《分子发光》PPT课件.ppt

第四章 分子荧光分子荧光: :FluorescenceFluorescence 分子磷光分子磷光: :PhosphorescencePhosphorescence 4.1 4.1 分子发光的基本原理分子发光的基本原理 vv第一次记录荧光现象的是第一次记录荧光现象的是1616世纪西班牙的内科医生和植物学家世纪西班牙的内科医生和植物学家 N.MonardesN.Monardes，15751575年他提到在含有一种称为年他提到在含有一种称为“ “Lignum Lignum NephriticumNephriticum” ”的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝色。的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝色。 vv直到直到18521852年，年，StokesStokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光度计在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光度计 观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这种现象是这观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这种现象是这 些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射作用些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射作用 所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念，他还由发荧光的矿石所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念，他还由发荧光的矿石“ “ 萤石萤石” ”推演而提出推演而提出“ “荧光荧光” ”这一术语。这一术语。 vv18671867年，年，GoppelsroderGoppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝 桑色素配合物的荧光进行铝的测定。桑色素配合物的荧光进行铝的测定。 vv1919世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到19281928年，才由年，才由JetteJette 和和WestWest提出了第一台荧光计。提出了第一台荧光计。 一一. . 分子荧光与磷光的产生分子荧光与磷光的产生 1. 1. 单重态与三重态单重态与三重态 2.分子的活化与去活化 3.3.分子发光的类型分子发光的类型 按激发的模式分类：按激发的模式分类： 按分子激发态的类型分类：按分子激发态的类型分类： 光致发光光致发光 化学发光化学发光/ /生物发光生物发光 热致发光热致发光 场致发光场致发光 摩擦发光摩擦发光 分子发光 分子发光 分子发光分子发光 荧光荧光 磷光磷光 瞬时荧光瞬时荧光 迟滞荧光迟滞荧光 按光子能量分类：按光子能量分类： 斯托克斯荧光斯托克斯荧光(Stokes)(Stokes)： ex ex em em 共振荧光共振荧光(Resonance)(Resonance)： ex ex = = em em 荧光荧光 分子的活化与去活化 S S0 0 S S1 1 T T1 1 S S2 2 紫紫 外外 可可 见见 吸吸 收收 光光 谱谱 外转移外转移 紫紫 外外 可可 见见 共共 振振 荧荧 光光 光光 谱谱 内转移内转移 荧光荧光 系间窜系间窜 跃跃 磷磷 光光 反系间窜反系间窜 跃跃 迟迟 滞滞 荧荧 光光 振动弛豫振动弛豫 . . 辐射跃迁的类型辐射跃迁的类型 共振荧光：共振荧光：1010-12 -12 sec sec 荧荧 光：光：1010-8 -8 sec sec 由第一电子激发单重态跃迁回基态的由第一电子激发单重态跃迁回基态的 任一振动能级所发出的光辐射。任一振动能级所发出的光辐射。 磷磷 光：光：110110-4 -4 sec sec由第一电子激发三重态跃迁回基由第一电子激发三重态跃迁回基 态的任一振动能级所发出的光辐射。态的任一振动能级所发出的光辐射。 . . 无辐射跃迁的类型无辐射跃迁的类型 振动弛豫振动弛豫: : V V r r 1010-12 -12sec sec 外外 转转 移移: :无辐射跃迁回到基态无辐射跃迁回到基态 内内 转转 移移: :S S 2 2 SS 1 1 能级之间有重叠能级之间有重叠 系间窜跃系间窜跃: : S S 2 2 TT 1 1 能级之间有重叠能级之间有重叠 反系间窜跃反系间窜跃: :由外部获取能量后由外部获取能量后 T T1 1 S S2 2 二二. . 分子荧光分子荧光( (磷光磷光) )光谱光谱 1. 1. 荧光荧光( (磷光磷光) )激发光谱与发射光谱激发光谱与发射光谱 荧光荧光( (磷光磷光) )均为光致发光，在光辐射的作用下，荧光物质发射出不均为光致发光，在光辐射的作用下，荧光物质发射出不 同波长的荧光。同波长的荧光。 A. A. 激发光谱激发光谱 固定固定 emem=620nm(MAX) =620nm(MAX) exex =290nm =290nm (MAX)(MAX) 固定发射波长固定发射波长 扫描激发波长扫描激发波长 荧光激发光谱与紫外荧光激发光谱与紫外- - 可见吸收光谱类似可见吸收光谱类似 exex =290nm =290nm (MAX)(MAX) 固定固定 emem=620nm(MAX) =620nm(MAX)固定固定 exex=290nm =290nm (MAX)(MAX) emem= = 620nm 620nm(MAX)(MAX) B. B. 发射光谱发射光谱( (荧光光谱荧光光谱) ) 固定激发波长固定激发波长 扫描发射波长扫描发射波长 C. C. 激发光谱与发射激发光谱与发射 光谱的镜像关系光谱的镜像关系 S S0 0 4 4 3 3 2 2 1 1 S S1 1 4 4 3 3 2 2 1 1 发射光谱的形状与激发波长无关：发射光谱的形状与激发波长无关： 分子的激发光谱可能含有几个激发带，但发射光谱只含一个发射带；即分子的激发光谱可能含有几个激发带，但发射光谱只含一个发射带；即 使分子被激发到高于使分子被激发到高于S S 1 1 的电子态，由于经过极快的内转换和振动弛豫降到的电子态，由于经过极快的内转换和振动弛豫降到 S S1 1 电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。 1 1 4 4 1 1 3 3 1 1 2 2 1 11 1 1 1 4 4 1 1 4 4 1 1 2 2 1 1 1 1 D.D.磷光光谱磷光光谱 与与发射光谱相同条件下的磷光光谱发射光谱相同条件下的磷光光谱 激发光谱激发光谱 发射光谱发射光谱 2. 2. 三维荧光光谱三维荧光光谱 I I F F f f ( ( exex 、 、 em em ) ) 蒽的激发光谱蒽的激发光谱 固定发射波长、扫描激发波长固定发射波长、扫描激发波长 I I F F f f ( ( exex 、 、 em em ) ) 蒽的发射光谱蒽的发射光谱 固定激发波长、扫描发射波长固定激发波长、扫描发射波长 蒽的三维等高线光谱图蒽的三维等高线光谱图 三三. . 分子荧光分子荧光( (磷光磷光) )强度与荧光物质浓度的关系强度与荧光物质浓度的关系 1. 1. 荧光强度荧光强度( (磷光磷光) )与浓度的关系与浓度的关系 光吸收定律光吸收定律（Lambert Beer LawLambert Beer Law） 相应的吸光分数为：相应的吸光分数为： 荧光强度（荧光强度（I I F F ）与相应的吸光分数成正比：与相应的吸光分数成正比： 按照级数展开式：按照级数展开式： 对于稀溶液，当对于稀溶液，当 bcbc10001000 p p (s)(s)2.62.62.52.51.41.40.230.230.0140.0140.00230.0023 6.6.溶剂效应溶剂效应 蓝移蓝移: : E E n * n * E E n * n * 红移红移: : E E* * E E* * 在极性溶剂中：在极性溶剂中： 无溶剂化作用无溶剂化作用有溶剂化作用有溶剂化作用 三. 金属螯合物的荧光 1. 1. 螯合物中配位体的发光螯合物中配位体的发光 2. 2. 螯合物中金属离子的发光螯合物中金属离子的发光 8-8-羟基喹啉羟基喹啉 弱荧光弱荧光 8-8-羟基喹啉羟基喹啉-Zn-Zn螯合物螯合物 黄绿色强荧光黄绿色强荧光 2,2-2,2-二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯 无荧光无荧光 2,2-2,2-二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯-Al-Al螯合物螯合物 强荧光强荧光 T T1 1 系间窜跃系间窜跃 S S0 0 S S1 1 d d * * 、 f f * * d d * * d d f f * * f f 荧光荧光 分子内能量转移分子内能量转移 四. 荧光的熄灭 1. 1. 碰撞熄灭碰撞熄灭 荧荧 光光 熄熄 灭灭：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起 荧光强度降低或消失的现象。荧光强度降低或消失的现象。 荧光熄灭剂荧光熄灭剂：这些溶剂分子或其它溶质分子称为荧光熄灭剂。：这些溶剂分子或其它溶质分子称为荧光熄灭剂。 相对速率相对速率 1 1 K K1 1 M M * * K K 2 2 M M * * Q Q 与分子的直径与分子的直径 、粘度、温度等因、粘度、温度等因 素有关。素有关。 2. 2. 能量转移熄灭能量转移熄灭 再吸收过程：再吸收过程： 共振能量转移：共振能量转移： 分子内能量转移：分子内能量转移： hvhv 激发激发 发射发射 熄灭熄灭 3. 3. 氧的熄灭作用氧的熄灭作用 氧分子是荧光、磷光的熄灭剂，氧分子是荧光、磷光的熄灭剂， 4. 4. 自熄灭与自吸收自熄灭与自吸收 当荧光物质的浓度大于当荧光物质的浓度大于1g/L1g/L时，常发生荧光的自熄灭时，常发生荧光的自熄灭( (浓度熄灭浓度熄灭) ) 自吸收：自吸收： 没有除氧，溶液中没有除氧，溶液中 难以观察到磷光难以观察到磷光 由于由于 F F 1 1，使荧光使荧光 强度减弱或消失强度减弱或消失. . 形成二聚体：形成二聚体： 由于二聚体不发荧光，或发射荧光的能量有改变，造成自熄由于二聚体不发荧光，或发射荧光的能量有改变，造成自熄 灭现象。灭现象。 4.3 4.3 荧光荧光( (磷光磷光) )分光光度计分光光度计 一一. . 主要组成及部件的功能主要组成及部件的功能 荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图 光源光源 氙氙 灯灯 激发单色器激发单色器 样品池样品池 光电倍增管光电倍增管 数据处理数据处理 仪器控制仪器控制 光源光源样品池样品池 激发激发 单色器单色器 检测器检测器 数据处理数据处理 仪器控制仪器控制 发射发射 单色器单色器 发射单色器发射单色器 问题：问题：荧光分光光度荧光分光光度 计与紫外计与紫外- -可见分光光可见分光光 度计有何异同点？度计有何异同点？ 二二. . 光源光源 1. 1. 光源的要求：光源的要求： vv发射强度足够且稳定的连续光谱发射强度足够且稳定的连续光谱 vv光辐射强度随波长的变化小光辐射强度随波长的变化小 vv有足够长的使用寿命有足够长的使用寿命 2.2.氙灯光源氙灯光源 常用气体放电灯类型：常用气体放电灯类型： 氙灯光源氙灯光源 高压汞光源高压汞光源 波长范围：波长范围：2001000nm2001000nm 工作压力工作压力：520 520 atmatm 启动电压：启动电压：2040KV2040KV 使用寿命：使用寿命：10002000h10002000h 最广泛应用的连续光源：最广泛应用的连续光源： 发射波长范围宽发射波长范围宽 发射光强度大发射光强度大 三三. . 单色器单色器 平面衍射光栅平面衍射光栅线色散率线色散率聚光本领聚光本领分辨率分辨率 四四. . 检测器检测器 光电倍增管光电倍增管 放大倍数：放大倍数：2 2 n n 5 5 n n ;n=10,10;n=10,10 3 3 1010 7 7 ， 最大最大1010 8 8 1010 9 9 五五. .样品池：液池、荧光池样品池：液池、荧光池 1.1.样品池的材料：与紫外样品池的材料：与紫外- -可见分光光度计的吸收池一样可见分光光度计的吸收池一样 2. 2. 吸收池的形状：紫外吸收池的形状：紫外- -可见分光光度计的吸收池两面透光可见分光光度计的吸收池两面透光 荧光分光光度计的样品池荧光分光光度计的样品池四面透光四面透光 波长范围波长范围 3. 3. 使用注意事项使用注意事项 容易破碎容易破碎 问题：问题：紫外紫外- -可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的 样品池有什么区别？样品池有什么区别？ 沾污问题沾污问题 闪跃特性闪跃特性 六六. . 磷光分光光度计磷光分光光度计 1. 1. 光学系统与荧光分光光度计的区别光学系统与荧光分光光度计的区别 光源光源样品池样品池 激发激发 单色器单色器 检测器检测器 数据处理数据处理 仪器控制仪器控制 发射发射 单色器单色器 切光器（斩波器）切光器（斩波器） 共振荧光：共振荧光：1010-12 -12 sec sec 荧荧 光：光：1010-8 -8 sec sec 磷磷 光：光：110110-4 -4 sec sec 迟滞荧光：迟滞荧光：1001010010-4 -4 sec sec 2. 2. 样品池与荧光分光光度计的区别样品池与荧光分光光度计的区别 通常情况下，样品池需要放在盛通常情况下，样品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶液氮的石英杜瓦瓶 内，来测定内，来测定低温磷光低温磷光。 4.4. 荧光分析法的应用荧光分析法的应用 一一. . 工作曲线法工作曲线法 荧光分析的灵敏度比紫外可见分光光度法高荧光分析的灵敏度比紫外可见分光光度法高1010 3 3 1010 4 4 . . 荧光熄灭工作曲线法荧光熄灭工作曲线法 F Fx x F F C C s s C Cx x 直接荧光标准曲线法直接荧光标准曲线法 F F C C s s F Fx x C Cx x 二二. . 荧光分析法的灵敏度荧光分析法的灵敏度 在紫外光照射下会发生荧光的无机化合物很少，主要依赖于在紫外光照射下会发生荧光的无机化合物很少，主要依赖于 有机试剂形成的螯合物。有机试剂形成的螯合物。 三三. . 荧光分析的应用荧光分析的应用 1. 1. 无机化合物无机化合物 vv 直接荧光测定法直接荧光测定法 其中，较常测定的元素有：其中，较常测定的元素有：BeBe、AlAl、B B、GaGa、SeSe、MgMg、 ZnZn、CdCd与某些稀土元素；测定的灵敏度有些可以达到与某些稀土元素；测定的灵敏度有些可以达到1010-10 -10 ; ; 某些元素虽然不与有机试剂形成发荧光的配合物，但是它会与某些元素虽然不与有机试剂形成发荧光的配合物，但是它会与 发荧光的配合物争夺配位体，组成不发荧光的配合，使其产生荧光发荧光的配合物争夺配位体，组成不发荧光的配合，使其产生荧光 熄灭，由荧光熄灭的强度此该元素的含量。熄灭，由荧光熄灭的强度此该元素的含量。 较常测定的元素有：较常测定的元素有：F F、S S、FeFe、AgAg、CoCo、NiNi、CuCu、MoMo、WW vv 荧光熄灭测定法荧光熄灭测定法 自从自从18671867年年GoppelsroderGoppelsroder进行了历史上首次的荧光分析进行了历史上首次的荧光分析 工作，应用铝工作，应用铝桑色素配合物的荧光进行铝的测定以来，采用桑色素配合物的荧光进行铝的测定以来，采用 有机试剂可以测定有机试剂可以测定7070多种元素。多种元素。 vv 催化荧光测定法催化荧光测定法 较常测定的元素有：较常测定的元素有：CrCr、NbNb、U U、TeTe、PbPb 某些元素虽然与有机试剂形成发荧光的配合物，但是反应速某些元素虽然与有机试剂形成发荧光的配合物，但是反应速 度慢，在某些微量元素的催化下，反应速度会加快，在特定的时度慢，在某些微量元素的催化下，反应速度会加快，在特定的时 间内可用来测定微量元素。间内可用来测定微量元素。 vv 低温荧光测定法低温荧光测定法 常测定的元素有：常测定的元素有：CuCu、BeBe、FeFe、CoCo、OsOs、AgAg、AuAu、ZnZn 、AlAl、TiTi、V V、MnMn、ErEr、H H 2 2 OO 2 2 、CNCN 某些微量元素存在，会催化发荧光的配合物产生荧光熄灭，某些微量元素存在，会催化发荧光的配合物产生荧光熄灭， 在特定的时间内可用来测定微量元素。在特定的时间内可用来测定微量元素。 溶液温度的降低，显著增强溶液的荧光强度。液氮溶液温度的降低，显著增强溶液的荧光强度。液氮 196196 0 0C C 较常测定的元素有：较常测定的元素有：CeCe、SmSm、Tb Tb 等稀土元素等稀土元素 SbSb、V V、PbPb、BiBi、NbNb、MnMn vv 固体荧光测定法固体荧光测定法 固体荧光发在荧光分析中也经常用到。固体荧光发在荧光分析中也经常用到。 芳香族化合物存在共轭的不饱和体系，是有机