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文档简介
实验二 质粒DNA的提取及电泳 检测 一、 实验目的 了解并掌握质粒DNA的原理和方法 n 通常用的质粒DNA 分离方法有2种 ： 1、碱裂解法 2、煮沸法 本实验介绍的是碱裂解法小量提取质粒DNA 。 二、实验原理 二、实验原理 n 在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双 螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分 子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高 碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当 加入中和缓冲液调时，变性质粒DNA又恢复到原 来的构型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则 不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不 溶性复合物。通过离心沉淀，细胞碎片、染色体 DNA及大量蛋白质等可被除去，而质粒DNA及小 分子量的RNA则留在上清液中。混杂的RNA可以 用RNA酶清除。再用酚/氯仿处理，可以除去残留 的蛋白质。 原 理 成分：NaOH,SDS 成分：醋酸钾， 冰乙酸 三、操作流程 1、分离质粒DNA 2、电泳鉴定 四、实验操作过程（鼎国）四、实验操作过程（鼎国） 1、取1500ul过夜培养的菌液，加入离心管中 ， 12000rpm，离心1分钟，尽量吸除上清 。 2、加250ul溶液A，剧烈震荡。 3、加250ul溶液B,温和颠倒4-6次，静止2min 4、加取350ul溶液C,立即温和颠倒混匀4-6次 。静止2分钟。12000rpm，离心10分钟。 （注：制胶） 1、分离质粒DNA 5. 将上清置于离心柱中，静置2min。 6. 12000rpm，1分钟，弃废液。 7. 加入500ul 溶液D,12000rpm，1min， 弃废液。 8. 加入500ul 溶液E,12000rpm，1min， 弃废液。 9. 12000rpm，再次离心2min 10. 将离心柱置于新的离心管中，室温敞开离 心管盖子放置5-10min。 11. 向吸附膜中部加50ul溶液F,静置2分钟。 12. 12000rpm，离心2分钟，管底即为收到 的DNA. 2、电泳鉴定 n （1）制备1%琼脂糖凝胶（方法如实验一） n （2）上样、电泳、观察现象 五、实验结果五、实
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