《分子发光分析法》PPT课件.ppt

7 分子发光分析法 化学教研室 张威 提要提要返回返回 主要内容 7-1 概述 7-2 分子荧光分析法及其原理 7-3 荧光分析仪器 7-4 定量分析方法 7-5 化学发光分析法 7-6 分子发光分析法的应用 提要提要返回返回 7-1 概述 分子发光 分子发光分析法 光致发光 电致发光 生物发光 提要提要返回返回 7-2 分子荧光分析法及其原理 一、分子荧光和磷光的产生 1.电子自旋状态的多重性 2. 无辐射跃迁 3. 荧光和磷光光谱的产生 二、分子荧光分析法的基本原理 1.激发光谱和荧光谱 2.荧光强度及其与浓度的关系 3.荧光与分子结构的关系 4.影响荧光强度的因素 提要提要返回返回 一、荧光和磷光光谱的产生(图) 具有不饱和基团的基态分子光照后，价 电子跃迁产生荧光和磷光 基态分子 价电子跃迁到激发态 光照激发光照激发 去激发光去激发光 * * * * n n 基基 态态 7-27-2 提要提要返回返回 1. 电子自旋状态的多重性 单重态：用 “S0” 表示 当物质受光照射时，基态电子能级跃迁至 更高的单重态，电子自旋方向没有改变，净 自旋 = 0 基态单重态基态单重态 S S0 0 第一激发单重态第一激发单重态 S S1 1 S S0 0 , S, S 1 1 , S, S 2 2 , S, S 3 3 分别代表基态分别代表基态, , 第一第一, , 二二, , 三激发单重态三激发单重态 单重态分子具有抗磁性，激发态的平均寿命约为单重态分子具有抗磁性，激发态的平均寿命约为1010-8 -8 7-27-2 提要提要返回返回 若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的 改变，由基态单重态激发三重态，净自旋 0。这种跃迁为禁阻跃迁 T1、T2、T3分别表示第一、二、三激发三重态 基态单重态基态单重态 S S0 0 第一激发三重态第一激发三重态 T T 1 1 自旋自旋 平行平行 三重态分子具有顺磁性，激发态的平均寿命约三重态分子具有顺磁性，激发态的平均寿命约 为为1010-4 -41S 1S 7-27-2 提要提要返回返回 2. 无辐射跃迁 内部转换（IC）相同的多重态之间的 转换 S-S 系间窜跃（ISC）不同的多重态之间 的转换 S-T 振动驰豫（VR）同一电子能级中，从 较高振动能级到较低振动能级的过程 发生系间窜跃电子需转向，S1T1间进 行，比内部转换困难 7-27-2 提要提要返回返回 T1 S0 ISC VR VR IC 吸光吸光 吸光吸光 S0 S1 S2 VRVR：振动驰豫振动驰豫 ICIC：内部转换内部转换 ISCISC：系间窜跃系间窜跃 7-27-2 提要提要返回返回 3. 荧光和磷光光谱的产生 S1或T1 S0 发光发光 （1 1）荧光：荧光： n n 当电子从第一激发单重态当电子从第一激发单重态S S 1 1 的最低振动的最低振动 能级回到基态能级回到基态S S 0 0 各振动能级所产生的光各振动能级所产生的光 辐射叫荧光辐射叫荧光 n n 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产荧光是相同多重态间的允许跃迁，产 生速度快，生速度快，1010-9 -910 10-6 -6s s， ，又叫快速荧光或又叫快速荧光或 瞬时荧光，外部光源停止照射，荧光马瞬时荧光，外部光源停止照射，荧光马 上猝灭上猝灭 7-27-2 提要提要返回返回 3. 荧光和磷光光谱的产生 S1或T1 S0 发光发光 （1 1）荧光：荧光： n n 无论开始电子被激发至什么高能级，它无论开始电子被激发至什么高能级，它 都经过无辐射去激消耗能量后到都经过无辐射去激消耗能量后到S S 1 1 的最低的最低 振动能级，发射荧光，荧光波长比激发振动能级，发射荧光，荧光波长比激发 光波长长。光波长长。 荧荧 激 激 7-27-2 提要提要返回返回 T1 S0 ISC VR VR IC 吸光吸光 吸光吸光 荧光 分子荧光光谱产生过程示意图分子荧光光谱产生过程示意图 S0 S1 S2 VRVR：振动驰豫振动驰豫 ICIC：内部转换内部转换 ISCISC：系间窜跃系间窜跃 7-27-2 提要提要返回返回 （2）磷光 从T1 S1要改变电子自旋，发光速度 慢，约为 10-4 10s，光照停止后，磷 光仍可持续一段时间 分子相互碰撞的无辐射能量埙耗大， 所以磷光的波长更长 磷 荧 激 * 易产生荧光 n * 易产生磷光 7-27-2 提要提要返回返回 T1 S0 ISC VR VR IC 吸光 吸光 荧光 磷光 分子荧光、磷光光谱产生过程示意图 S0 S1 S2 VRVR：振动驰豫振动驰豫 ICIC：内部转换内部转换 ISCISC：系间窜跃系间窜跃 VR 7-27-2 提要提要返回返回 二、分子荧光分析的基本原理 1.激发光谱和荧光谱 激发光谱：荧光和磷光均为光致发光， 合适的激发光波长需根据激发光谱确定 激发光谱是在固定荧光波长下，测量荧 光体的荧光强度随激发波长变化的光谱 7-27-2 提要提要返回返回 激发光谱 I exex 固定固定 em em 荧光波长 荧光波长 7-27-2 提要提要返回返回7-27-2 I emem 二、分子荧光分析的基本原理 发射光谱(荧光光谱)：固定激发波长， 扫描发射波长 提要提要返回返回 2.荧光强度及其与浓度的关系 （1）荧光量子产率f （2）荧荧光强度与浓浓度的关系 7-27-2 提要提要返回返回 3.荧光与分子结构的关系 1） 共轭效应 2） 刚性平面结构 3） 取代基效应 （A）给电子取代剂加强荧光 （B）吸电子取代基减弱荧光 （C）取代基的位置 4）跃迁的类型 7-27-2 提要提要返回返回 化合物 苯苯萘 萘 蒽蒽丁 丁 省省戊戊 省省 580390365286205exmax(nm) 640480400321278 emmax (nm) 0.520.600.460.290.11F 3.荧光与分子结构的关系 1）. 共轭效应：产生荧光的有机物质，都 含有共轭双键体系，共轭体系越大，离域大 键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易 产生。 7-27-2 提要提要返回返回 3.荧光与分子结构的关系 2）刚性平面结构 荧光物质的刚性和平面性增加， 有利于荧光发射。 7-27-2 提要提要返回返回7-27-2 提要提要返回返回 3.荧光与分子结构的关系 3）. 取代基效应 （A）给电子取代剂加强荧光 HN2， NHR ， NR2， OH OR ， CN，产生 p 共轭 7-27-2 提要提要返回返回 3）. 取代基效应 （B）吸电子取代基减弱荧光、加强磷光 C=0， COOH ， NO2，不 产生 p 共轭 二苯甲酮：弱荧光、强磷光二苯甲酮：弱荧光、强磷光 S S 1 1 T T 1 1 的的系间窜跃产率接近系间窜跃产率接近1 1 硝基苯：不产生荧光、弱磷光硝基苯：不产生荧光、弱磷光 3.荧光与分子结构的关系 7-27-2 提要提要返回返回7-27-2 空间位阻对荧光发射的影响空间位阻对荧光发射的影响 （C C）取代基的位置）取代基的位置 F F = =0.750.75 F F = =0.030.03 立体异构体对荧光发射的影响立体异构体对荧光发射的影响 反式二苯乙烯反式二苯乙烯 强荧光物质强荧光物质 顺式二苯乙烯顺式二苯乙烯 非荧光物质非荧光物质 提要提要返回返回 4 4）跃迁的类型）跃迁的类型 * * n n * * max max 100 100 平均寿命平均寿命1010-5 -510 10-7 -7 sec sec * * max max10 104 4 平均寿命 平均寿命1010-7 -710 10-9 -9 sec sec * * n n * * 是有机化合物产生荧光的主要是有机化合物产生荧光的主要 跃迁类型，主要是不含跃迁类型，主要是不含NN、S S、OO的不饱的不饱 和化合物。和化合物。 3.荧光与分子结构的关系 7-27-2 提要提要返回返回 （1）. 荧光的猝灭 荧 光 猝灭：荧光分子与溶剂分子或 其它溶质分子相互作用引起荧光强度 降低或消失的现象。 荧光猝灭剂：能使荧光强度减弱的 溶剂分子或其它溶质分子称为荧光猝 灭剂。 4.影响荧光强度的因素 7-27-2 提要提要返回返回 自猝灭与自吸收自猝灭与自吸收 当荧光物质的浓度大于当荧光物质的浓度大于1g/L1g/L时，常发生时，常发生 荧光的自猝灭荧光的自猝灭( (浓度猝灭浓度猝灭) ) 自吸收：自吸收： 由于由于 f f 1 1，使荧使荧 光强度减弱或消失光强度减弱或消失 . . 形成二聚体：形成二聚体： 由于二聚体不发荧光，或发射荧光的由于二聚体不发荧光，或发射荧光的 能量有改变，造成自猝灭现象。能量有改变，造成自猝灭现象。 4.影响荧光强度的因素 7-27-2 提要提要返回返回 电荷转移猝灭电荷转移猝灭 发生氧化还原反应发生氧化还原反应 4.影响荧光强度的因素 7-27-2 甲基蓝甲基蓝 分子分子甲基蓝甲基蓝 离子离子 提要提要返回返回 转入三重态猝灭转入三重态猝灭 含有减弱荧光的电子取代基，如含有减弱荧光的电子取代基，如 羧基、羰基、硝基、重氮化合物、重羧基、羰基、硝基、重氮化合物、重 原子，常发生原子，常发生S S 1 1 TT 1 1 4.影响荧光强度的因素 7-27-2 提要提要返回返回 4.影响荧光强度的因素 （2）温度、酸度和溶剂的影响 C温度：低温下测定，提高灵敏度 C酸度：大多数含有酸性或碱性基团的 芳香族化合物的荧光性质受溶液pH的影 响很大 C溶剂：极性，f ， If （3）表面活性剂的影响：增敏作用 7-27-2 提要提要返回返回 7-3 荧光分析仪器 一、基本装置及主要构件 光源、单色器、样品池、狭缝、 光电倍增管、读出装置 二、荧光分光光度计 提要提要返回返回 二、荧光分光光度计 7-37-3 荧光分光光度计主机荧光分光光度计主机 结构结构 提要提要返回返回 微机化荧光分光光度计 图 主机主机 模模- -数数 转换转换 CPUCPU 存储器存储器 面板面板 数数- -模模 转换转换 显显 示示 器器 打印机打印机 提要提要返回返回 7-4 定量分析方法 一、工作曲线法 二、比较法 三、多组分混合物的荧光分析 四、荧光分析的注意事项 提要提要返回返回 一、工作曲线法 将已知量的标准物质与试样在相同条 件下处理，配制一系列标准液，测定它 们的相对发光强度。 以相对荧光强度为纵坐标，以标准溶 液的浓度为横坐标 浓度 C1 C2 C3 C4 C5 Cx 荧光强度 If1 If2 If3 If4 If5 Ifx 7-47-4 提要提要返回返回7-47-4 提要提要返回返回 二. 比较法 如果试样数量不多，可用比较法进行测量 配一标准溶液浓度为Cs， Cs与未知液浓度 Cx相近，并在相同条件下测定它们的荧光强 度 未知液 If x = KCx 标准液 If s = KCs 比较比较 试剂有空白试剂有空白 7-47-4 提要提要返回返回 三、多组分混合物的荧光分析 (1) 如果两组分的荧光峰相互不干扰,可直 接测定 可分别在各自的荧波长处测定,求出它们 的含量 (2) 如果两组分的荧光峰相互干扰,但激发 光谱有显著区别,在某一激发光下一个组分 产生荧光峰,另一组分不产生荧光; 可选用不同的激发光进行测定 7-47-4 提要提要返回返回 Al3+8-羟基喹啉配合物的氯仿溶液 ex =365nm em=520nm Ga3+8-羟基喹啉配合物的氯仿溶液 ex =436nm em=520nm 365nm激发光， Al3+的配合物产生荧光， 而Ga3+配合物不产生荧光，无荧光峰； 436nm激发光， Ga3+ 的配合物产生荧光 ，而Al3+配合物不产生荧光，无荧光峰 例： 7-47-4 提要提要返回返回 在365nm条件下激发，520nm处测Al3+ 8-羟基喹啉配合物，在436nm条件下 激发，520nm处测Ga3+8-羟基喹啉配 合物 例： 7-47-4 提要提要返回返回 (3) 如果两组分的荧光光谱和激发光谱相 互干扰 利用荧光强度的加和性（ F=F1+F2+F3+），在适宜的荧光波长处 测定，用联立方程来求解 例：硫胺荧 CT ex =385nm em=435nm 吡啶硫胺荧CP ex =410nm em=480nm 相互干扰荧相互干扰荧 光光谱重叠光光谱重叠 n n 在在385385或或410nm410nm下激发，下激发， 在在435435和和480nm480nm下分别测下分别测 荧光强度荧光强度 7-47-4 提要提要返回返回7-47-4 在385或410nm下激发，在435和 480nm下分别测荧光强度 硫胺素浓度硫胺素浓度 If =KCK: 纯物质在选定波长下测If,求K 385nm385nm激发激发 I If f 435/385=26339 435/385=26339 1010 4 4C C T T +210 +210 1010 4 4C C P P I If f 480/385=9685 480/385=9685 1010 4 4C C T T +1022 +1022 1010 4 4C C P P 或或410 nm410 nm激发激发 I If f 480/410=2816 480/410=2816 1010 4 4C C T T +1709 +1709 1010 4 4C C P P I If f 435/410=6419 435/410=6419 1010 4 4C C T T +252 +252 1010 4 4C C P P 吡啶硫胺素浓度吡啶硫胺素浓度 提要提要返回返回 四、荧光分析的注意事项 1.防止荧光污染 所用的器皿、溶剂混有非待测荧 光体或者荧光溶液制备、保存不当而引 起的荧光干扰现象。 2.防止散射光干扰 溶液中可能存在的散射光有：丁 达尔散射光、瑞利散射光和拉曼散射光 。 7-47-4 提要提要返回返回 7-5 化学发光分析法 定义：某些物质在进行化学反应时，由 于吸收了反应时产生的化学能，而使反应 产物分子激发至激发态，受激分子由激发 态回到基态时，便发出一定波长的光。这 种吸收化学能使分子发光的过程称为化学 发光。利用化学发光反应而建立起来的分 析方法称为化学发光分析法。 提要提要返回返回 7-5 化学发光分析法 一、基本理论 1.化学发光反应的条件 2.化学发光效率cl和强度 二、化学发光反应的类型 1.直接化学发光和间接化学发光 2.气相化学发光和液相化学发光 （1）气相化学发光 （2）液相化学发光 三、化学发光仪器 提要提要返回返回 7-5 化学发光分析法 一、基本理论 1.化学发光反应的条件： 能快速释放出足够的能量。化学反应 必须提供足够的激发能，激发能主要来 源于反应焓。 要有有利的化学反应历程，使化学反 应的能量至少能被一种物质所接受并生 成激发态。 7-57-5 提要提要返回返回 7-5 化学发光分析法 一、基本理论 1.化学发光反应的条件： 激发态能释放光子或能够转移它的能 量给另一个分子，而使该分子激发，然 后以辐射光子的形式回到基态。 7-57-5 提要提要返回返回 7-5 化学发光分析法 2.化学发光效率cl和强度 r :生成激发态分子的效率 f : 激发态分子的发光效率 7-57-5 提要提要返回返回 7-5 化学发光分析法 化学发光强度: Icl（t）: t时刻的化学发光强度 dc/dt: 分析物参加反应的速率 7-57-5 提要提要返回返回 7-5 化学发光分析法 二、化学发光反应的类型 按反应体系的状态分类，如化学发光 反应在气相中进行称为气相化学发光；在 液相或固相中进行称为液相或固相化学发 光；在两个不同相中进行则称为异相化学 发光。 7-57-5 提要提要返回返回 7-5 化学发光分析法 2. 气相化学发光和液相化学发光 （1）气相化学发光 主要有O3氧化NO、S的化学发光反应， 可用于监测空气中的O3、NO、SO2、H2S 、