《胶体金检测技术》PPT课件.pptVIP

免疫胶体金快速检测技术 农业农业部饲饲料质质量监监督检验测试检验测试中心（西安） 培训资料 主要内容 一、免疫胶体金技术的发展历史 二、胶体金检测卡的基本原理及构造 三、免疫胶体金层析法检测原理及应用 四、-激动剂检测卡快速筛查尿样的方法介绍 五、常见问题分析与注意事项 六、免疫胶体金技术的发展的方向 培训资料 一、免疫胶体金技术的发展史 1.1939年（英，植物）Kausche和Ruska把烟草叶病毒吸 附在金颗粒上，在电子显微镜下观察呈现高电子密度的细状 颗粒，开启了免疫胶体金技术的研究。 2.1971年（美，微生物）Faulk和Taylor首先将兔抗沙门菌 抗血清与胶体金颗粒结合，用直于检测沙门菌的表面抗原。 3.1974年（奥）Romano等将胶体金标记在马抗人IgG上， 实现了间接免疫金染色法。同年Bauer等报道将胶体金标记 在凝集素上的应用。 培训资料 4.1978年Geoghegan等应用免疫金技术检测B淋巴 细胞表面抗原。 5.1981年Danscher建立了银显影液增强光镜下金颗 粒的免疫金银染色方法 （Immunogold-silver staining,IGSS）。 6.1986年Fritz（美，生物）等人在IGSS法基础上成 功地进行了彩色IGSS的染色法,使得检测结果更加鲜 艳夺目这是免疫金检测技术诞生的一次历程碑！ 培训资料 二、 胶体金的概念、原理及结构 1.胶体金概念及来源： 胶体金又称金溶胶，是由金 盐还原成金后形成的金颗粒悬浊液。 2.胶体金颗粒结构：由一个基础金核即金原子与包围 在外的离子层构成，离子层为氯金酸负离子（AuCl2-)， 外层为H+，分散在溶液中。呈球形(小颗粒)或椭圆形( 大颗粒)。 培训资料 图1 金颗粒示意图 在溶液中金颗粒呈 圆形,表面带有负电 荷,由于静电的排斥 力,使其在水中保稳 定状态，形成稳定 的胶体状态。 培训资料 3. 胶体金试纸条的构造 样品垫 PVC底板 层析方向 胶体金垫 测试线 （T线） 控制线（C线） NC膜（硝酸纤维素膜） 吸水滤纸 培训资料 4.免疫层析法检测原理（双抗体夹心) 4.1（以HCG检测为例） 培训资料 4.2 免疫层析法检测原理（竞争抑制反应） （以吗啡检测为例） 培训资料 4.3 免疫层析法检测的原理（应用proteinA金标） （以HIV检测为例） 阴性 阳性 培训资料 克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇胶体金试纸条是胶体金层析 法的应用 采用竞争抑制法，将氯金酸用还原法制成一定直径的金溶胶 颗粒，标记为抗体。以硝酸纤维素膜为载体，样本中的盐酸克伦 特罗在流动的过程中与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，抑 制了抗体和硝酸纤维素（NC）膜检测线上盐酸克伦特罗BSA 偶联物（与盐酸克伦特罗的化学结构相似）的结合，使检测线不 显颜色，结果为阳性。反之，检测线显红色，结果为阴性。 规定尿液中盐酸克伦特罗的胶体金免疫层析测定方法。适用于 猪、牛尿液中盐酸克伦特罗的筛选，最低检测浓度为3ng/ml。 培训资料 -结果判定依据 阴性对照出现红色条带，阳性对照不出现红色条带，说 明检测卡有效。 如阴性对照不出现红色条带，或阳性对照出现红色条带， 出现任何一种现象或两种同时出现，说明检测卡失效。 待检尿样检测区出现红色条带为阴性 待检尿样检测区不出现红色条带为阳性 阳性结果 样品中可能含有等于或高于3ng/ml的盐酸克伦特罗。 培训资料 四、-激动剂检测卡快速筛查尿样的方法介绍 以盐酸克伦特罗胶体金快速检测卡为例 一适用范围： 主要用于定性检测，测定动物尿液，如猪尿、牛尿、羊 尿等样品中盐酸克伦特罗的残留。整个检测过程只需要 510分钟左右，灵敏度为3 ng/ml(3ppb)。也就是说当 尿液中盐酸克伦特罗的残留大于或等于3 ng/ml时，检测 卡才能检测到。 培训资料 二 、包装 每个包装袋中包含盐酸克伦特罗免疫胶体金快速检测卡 ，滴管1个、干燥剂1片。 三、现场筛查步骤 1在进行测试前先完整阅读使用说明书，使用前将检测卡 和待检样本溶液恢复至室温。 2从原包装袋中取出检测卡，打开后请在一个小时内就地 使用。 培训资料 3将检测卡平放，用移液器或滴管吸取尿液样品溶液，垂 直滴加3滴（约80ul）于加样孔中，加样后开始计时。 培训资料 4结果应在510分钟读取，其他时间判读无效，根据示意 图判定结果。 培训资料 A、阴性（-）：C、T线均出现。表示样品中不含有克伦 特罗或其深度低于检测限。 培训资料 B、阳性（+）：检测T线不出现，则表示样品中克伦特罗浓 度高于检测限。 培训资料 C、无效：未出现质控C线，表明操作过程不正确或检测卡已 失效，重新使用新卡。 培训资料 经试剂卡检测的阳性样品在未进行确正之前，被称为疑似 样品，必须进行确证后，才能准确判断，不能提前作结论。 因此，对于出现阳性结果的样品，应按官方抽样程序分瓶 封装样品，并于0 -4保存，尽快送到我中心进行确证检测 。 培训资料 五、常见问题及注意事项 1.使用前将检测卡和待检样本恢复至室温 2.保持干燥，避免受潮，打开包装请尽快使用 试纸条中的NC膜受潮后，尿样在上面无法正常泳动，无 法到达吸水纸的位置；胶金垫上的金标抗体受潮后会变性， 从而失去原有的生理性功能，影响抗原抗体的选择性反应。 因此，试纸条必须保持干燥，从包装袋中取出后要尽快使用 。 3.检测时，避免阳光直射和电风扇、空调的风直吹 尿样一开始在NC膜上泳动时，是利用毛细管作用，如果 风吹太阳晒，NC膜上的尿样蒸发后难以到达吸水纸的位置 ，会产生假阳性结果，因此，检测时要避免阳光直射和电风 扇、空调的风直吹。 培训资料 4.尽量不要触摸检测卡中央的白色膜面 这主要是人手掌的汗 液中有钾、钠离子存在，影响NC膜上泳动时的毛细管作用。 5.尿样滴管不可混用，以免交叉污染 每一类检测卡的抗体 都具有独特的特异性选择，但性质相同或结构相似的样品组 成会产生干扰。 6.加样量为70-80l左右（垂直加三滴） 如果加样量太大或太小，将会影响实验结果。如样品非常 粘稠，有可能导致样品爬不上去，此时可适当多滴12滴。 7.以T线的条带为观测点,C线为质量控质线 由于动物个体的差异使尿样样本中的成分组成不同，检测 时，有的检测线可能偏淡或颜色偏灰，但只要条带出现，就 可判定为阴性结果。 培训资料 8. 如果尿样出现沉淀或浑浊物，请离心后或静置后再检测； 9.试纸条应常温保存，防止温度过高或过低 放在冰箱中要防止温度过低，检测卡受潮，一般风泠冰箱 最好，温度控制在8左右较为理想。避免在炎热高湿的环境 中保存。 10.阳性疑似样品应在0 -4冷冻保存 冷藏和常温条件下 ，尿中的瘦肉精在尿酸和酶的作用下易发生降解，含量会大幅 下降，表出现最为突出的是盐酸克伦特罗和莱克多巴胺，因此 需确证的尿样必须冷冻保