 任 课 教 师: 张淑平(62773628) 李英姿 (62781668) 助教博士生: 李颖华 (62773628) 黄 波 (62783845) 唐 颖 (62772214) 课程基本情况简介/质粒DNA提取 基本技术 核酸 的分离纯化(Isolation and Purification of DNA and RNA)； 电泳技术(Gel Electrophoresis)； 基因重组、亚克隆及表达（Gene Recombination, Subcloning and Expression)； PCR技术 ( Polymerase Chain Reaction)； 分子杂交及互作(Molecular Hybridization and Interaction)； DNA测序技术(DNA Sequencing)； 基因功能的研究技术(Gene Function)； 基因的染色体定位（Localization of Gene to Chromosomes） 生物芯片技术（Bio-Chips or Bioarray) 以完整、常用、重要为原则，经典与先进 技术相结合，同时介绍相关知识，尽量让学生 在有限的学时内掌握更多的分子生物学技术以 及相关的知识。 我们的分子生物学实验课程的设计从整体 上可以说是一个完整的大实验，因为自始至终 ，各实验之间相互连贯，要求学生每一次实验 既得到本次实验的结果，同时也为下一次更深 入的实验做准备（提供实验材料）。 课程基本情况： 次 序实实 验验 名 称周次学 时时 备备注 1 课课程基本情况简简介/质质粒DNA提取 36.0 2 质质粒DNA酶切鉴鉴定及琼琼脂糖凝胶 电电泳 45.0 3 聚合酶链链式反应应(PCR)扩扩增DNA 56.0 4 DNA回收纯纯化及重组组体的构建 66.5 5 大肠肠杆菌感受态细态细 胞的制备备、重 组组DNA的转转化及克隆筛选筛选 76.5 6 重组组克隆的鉴鉴定 87.0 7 植物总总RNA的提取与电电泳 95.0 8 核酸转转膜、探针标记针标记 105.0 9 核酸杂杂交 124.5 10 综综合测验测验 、实验讨论实验讨论 与总结总结 134.0 实验安排与实验报告 注：实验报告分为12、3、4 (实验6的设计) 、45 、 6、7、89、10 (6)重组克隆的鉴定实验的几点说明 手工提取质粒方法将在“实验一”中讲到，“实验六 ”上课时间将提前到下午1:00； 接种培养将在“重组克隆的鉴定”实验课的前一天 的晚上进行（7:30-9:00pm? 9:00-10:20?）； 助博将准备好试管LB培养基，用前别忘了加你需 要的抗生素; 提供的酶包括EcoRI, XhoI, BamHI, HindIII, XbaI 。自己选择选择 正确的酶使用。 。 实验方案由学生自己设计！要提前进行。 (目的意义、材料和方法、结果及讨论) 以下几点请注意： 实验操作基本要求 1. 认真预习实验指导； 2. 按照操作规程使用仪器设备, 注意个人以及 公共设施安全； 3. 节约实验试剂及材料； 4. 实验完毕后，将实验器皿清洗干净，并清理 实验台面； 5. 按时、按质、按量完成实验工作，不迟到， 不早退； 6. 实事求是、认真而及时地写出实验报告。 评分考虑 1. 平时实验课成绩 70%； 2. 综合技术测验 30%。 实验一 质粒DNA的提取及浓度检测 1.目的与要求 通过质粒的一些特性、质粒 DNA的提取、测定，学习用 碱变性法提取质粒DNA的方 法，了解用分光光度计测定 DNA含量的方法。 2. 相关知识及原理 质粒(Plasmid) ： 独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的 遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。 存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细 胞中，在细菌细胞中最多。 DNA超螺旋结构 细菌质粒: 细菌质粒是用的最多的质粒类 群，其大小从1Kb-200Kb，它们复 制时利用宿主细胞复制自身基因组 DNA的同一组酶系。 严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控 制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以 ，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝； 松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛 控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝， 如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成 才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒 pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理 才能达到更高拷贝数。 质粒类型： 载体(Vector)： 用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制 与表达的质粒(运载工具)。 具备的条件： 易于鉴定； 在受体细胞中可以独立复制； 易于筛选； 易于导入受体细胞。 1.抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene) 2.启始复制子（ori, Origin of replication)； 3.多克隆位点(MSC, Multiple cloning site or polylinker)； 4.标记基因(Marker gene, such as LacZ gene)。 载体的结构： Insert EcoRI XhoI 1.9kb DNA 是具有一定结构的物质，一些特殊的环 境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、 有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环 境又可以使DNA复性。 原理： SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细 菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以 SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的 破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞 中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱 性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性 乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒 DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨 大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清 中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到 离心管的底部。通过这种方法即可将质粒 DNA从细菌中提取出来。 细菌裂解的方法： 碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS 煮沸裂解法:沸水煮沸40秒 SDS裂解法：10%SDS,一般用于 质粒大量提取。 测定DNA浓度的方法主要有两种，即利用分 光光度计法测定DNA的紫外光吸收值；第二 种方法是测定样品中溴化乙锭发射的荧光的 强度来计算核酸的含量。另外还有一种用于 粗略检测DNA浓度的方法是通过凝胶电泳， 与标准分子量相比较。 DNA浓度的测定： 紫外光吸收法： 因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在260nm处 具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收 峰即可对DNA进行定量。但有时也会因为所 处溶液的pH值不同而导致吸光系数的不同 。因此，一般在中性pH值左右的环境中进 行测定。这种方法常用于测定比较纯的样 品。 3. 材料与试剂 材料:含有质粒pCMV-Myc-T10的大肠杆菌 DH5。 pCMV-Myc是一种哺乳细胞表达载体，它含有一个N端c- Myc 尾，常用于免疫反应的检测和蛋白纯化以及作为诱 饵蛋白检测酵母双杂交结果。 Suitable host strains: DH5a, HB101, and other general purpose strains. Selectable marker: plasmid confers resistance to ampicillin (100 g/ml) to E. coli hosts. E. coli replication origin: pUC Copy number: 500 Insert EcoR1 Xho1 1.9kb pCMV-Myc-T10 4. 步骤 A.质粒DNA的提取 B. 碱裂解法 溶液1GET缓冲液： 50mmol/L葡萄糖， 10mmol/L EDTA， 25mMTris-HCl pH8.0。 溶液20.2mol/L NaOH, 1%SDS 溶液3乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)： 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸， 28.5mL H2O TE缓冲液或水（+ 20g/ml RNase ）: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, 100%乙醇，70乙醇 注意： 用移液器操作时，每一步都要格 外小心，特别是在加入溶液II 和 III后，一定不要剧烈振荡，以免 切碎DNA(包括质粒DNA和基因组 DNA)！ 1. 培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5 -3ml含有相应抗生素的液体培养基，37培 养1216小时; 2. 取液体培养液1.5-3ml于Eppendorf管中， 10000r/min离心1min，去掉上清液，加入 100l溶液1(GET) ，充分混匀放置3-5分钟; 3. 加入200l新配制的0.2mol/L NaOH+1SDS （变性液），加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上 放置5min; 质粒小量提取的方法（手工提取）： 4. 加入150 l乙酸钾溶液(溶液II)，加盖后颠倒6- 7次混匀，冰上放置5min; 5. 用台式高速离心机，10000r/min离心7min，上 清移入另一干净离心管，并加1ml 100乙醇混 匀，12000r/min离心5min，弃去上清液; 6. 沉淀用0.5ml 70乙醇清洗一次， 12000r/min 离心5min，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上 ，除尽乙醇，室温自然干燥; 7. 加入30-50l含有20g/ml RNase的灭菌蒸馏水 或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置15-30min ，使DNA充分溶解(有时需要酚:氯仿抽提); 8. 将分离出的质粒DNA置于-20保存备用。 Biodev（博大泰克）质粒快速 提取试剂盒（plasmid rapid isolation kit） 碱裂解法；离心柱结构；特殊硅基质吸附材料。 使用前按说明再溶液I中加入RNase；向洗脱液 中按1:3的比例加入无水乙醇。 操作步骤 1.收集1.53ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。 加入100l溶液1，振荡至彻底悬浮。 为了获得高质量的质粒DNA，培养细菌的时 间不宜过长，一般为12小时； 细菌沉淀中加入溶液1后，一定要彻底悬浮 ，否则抽提质粒DNA的纯度及得率会大大降 低 2.加入150l溶液2，立即轻柔颠倒离心管数次 ，使菌体充分裂解，裂解后的菌体变得清 亮。随后将离心管冰上放置12分钟（时 间勿超）。 3. 加入150l溶液3，立即温和颠倒离心管数次， 室温放置5分钟。12000rpm离心12分钟。 要获得更好得质粒提取效果，请于步骤2和步骤 3后，冰上放置。 4. 将420l结合缓冲液加入离心柱中。然后将步骤 3的上清加入离心吸附柱中（尽量去除杂质）， 混匀。12000rpm离心30秒钟。倒掉废液收集管 中得溶液。 5. 加入750l洗涤缓冲液于离心吸附柱中， 12000rpm离心1分钟。 浓缩漂洗液配置成工作浓度时，一定要使用无 水乙醇，否则，吸附于硅基质材料上的DNA可能 被洗脱下来，影响回收效率。 6. A.重复步骤5一次；B.随后，再次于12000rpm空 管离心2分钟，尽量除去漂洗液。 洗涕时（即步骤5和6）一定要尽量除去漂洗液 ，否则，漂洗液中得乙醇会抑制后续得各种酶 促反应。必要时，可适当延长离心时间或者用 Tip头吸净。 如果含有较多得蛋白、盐类等杂质，可多洗 涤几次。 7. 小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的 1.5ml离心管中。加入50l洗脱缓冲液，室温 放置5分钟后，12000rpm离心1分钟。 洗脱缓冲液一定要加入离心吸附柱中硅基质 材料得正中，以确保被吸附在硅基质材料中 得DNA都能被洗脱下来。为提高回收效率， 可适当加大洗脱液体积及洗脱次数。 为了充分除尽RNA的污染，可在提取的质粒中 加入0.5lRNaseA（10mg/ml）。这并不影响其 他后续实验，所提取的质粒的纯度足以用来作 为测序模板和其他酶促反应。 若提取的质粒大于10Kb，在加入洗脱缓冲液后 ，可在70水浴中放置35分钟，以确保质粒 DNA的完全洗脱。 B. 用分光光度计法定量DNA 1. 取2l提取的质粒DNA，加入98l蒸 馏水对待测DNA样品做1:50(或更高 倍数的稀释); 2. 蒸馏水作为空白,在波长260nm、 280nm处调节紫外分光光度计读数 至零。 3.加入DNA稀释液，测定260nm 及280nm 的吸收值。260nm 读数用于计算样品中 核酸的浓度，OD260值为1相当于约50g /ml双链DNA，33g /ml单链。可根据在 260nm以及在280nm的读数的比值（ OD260/OD280）估计核酸的纯度。一般 DNA的纯品，其比值为1.8，低于此值说 明有蛋白质或其它杂质的污染。 4. 记录OD值，通过计算确定DNA浓 度或纯度，公式如下: dsDNA=50(OD260) 稀释倍数 以上浓度单位为g /ml C. 凝胶电泳检测DNA的浓度 0.8%的琼脂糖凝胶， 100V,40分钟。 NEB 标准分子量片段 (1kb DNA Ladder) 1 kb DNA Ladder虽然不能 对DNA质量进行精确定量分 析，但可以通过与相近的 条带进行比较估算