《内生细菌》PPT课件.ppt

第四节 内生细菌 一、概述 n1定义 内生细菌由克洛珀（ Kloepper ）第一次提 出了“植物内生菌”的概念。早在1926年，Perotti 等人在许多健康植物根组织内发现了细菌，被 确定为植物体内存在细菌的起始点。 n植物内生菌（Endophyte）是指那些在其生活史 的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种 组织和器官内部的真菌或细菌。 n2内生菌种类： n 内生真菌（Endophytic fungi） n 内生细菌（Endophytic bacteria） n 内生放线菌（Endophytic actinomyces）等。 100多年前人们就已发现在健康植物组织的 内部也有微生物存在，这类微生物在文献中后 来被称为植物内生菌。 自20世纪30年代发现造成畜牧业重大损失的 牲畜中毒是由于食用感染内生菌的牧草后，内 生菌的研究才得以广泛地开展起来 。 n 我国于20世纪70年代陈延熙等相继在棉花、 水稻、番茄、辣椒、花生、小麦、烟草、马铃 薯、黄瓜等十多种作物中发现内生细菌。 n 近年来，随着研究领域的不断拓宽和研究 方法的不断深入，植物内生菌所发挥的重要的 生态和生理作用及其作为潜在生防资源和外源 基因载体，在农业和医药领域中的巨大应用潜 力，已逐渐成为国内外研究的热点。 黄瓜内生菌分离菌株对苹果腐烂病菌的抑制效果分离菌株对棉花枯萎病菌的抑制效果 小麦内生菌菌株对小麦全蚀病 菌的抑制作用 菌株的革兰氏染色情况（G-） 植物内生细菌普遍存在于高等植物中，木 本、草本植物，单子叶植物和双子叶植物内均 有内生细菌。 已在水稻、小麦、玉米、马铃薯、花生、甜 菜、黄瓜、番茄、棉花、三叶草、柠檬、葡萄 等30多种植物的不同器官中分离到了个80属的内 生细菌。 内生细菌以假单胞菌属（Pesudomonas）、芽 孢杆菌属（Bacillus）、肠杆菌属（Enterobacter）和 土壤杆菌属（Agrobacterium）为主。 n 马铃薯内生细菌包括假单孢菌属（ Pesudomonas），芽孢菌属（Bacillus），黄单孢菌 属（Xanthomonas），黄杆菌属（Flavobacterium）， 棒杆菌属（Corynebacterium），不动杆菌属（ Acinetobacter），气杆菌属（Aerobacter），微球菌 属（Micrococcus），农杆菌属（Agrobacterium）等。 从花生中分离的内生菌有细菌和真菌。 n 内生细菌以巨大芽孢杆菌（B.megaterium） 、蜡样芽孢杆菌（B. cereus）和枯草芽孢杆菌（ B.subtilis），还有黄单胞菌(Xanthomonas spp.)和 欧文氏菌(Erwinia spp.)。 n 内生真菌以丛梗孢属(Monilia)、链格孢属 (Alternaria)和黑乌霉属（Memmoniella）、曲霉菌 （Aspergillus flavus）为主，未分离到放线菌。 n3作用 内生细菌在植物体内具有稳定的生存空间 ，不易受环境条件的影响，可以在植物体内独 立的分裂繁殖和传递，使之成为生物防治中有 潜力的微生物农药、增产菌或作为潜在的生防 载体菌而加以利用。 A. 植物保护剂。与根围、叶围细菌相比，内生 细菌作为生防制剂具有二者不可替代的优势， 如系统分布于植物体内、所处环境比较稳定、 营养来源可靠且丰富等，从而更有利于其发挥 作用。 B. 促生作用。同根际促生细菌一样，内生细菌 既可以产生促生物质，直接促进植物生长，也 可以通过与病原菌竞争空间或产生拮抗物质从 而间接起促生作用，因此内生菌完全有可能作 为增产菌用于生产实践。 C. 内生细菌可起固氮作用。 D. 外源基因载体。 植物内生细菌是一种良好的外源基因载体 ，通过基因工程技术将Bt杀菌或杀虫基因导入内 生菌中，构建成抗菌或抗虫的工程菌，用于生 物防治。目前将Bt杀虫基因导入一些优良的内生 菌，用于害虫的生物防治。 n内生菌控制植物病害的机理 n1. 产生抗生素类物质 n内生菌产生的抗生素类物质存在植物体内，在植物体内转运，利于发挥防病作用。 n根际内生菌产生的抗生素物质包括2 ,4-二乙酞藤黄酚(PHL)、吩嗪羧酸(PCA)、藤黄绿脓菌 (pyoluterin ,PLT)、硝吡咯菌素(pyrrolnitrin ,PRN)、脓青素(PYO)、HCN和一类丁酰内酯 (butyrolactones)。其中，PHL和PCA的研究最为深入，它们对小麦全蚀病菌有较强的抑制作用， 对黄瓜枯萎病也有一定的生防作用。香港城市大学Urijmoed教授等从中国南海红树中分离出来的 内生真菌能产生灰黄霉素A和多种醌类抗生素，对酵母菌和霉菌等均有抑制作用。 n2. 产生水解酶 n植物内生真菌和内生细菌另一个重要的生防机制是产生水解酶类，如几丁质酶和葡聚糖酶。这 些水解酶与植物抗真菌能力有密切关系，因为真菌细胞壁的主要组成成份是几丁质和葡聚糖。 这些水解酶可以降解真菌的细胞壁或其它致病因子如毒素等，达到防病效果。一种用于防治水 稻稻瘟病的内生细菌Pseudomonas fluorescens产生的几丁质酶和葡聚糖酶的水平与它的防病效果 有密切的关系。某些生防菌的几丁质酶基因己经被克隆，可以将这些基因转化到内生菌中,发挥 内生菌的优势，提高防病效果。一种用于防治棉花黄萎病的内生菌，可产生某些蛋白酶降解毒 素达到防病的效果。 n3. 产生植物生长调节剂 n内生菌也可产生植物生长激素类物质，如IAA、吲哚乙腈等。Lu等72发现大多数黄花蒿内生真 菌在体外培养时能产生对小麦和黄瓜幼苗生长不同程度的抑制或促进作用的代谢产物，对其中 一种炭疽菌( Colletotrichum sp. )发酵产物的深入分析表明，该菌能产生植物生长激素IAA。假单胞菌 属、肠杆菌属、葡萄球菌属( Staphylococcus) 、固氮菌属( Azotobacter) 以及固氮螺菌属( Azospirillum)内 生细菌的一些菌株也可产生植物生长调节物质如乙烯、生长素、细胞激动素,对宿主植物的生长 起促进作用。草生欧文氏菌( Erwinia herbicola)不仅能产生吲哚乙酸，而且还能产生细胞分裂素。这 些物质都能有效地促进植物的生长。从墨西哥分离的18 株重氮营养醋杆菌( Acetobacter dizotrophicus ) 都有产生生长素的能力74。表明重氮营养醋杆菌在与植物相互作用过程中不仅能固氮，而且还 可以通过生长素的调节作用影响植物的谢促进植物生长75。最近的一项研究表明，产酸克雷伯 氏菌( Klebsiella oxytoca)产生的生长素对水稻植株的生长和发育起着重要的调节作用。 n4. 与病原菌竞争营养物质 n内生菌可以与病原菌形成营养竞争的对抗关系，使病原菌因得不到正常的营养供给而消亡。某些根际定殖内生 细菌能产生噬铁素与病菌竞争铁元素，而植物并不受其影响。荧光假单胞杆菌能产生一种黄绿色噬铁素与病菌 竞争铁，导致病菌因得不到铁元素而死亡，但在铁充足的情况下，此种竞争引起的病害下降就不明显77。田新 莉等78证明水稻内生真菌在平板颉抗试验中是通过竞争铁元素来抑制纹枯病菌的生长的。 n5. 促进宿主植物生长或增强抵抗力 n感染内生菌的植物一般具有比未感染内生菌的植株生长快速的特点。内生菌可增进宿主植物对N、P、K等营养 元素的吸收。内生菌帮助植物吸收营养一个最典型的例子是内生固氮菌，1988年从甘蔗的根茎中分离到内生固 氮营养醋杆菌,后来在其它作物中如玉米、高粱、水稻等分离到内生固氮菌草螺菌，从巴基斯坦生长在盐碱地的 Kallar草中分离到固氮弧菌( Azoarcus sp. )。人们在研究这些内生固氮菌时发现有些菌类能提供植物高达80 %的氮 量79。傅正擎等80用内生菌及其代谢产物与棉花黄萎病菌共培养的方式，证明内生菌可通过促生长作用来提 高棉株的抗逆性。陈世苹等81证明，在正常条件下，感染内生真菌的黑麦草体内保护酶系统如POD、SOD的活 性明显高于未感染内生真菌的植株，并认为内生真菌很可能增强了植物的SOD活性调节能力，从而对植物的抗 旱性产生有益影响。许多研究表明，感染内生菌的植物比未感染内生菌的植物具有更强的抗干旱、盐碱等胁迫 的能力。 n6. 诱导植物产生抗性 n对这个生物防治机制，Van Loon82和Van Wees等83叙述的较为清楚。他们认为根际微生物包括在根内定殖的 微生物能诱导植物产生一种抗性，这种抗性不同于传统的系统获得性抗性( systemic acquired resistance, SAR)，命 名为诱导系统抗性(induced systemic resistance ,ISR)。ISR表型与病菌诱导的SAR相似，都能诱导植物产生对病菌的 广谱抗性。但ISR中所包含的抗性机制没有病程相关蛋白(PR)的产生。目前对ISR的抗性机制知道得不如SAR的抗 性机制清楚，一般认为ISR的抗性与植保素水平的提高和酚类物质积累有关。ISR和SAR信号传导途径是两种不同 的路径。同时内生菌能诱导植物产生一些结构方面的抗性，Benhamou等84用内生菌Bacillus pumilus strain SE34预 接种基因转化豌豆，然后接种病菌，如果病菌的生长限制在木栓层和外皮层内，在病菌企图侵入部位，通过木 质和酚类物质的大量沉积，这些细胞的胞壁得到加厚，有效阻止了病菌的侵入。 n7. 产生生物碱 n植物内生真菌可以产生多种生物碱，大多生物碱对食草动物和昆虫具有毒性，其中一些对植物病害也有防治作 用。Li等85从雷公藤( Tripterygium wilfordii)中分离到一株内生真菌( Cyptosporiopsis cf .quercina)，从其液体发酵产物中分 离到一种新酰胺生物碱(cryptocin)，对稻瘟病菌( Pyricularia oryzae)有抑制作用。Elmi等86推测感染了内生真菌的高 羊茅植株的抗线虫性与内生真菌产生的生物碱有关。 二、生态学 n1寄生方式 n专性内生菌：只能生活在寄主细胞内，而在根 际无法分离到。如红苍白草螺菌只能生活在高 梁和甘蔗组织内。 n兼性内生细菌：如假单胞菌属（Pesudomonas）、 肠杆菌属（Enterobacter）、沙雷氏军属（Sarratia ）、产碱菌属（Alcaligens）、志贺氏菌属（S higella）、檬细菌属（Citro bacter）以及革兰氏 阳性一些属的细菌，他们不仅生活在植物组织 内部，而且也常见于土壤。 n持久性：持久性的植物内生的细菌可以永久存 在于植物组织内部，也可以在整个生育期只存 在一段时间。甜菜中的腐烂棒杆菌，存在于整 个生活史中。 n非持久性：非持久性的细菌只存在于整个生活 史中的部分生长时期的植物体内。大部分植物 内生细菌属于这一类型。 n专一性：专一性的植物内生细菌它只专一存在 于一种植物体内，如重氮营养醋杆菌（ Acetobacter），它只存在于甘蔗中。 n非专一性：非专一性的植物内生细菌，如荧光 假单胞可以存在于菜豆、小麦、番茄、柠檬、 甜菜和玉米等植物体内，均已经分离出来。 n2. 入侵途径 植物内生细菌来源于根际，并从根进入植 物组织内部。内生细菌进入植物的途径是通过 自然孔口和伤口进入植物的。自然孔口有皮孔 、水孔、芽眼、侧根发生处等。把组织培养的 马铃薯无菌苗移栽到田间，从中分离出大量与 土壤中细菌种类相同的内生细菌。利用抗菌素 标记的荧光假单孢菌IS-1的菌悬液浸根，然后移 栽，八周后，取根，进行表面消毒，结果重新 分离到了IS-1。这不仅说明了内生细菌来源于根 际土壤，而且说明了一些细菌既能存在于根际 中，又能进入植株体内。 植物内生细菌可以通过趋化性或趋电性寻 找寄主植物。 n3存在部位 内生细菌进入植物后，多数定殖于薄壁组 织的细胞间隙，有些定殖于细胞质中，有些可 穿过细胞壁进入细胞内。有些定殖于维管束内 。 块薯中菌量大，种类多；块茎和地上茎次 之；种子中最少。块茎的皮层，维管束，内韧 皮部和中央髓部四个部位中，内生细菌在维管 束环的出现频率最高。 玉米和杂草的的皮层、外皮层和内皮层， 以及植株木质部中都含有大量的内生细菌。内 生细菌具有寄主专化性，且在寄主不同器官、 生育期和寄主所处的环境中，其种群数量的消 长动态各有不同。 内生细菌与植物在长期的共同进化中，已 成为植物微生态系统的天然组成成份，它促进 植物对恶劣环境的适应，加强系统的生态平衡 。植物内生细菌可以促进植物修复作用（ phytoremediation），针对硝基芳香族、杂酚类等 有机污染。 一些内生菌具有固氮作用。内生细菌系统 地存在于细胞间隙和细胞内，可从植物体内获 得充分的生长营养，具有优良的生存环境，能 稳定分布于植物体内，因此将其作为病害的生 防菌具有独特的优势。因此内生细菌作为生防 因子已从多种植物中分离出来并用于病虫害的 防治。 植物内生细菌的远距离传播主要通过 种子传播，也可以通过昆虫和动物的取食 途径传播。 n4种群数量动态 内生细菌在寄主植物中的种群数量变化与 植物的品种、组织、生长阶段、和环境条件有 关。 内生细菌在植物根部密度最高，其次是茎 和叶。从种子萌发时含量开始上升，自花期达 到最高，之后趋于平稳或降低。 棉花种子萌发时，细菌的种群密度为每克 组织含1000个菌体，成株期达到10万100万个 菌体。成熟期降到1000个菌体。棉桃中几乎没有 内生菌。 从薯块最外面所分离的内生菌中拮抗菌的 数量多、作用强，越向内部，拮抗菌的比例减 小，作用变弱。随着种薯腐烂，其中内生细菌 大量向根围释放，从而使根围的菌量显著增加 ，这必然会使更多的细菌进入植株体内。 n5. 内生菌起源 三种假说： （1）内生假说：是由植物细胞内的线粒体或 叶绿体演化而来的，因此，它们有与宿主 有相同或相近的遗传背景。 （2）外生假说：源于体外，一方面是植物体 表，一方面是植物根系通过自然孔或伤口 进入体内。 （3）病原菌演化假说：病原菌在与植物长期 的共同进化中，病原菌的毒性基因发上了 变异，由毒性菌株变化为非毒性菌株。 三、防治机制 防治机理有三种。 1. 内生菌在病原菌侵染植物之前在植物体内抢先聚 集占位。 主要发生在利用维管组织的内生菌拮抗侵染维管的病 原菌如轮枝菌（Verticillium）、镰刀菌（Fusarium）、青枯 菌属（Ralstonia）的过程中。 2. 产生抗生素直接拮抗病原菌 产生抗生素类物质是内生菌在体外进行生物控制的机 理之一。马铃薯块茎内生菌中拮抗病原菌Phytophthora infestans，Fusarium sambucinum F.avenaceum ,F. oxysporum 的抗生 素含量不同，从距离表皮越近部位分离到的内生菌抗生素 含量越高。 从棉株内分离出的两株内生细菌及其 代谢物对棉花黄萎病菌的菌丝生长及其毒 素的产生均有抑制作用。 从水稻体内分离出的内生细菌对水稻 纹枯病菌丝有抑制作用，对纹枯病菌菌核 的萌发则有强烈的抑制作用。 烟草内生细菌抑制了烟草疫霉菌丝生 长，游动孢子游动和萌发。 黄瓜的内生细菌可造成黄瓜枯萎病菌 丝生长畸形，部分细胞空泡化。 3. 诱发系统抗性 诱发系统抗性是内生菌的主要生防机理。 诱导抗性是植物被环境中的非生物或生物因子 激活产生的系统抗性，分为两类即获得性系统 抗性（SAR）和诱发性系统抗性（ISR）。 第2种和第3种机制是内生菌和病原菌在侵 染位置如根的皮层直接作用时的生物防治机理 。 SAR 是由病原微生物,二氧化硅（SiO2 ）、磷酸盐等无机物质高不饱和脂肪酸等 有机物和植物的物理性损伤引发。SAR 的 特征是宿主植物中水杨酸（salycilic acid) 浓 度增加接着植物细胞壁木质化生成植物体 内病原相关蛋白PR。 在SAR 的诱发过程中茉莉酸酮酯在第二 信号传导系统中起信号分子的作用ISR 主要 是由非病原性微生物诱发不仅宿主植物组 织内聚集的某类微生物可以引发ISR 根部细 菌产生的铁载体也可以引发ISR， salycilic acid 信号途径不参与该过程。 n利用内生菌控制植物病害的途径 n1.6.1人工接种内生菌 n可以通过人工接种方法将有防病活性的内生菌接种到植物体内，发挥内生菌的防病作用。目前常用的人工接种内生细菌的方法有3种：灌根接种法 ，用内生菌悬浮液浇灌植株根际，这种方法可以使内生菌进入植物根茎内101。浸种接种法，在播种前将宿主植物的种子在含有内生菌悬浮液中浸 泡一定时间，在生长出的植物体内可以检测到被标记的内生菌102。涂抹叶片接种法，何红等103采用这种方法可以将枯草芽孢杆菌BS22菌株接种 到多种植物体内。常用的人工接种内生真菌的方法有茎基部注射、人工侵染和愈伤组织培养等方法。中国农业大学从棉株分离的一种内生真菌( Chaetomium sp. )，经人工茎基部注射后有抑制萎蔫镰刀菌扩展的作用。用内生真菌人工侵染植物是对其利用的另一种有效手段。Latch和Christensen用5 种内生真菌进行了人工侵染实验，发现在幼苗期侵染能够实现，而成熟植株的侵染没有成功104。Johnson等用愈伤组织培养的方法进行了侵染实验 ，发现有17 %的再生植株被感染105。 n1.6.2 利用内生菌分泌的抗生素 n植物内生菌分泌的抗生素是抑制和杀死病原菌的直接作用物质，内生菌代谢产物的应用也受到了人们的注意。可以直接利用内生菌的代谢产物控制植 物病害，内生菌产生的抗生素可以作为无公害农药的又一来源。根际内生菌Pseudomonas spp.产生的一类鼠李糖脂生物表面活性剂(rhamnolipid biosurfactants) 物质，破坏腐霉菌( Pythium)卵孢子的原生质膜，引起卵孢子细胞壁的水解破裂106。对小麦全蚀病有防效的P. fluorescens CHAO能产生一 些吩嗪类(phenazine)物质。Bacillus strains能产生一些脂多肽(lipopeptide) 类抗生素对植物根部病害有显著的抑制作用106。对多种植物病害有防治作用的 P. fluorescens CHAO能产生几种毒性代谢物质，包括PCA ,HCN和PLT等107。PCA和PHL合成的相关基因簇己经被克隆，这就可以将两者的基因整合到 同一个内生细菌中，大量地合成提高生物防治效果108。 n1.6.3 作为外源基因的载体 n内生菌是构建“工程菌”的理想载体。因内生菌具有在植物体内定殖、繁殖、转 n移的特点，将某些抗病虫基因导入到内生菌中，能提高植物的抗病虫能力，而植物本身的基因并未发生改变，这样可以保持植物的天然性状。 Kostaka发现从百慕大草( Cynodon dactylon)中分离的木质棍状杆菌犬齿亚种( Clavbacter xyli subsp. cynodontis)接种到某些植物上后可以很快转移到整个植物体中 。利用这一特点将苏云金杆菌( bacillus thuringiensis)的伴胞晶体编码基因转移到这种内生细菌中，实现了对欧洲玉米螟( Qstrinia.nubilalis)的生物防治109， 减少了化学农药的使用。将苏云金杆菌基因转入蜡状芽孢杆菌( B . cereus)内，实现了对两种鳞翅目昆虫的防治110 。利用内生菌控制植物病害的途径 n1.6.1人工接种内生菌 n可以通过人工接种方法将有防病活性的内生菌接种到植物体内，发挥内生菌的防病作用。目前常用的人工接种内生细菌的方法有3种：灌根接种法 ，用内生菌悬浮液浇灌植株根际，这种方法可以使内生菌进入植物根茎内101。浸种接种法，在播种前将宿主植物的种子在含有内生菌悬浮液中浸 泡一定时间，在生长出的植物体内可以检测到被标记的内生菌102。涂抹叶片接种法，何红等103采用这种方法可以将枯草芽孢杆菌BS22菌株接种 到多种植物体内。常用的人工接种内生真菌的方法有茎基部注射、人工侵染和愈伤组织培养等方法。中国农业大学从棉株分离的一种内生真菌( Chaetomium sp. )，经人工茎基部注射后有抑制萎蔫镰刀菌扩展的作用。用内生真菌人工侵染植物是对其利用的另一种有效手段。Latch和Christensen用5 种内生真菌进行了人工侵染实验，发现在幼苗期侵染能够实现，而成熟植株的侵染没有成功104。Johnson等用愈伤组织培养的方法进行了侵染实验 ，发现有17 %的再生植株被感染105。 n1.6.2 利用内生菌分泌的抗生素 n植物内生菌分泌的抗生素是抑制和杀死病原菌的直接作用物质，内生菌代谢产物的应用也受到了人们的注意。可以直接利用内生菌的代谢产物控制植 物病害，内生菌产生的抗生素可以作为无公害农药的又一来源。根际内生菌Pseudomonas spp.产生的一类鼠李糖脂生物表面活性剂(rhamnolipid biosurfactants) 物质，破坏腐霉菌( Pythium)卵孢子的原生质膜，引起卵孢子细胞壁的水解破裂106。对小麦全蚀病有防效的P. fluorescens CHAO能产生一 些吩嗪类(phenazine)物质。Bacillus strains能产生一些脂多肽(lipopeptide) 类抗生素对植物根部病害有显著的抑制作用106。对多种植物病害有防治作用的 P. fluorescens CHAO能产生几种毒性代谢物质，包括PCA ,HCN和PLT等107。PCA和PHL合成的相关基因簇己经被克隆，这就可以将两者的基因整合到 同一个内生细菌中，大量地合成提高生物防治效果108。 n1.6.3 作为外源基因的载体 n内生菌是构建“工程菌”的理想载体。因内生菌具有在植物体内定殖、繁殖、转 n移的特点，将某些抗病虫基因导入到内生菌中，能提高植物的抗病虫能力，而植物本身的基因并未发生改变，这样可以保持植物的天然性状。 Kostaka发现从百慕大草( Cynodon dactylon)中分离的木质棍状杆菌犬齿亚种( Clavbacter xyli subsp. cynodontis)接种到某些植物上后可以很快转移到整个植物体中 。利用这一特点将苏云金杆菌( bacillus thuringiensis)的伴胞晶体编码基因转移到这种内生细菌中，实现了对欧洲玉米螟( Qstrinia.nubilalis)的生物防治109， 减少了化学农药的使用。将苏云金杆菌基因转入蜡状芽孢杆菌( B . cereus)内，实现了对两种鳞翅目昆虫的防治110 。 n四、生防菌的分离方法 n1.内生菌的分离 （1）材料 采集不同地区、不同品种的苗期、开花期、 荚果膨大期的无病株和种子。 （2）分离用培养基 a采用牛肉膏蛋白胨固体培养基分离细菌 b采用PDA培养基分离真菌 c采用高氏1号培养基分离放线菌 （3）分离方法 a. 取无病株或种子，先用水冲洗干净，然后 在0.1%十二烷基苯磺酸钠中浸泡30min，再用水 冲洗干净，然后随机称取根、茎、叶各5g，纱 布包裹，以下工作在超净工作台上进行。 b. 包裹好的材料浸入0.1%的HgCl2中消毒 18min，再用无菌水冲洗34次。取0.2ml最后1 次无菌水冲洗液涂布接种于3种分离培养基上， 每个处理重复3次，培养48h，观察有无菌落产 生。据此验证此消毒方法是否能全部杀死供试 材料表面微生物。 c. 然后供试材料转入无菌研钵中研磨匀浆 ，加入5ml生理盐水，搅匀。以此为母液，稀释 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5 5个梯度菌悬液。然 后分别取0.2ml加入3种分离培养基中进行内生菌 的分离，每个处理重复3次。 分离方法及步骤 不同部分内生菌分离纯化 活性菌株 发酵液和菌丝体 提取物生物活性测 活性测定 活性最高的菌株 菌株鉴定活性成分分离 活性成分鉴定 n2.表面消毒效果的常用检验方法 有两种 (1) 漂洗液检验法，即把最后一次漂洗灭菌材料的漂洗液吸 取0.20.3ml涂布于固体平板上。 (2) 组织印迹法，即把经灭菌、无菌水漂洗过的材料置 于 固体平板上保留几分钟，然后移去样品。于28培养48小时，检 查表面消毒是否彻底。 n3.纯化与鉴定 按常规方法对分离出的菌落进行纯化，以供鉴定和保藏。对细菌 和真菌一般要鉴定到属，常见属鉴定到种。 1.小麦内生细菌 菌株对小麦全蚀病菌的抑制作用 菌株的革兰氏染色情况（G-） 2.黄瓜内生菌 病菌的抑制效果 分离菌株对苹果腐烂 分离菌株对棉花枯萎 病菌的抑制效果 菌株产-1,3葡聚糖酶的皿内情况菌株对油菜菌核病菌的抑制效果 第五节 内生放线菌 一、内生放线菌 植物内生放线菌有： n 根部结瘤的弗兰克氏菌（Frankia） n一个放线菌新属（Actinosynemma）。 玉米根叶中分离出放线菌主要为： n小双孢菌 n链霉菌 n链孢囊菌。 链霉菌最多(n=482)，链轮丝菌(n=2), 诺卡氏 菌(n=4),小单孢菌(n=1) 链孢囊(n=1)。 n二、分离方法 n.组织表面消毒 消毒剂： n次氯酸钠 n环氧丙烷气 n过氧乙酸 n升汞 n硝酸银等 大多数的内生菌分离采用升汞或次氯酸钠，但是不 同文献中使用的浓度和处理的时间不同。目前的内生菌 分离方法没有考虑专性内生菌以及处于休眠状态的内生 菌。因此，都有一定的局限性。 n培养基 使用不同的培养基和在培养基中添加不同 的抗生素来实现，这些选择剂的添加是必要的 。因为内生真菌的生长一般比内生放线菌快， 容易在分离培养皿中过量生长。 选择性培养基： 主要是以淀粉为碳源，酪蛋白为氮源，加以制 霉菌素、放线菌酮等抗真菌化合物以促进放线 菌的生长，但是多数研究是为了了解内生放线 菌的群落生态组成，因此只选用一种或几种分 离培养基。 干热等用于提高土壤中放线菌分离数量， 预处理方法也可以用于植物组织。 n分离困难的主要原因 弗兰克氏分离困难主要原因在于： （1）一般离体培养需要23 周或更长时间 （2）土壤中含有快生型的微生物如细菌腐生放 线菌或真菌等弗兰克氏菌生长缓慢很难获得纯 种 （3）内生菌作为共生菌离体培养后菌体由共生 代谢型转变为腐生代谢型因此营养条件需求很 苛刻 （4）在离体培养过程中植物组织释放出抑制菌 体生长的多酚化合物使弗兰克氏菌在体外培养 过程中难以生长。 第六节 内生真菌 一、概述 1993年，美国化学家Stierle和植物病理学家 Strobel从短叶红豆杉（Taxus brevifolia）的韧皮部 分离到一株产紫杉醇的内生真菌（Taxomyces andreanae）。通过采用质谱、色谱和放射性化学 标记等方法, 证明分离到的真菌的3周培养物中 存在紫杉醇及其类似物，含量为24-50 ng/L。 随后，我国陆续从多种红豆衫属植物（ Taxus spp）中分离到许多产紫杉醇的内生真菌 ，对解决紫杉醇严重紧缺开辟了一条新路。 自此，人们开始关注内生真菌的次生代谢 产物及其生物活性。 1. 内生真菌主要种类: n一类是麦角菌科：系统侵染性草生内生菌 ，多与寄主形成互惠共生； n另一类非麦角菌科：树木、灌木及草本植 物上的内生菌。 相对内生细菌来说, 植物内生真菌的 研究尚缺乏一定的系统性。 n大多数植物内生真菌属于子囊菌类（ Ascomycetes）, 包括 n核菌纲 （Pyrenomyetes） n盘菌纲（Discomyetes） n腔菌纲 （Loculoascomyetes）的许多种类以及它 们的一些衍生菌。 n禾草类内生真菌与其它无处不在的内生真 菌的区别，在于它们和寄主植物形成了非 常密切的关系，至今全世界至少在调查过 的80个属290多种的禾草中发现有与之共 生的内生真菌。 2. 内生真菌存在部位： 宿主植物的叶鞘和种子中含量最多， 而叶片和根中含量极少。 不同组织内生真菌的数量存在差异 。老叶的组织分离率为34，新叶组织分 离率为20，老树皮为25，根和果实的 组织分离率最低，分别为16和14 。 3. 内生真菌的生物活性代谢产物： 生物碱、萜类、甾体等化合物，在抗癌症 药物、抗肿瘤类药物、抗生素类药物等， 且取得了令人振奋的成绩。 1 生物碱类 植物内生真菌产生的生理活性物质中，生物碱是最重 要的一类。 n以香柱菌属（Epichloe）（其无性型为Neotyphodium属）内生 真菌研究得较多，如从高羊矛、黑麦草和其它禾本科植物 的茎叶中分离到的内生真菌Neotyphodium coenophialum、N. lolli， Epichloe festucae和E. typhina，对其进行发酵培养，从发 酵液中分离到Peramine ，它具有杀虫活性，但对哺乳动物 无毒性。 n此外，在Neotyphodium属内生真菌发酵液中发现一些麦角生 物碱类化合物，这类化合物对昆虫和食草哺乳动物具有神 经毒性，如Ergovaline ，它与家畜食用内生真菌侵染的高 羊矛中毒有关。 n细胞生长素吲哚乙酸（IAA）属于吲哚类生物碱 ，具有促进植物生长的作用，在烟草中分离出 来的内生真菌麻饼炭团菌（Hypoxylon serpens）发 酵液中发现了这种化合物。6-Isoprenylindole-3- carboxylic acid 是一种新发现的吲哚类生物碱， 它对革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 、藤黄八叠球菌（Sarcina lutea）和革兰氏阴性细 菌假单胞菌（Pseudomonas sp.）均具有抑制作用。 此外，该化合物对一些植物病原真菌辣椒疫霉 （Phytophthora capisici）、禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis）和禾顶囊壳小麦变种（Gaeumannomyces graminis var. tritici）有抑制活性。 在苇状羊茅（Festuca arundinacea）的内生真 菌N.coenophialum中发现黑麦草碱（Loline），它属 于吡咯烷生物碱类化合物，是一种广谱的杀虫 剂。 从香港红树（Avicennia marina）种子中分离 出的内生真菌2524号，其发酵液中分离到两个神 经酰胺：( 2， 3- dihydroxytetracosanolyamino ) - 1， 3 - dihydroxy - octadecane (4)和( 2，3- dihydroxydocosanoylamino ) - 1，3 -dihydroxy - octadecane ，它们是细胞内重要的第二信使化合 物。 从苏格兰松树（Pinus sylvestris L.）的茎尖组织中分离 到内生真菌Rhodotorula minuta，它可以产生一种腺嘌呤衍 生物，这种衍生物是植物细胞分裂素生物合成的前体， 具有恢复愈伤组织生长并防治褐化的作用。 长春花（Catharanthus roseus）内生真菌CY3代谢产生 长春新碱（Vicristine），长春新碱是一种有效的抗肿瘤 药物。从美登木（Maytenus hookeri）中分离筛选到一株球 毛壳菌（Chaetomium globosum），它可以产生抗癌化合物 球毛壳甲素（Chaetoglobosin A ）。 2 萜类 内生真菌代谢产物中萜类化合物较多。 n主要包括倍半萜和二萜两种。 n在短叶紫杉（Taxus brevifolia）内生真菌Pestalotiopsis spp.发 酵液中发现五种倍半萜类代谢产物，其中17是第一个来 源于真菌的具有生物活性的葎草烷衍生物。 n从叶点霉属（Phyllosticta sp.）内生真菌中分离得到的 Heptelidic acid 和Hydroheptelidic acid 是倍半萜类化合物， 它们对云杉蚜虫幼虫具有毒性。 n雷公藤（Tripterygium wilfordii）中内生真菌串珠镰孢胶孢变 种（Fusarium moniliforme var. subglutinans）代谢物中存在 Subglutinol A 和Subglutinol B 两种二萜类化合物，它们具 有免疫抑制作用，且没有细胞毒性。 n3 甾体类 n黄花蒿（Artemisia annua）内生真菌炭疽菌（Colletotrichum sp.）的液体培养基中发现3-Hydroxyergosta - 5 ene 、3 - Oxoergosta - 4， 6， 8 ， 22 - tetraene 、3， 5- Dihydroxy - 6 - acetoxyergosta - 7，22 - diene 和3， 5- Dihydroxy - 6 - phenyl -caetoxyergosta -7， 22 - diend 四种 甾体化合物，它们对植物病原菌禾顶囊壳小麦变种（ Gaeumannomyces graminis var. tritici）、禾谷丝核菌（ Rhizoctonia cerealis）、麦根腐长蠕孢菌（Helminthosporium sativum）和辣椒疫霉（Phytophthora capisici）表现出抗菌活 性. n4 其它活性物质 n内生真菌代谢产物种类较多，其他活性物质还包括醌类 、环肽、脂肪酸类等。 nRugulosin 是一类具有杀虫活性的苯醌类化合物，它是从 冷杉（Abies balsamea）内生真菌Hormonema dematioides中分离 得到的。 n白灰制菌素A（Leucinostatin A）是一个具有抗癌和抗菌 活性的化合物，最初是从青霉菌（Penicillium sp）中分离 得到的，在欧洲紫杉（Taxus baccata）的内生真菌 Acremonium sp.，发酵液中也发现这种细胞毒素。 nEchinocandins A 、B 、D和H是四种具有抗菌活性的内生 真菌代谢产物，他们是从Cryptosporiopsis sp.和Pezicula sp.中 发现的。 n从栎树（Quercus sp.）的内生真菌Cytonaema sp.中分离到两 种新的异构体Cytonic acid A 和Cytonic acid B ，它们可以 作为人细胞肥大病毒蛋白酶抑制剂。 nCryptocandin 是内生真菌Cryptosporiopsis cf. quercina的代谢产 物，具有抗真菌的活性。 n从来自不同地方的植物中分离出500株内生真菌，其中17 株发酵液提取物具有杀线虫活性，确定活性最强的成分 为3-羟基丙酸（3-Hydroxypropionic acid）。 n紫杉醇(Taxol)：一种头孢菌素类抗癌药物 ，它发现于植物的树皮中，其含量非常之 小，远远不能满足人们的需求。 n植物内生菌次生代谢产物的多样性为人类 突破植物资源周期长、产量低、不可再生 等限制，利用植物内生菌工业发酵生产重 要的药物开辟了新途径，具有极大的应用 价值和开发潜力。 n n植物内生真菌是应用前景非常广阔微生物的资 源：80%的植物内生真菌对细菌，真菌，藻类， 杂草等其中一种或多种有作用；而土壤中分离 的真菌只有64%的有活性，对135株内生真菌次 生代谢产物研究表明，有51%的为新结构，而土 壤中分离的为38%。 n大多数植物在其生长过程中都会受到几种甚至 几十种病原菌的侵袭，而银杏在生长过程中很 少发生病害。这一现象显示银杏可能具有某种 机制抵抗病原菌的侵染，这种机制是否与其体 内内生真菌的次生代谢产物有关。 n内生真菌拟盘多毛孢（Pestalotiopsis spp.）和盘单毛孢（ Monochaetia sp.）中得到有抗真菌活性的Ambuic酸，在极 低浓度下对多种真菌有强烈的抑制；蒿属植物（ Artermisia annua）的内生炭疽菌中分离到10种抗生物质。 n内生真菌（endophytic fungi）：能增强宿主植物抗逆性。从 植物的根、茎、叶中分离到了很多植物内生真菌（ endophytic fungi），通过改良的培养基筛选，其中部分内生 真菌能够产生与宿主相同或相似的药用活性成分。 n内生真菌与植物建立和谐关系，并不引起明显的病害症 状的真菌。内生真菌可以从宿主中吸收营养供自己生长 需要，同时也可以促进宿主植物的生长发育，在植物体 内与宿主互惠共生，协同进化。 n某些内生真菌可产生：吲哚乙酸（IAA）、细胞 分裂素、细胞松弛素等植物生长调节物质；麦 角菌科的系统性草生菌产生强力抗食草动物的 生物碱；许多内生真菌在培养时产生的化合物 对人类及植物的病原细菌和真菌有抗生作用。 内生真菌可能定殖于非常特殊而敌对的微生境 中，作为新的次生代谢产物的潜在来源。 n木生内生真菌（xylotropic）表现抗生活性的比例 明显高于其它类群。内生真菌产生细胞壁分解 酶，用来克服寄主防御异物的天然屏障，还可 产生果胶酶、脂酶、纤维素酶、酯酶等胞外酶 ，但对淀粉的利用却相当受限制。 n近十年来，在利用植物内生真菌开辟抗肿 瘤药物新途径方面研究进展较快。从桃儿 七（Sinupodophylum emodi）、四川八角莲（ Dysosma veitchii）和中华山荷叶（Diphylleia sinensis）中都分离到产鬼臼毒素的内生真 菌17-19；郭波等从长春花茎的韧皮部分 离到一株产长春新碱的内生真菌-尖孢镰 刀菌（Fusarium oxysporium）；张玲琪等从 美登木（Mytenus hookeri）的老叶中分离筛 选到一株产球毛壳甲素的内生真菌-球 毛壳菌（Chaetomium globosum）。 n另外，近年的研究发现，植物内生真菌还 能产生其它的具有潜在价值的活性代谢产 物，如产生抑制菌核病菌和灰霉病菌的抗 真菌剂-Cryptocandin的内生真菌 Cryptosporiopsis quercina 、产生具有免疫抑制 活性物质-次粘霉醇的内生真菌-亚粘团镰 刀菌（Fusarium subglutinans）。 内生真菌的生物多样性为我们提供了 一个巨大的真菌资源库, 这些内生真菌必 能产生众多的代谢产物，这些产物可能对 我们的工农业生产，人类健康具有重要的 价值，因此，对其代谢产物的研究和利用 具有巨大的潜在的经济效益和社会效益。 n5 展望 植物种类繁多，还有许多内生真菌尚未被研究，相 信植物内生真菌在合成具生物活性代谢产物方面将具有 很大的潜力。我们一方面可以从众多的内生真菌中寻找 生物活性化合物；另一方面对已知产生活性成分的内生 真菌进行遗传改良和代谢调控的研究，有效地提高活性 成分的产量和含量，为大规模生产创造条件；还可以对 内生真菌中的生物活性化合物进行结构修饰，有效地提 高化合物的活性，或者为化学合成提供先导结构，在医 药、农业等领域发挥更大的作用。 第七节 重寄生真菌 n一、重寄生菌的种类 重寄生菌包括： n 真菌 n放线菌。 n1. 木霉菌 Weindling发现木霉菌(Trichoderma spp.) 能寄生多种土传植物病原真菌。常见的有 哈茨木霉(T.harzianum)和钩木霉(T.hamatum)。 木霉菌可寄生于18个属中的29种植物病原真 菌： 核盘菌属(Sclerotinia) 长孺孢属(Helminthosporium) 镰刀菌属(Fusarium) 蜜环菌属(Armillaria) 炭疽菌属(Colletotrichum) 丝核菌属(Rhizoctonia) 轮枝孢属(Verticillium) 黑星菌属(Venturia) 内座壳属(Endothia) 腐霉属(Pythium) 疫霉属(Phytophthora) 间座壳属(Diaporthe) 黑星孢属(Fusicladium) 顶囊壳属(Gaeumannomyces)等。 木霉菌的菌丝可以沿着寄主菌丝生长，或者 缠绕在寄主菌丝上生长，从而导致寄主菌丝的 死亡。木霉菌从寄主菌丝中吸取营养物质而生 长繁殖，寄主菌产生的凝集素是木霉菌与寄主 菌之间识别的关键物质，木霉菌的寄生能力与 其分生孢子和凝集素的特异反应有关。 国外已经登记的木霉菌制剂为16种，其中 包括哈茨木霉菌(T.harzianum)12个，多孢木霉菌 (T.polysporum)1个，绿色木霉菌(T.viride)1个，其它 木霉菌2个。多数用于植物土传病害的防治，主 要是土壤处理和种子处理。在土壤处理中，与 各种肥料混合使用，如各种堆肥和绿肥。在种 子处理中，以包衣等处理方式为主。 n2. 绿粘帚菌(Gliocladiumviens) 它可以寄生于多种土传植物病原菌，如腐 霉菌(Pythiumspp.)、立枯丝核菌(R.solani)和齐整小 核菌(S.rolfsii)等。绿粘帚菌的菌丝缠绕其寄主菌 ，然后分泌酶来破坏寄主菌的菌组织，同时分 泌一种广谱性抗生素胶霉毒素(gliotoxin)来 杀死寄主菌。 n3. 头状茎点霉(Phomaglomerata)和白粉寄生孢 (Ampelomycesquisqualis) 这两种菌都可以寄生于白粉菌，但寄生方 式有所不同。 头状茎点霉能够以次生菌进入寄主植物组 织中腐生，从腐生真菌或植物病原菌上获得营 养，它的分生孢子器直接产生在寄主植物的表 面，从而降低了寄主菌分生孢子产生的机会。 白粉寄生孢在寄主菌的分生孢子梗中产生 分生孢子器，影响了白粉菌产孢细胞的形成以 及随后分生孢子的产生，从而降低了致病白粉 菌接种体的数量。白粉寄生孢已作为一种商品 生物制剂应用于防治葡萄白粉病 (Uncinulanecator)和其它白粉病。 n4. 寡雄腐霉(Pythiumoligandrum) 该菌能够寄生于立枯丝核菌、终极腐霉(P.ultimum)、 刺腐霉(P.spinosum)和畸雌腐霉(P.irregulare)。寡雄腐霉对 立枯丝核菌的寄生以菌丝寄生为主。菌丝产生 大量分枝而侵入寄主菌，不形成吸器和附着胞 等侵染结构。侵入后部分菌丝在寄主菌的菌丝 内扩展;部分菌丝会穿过寄主菌丝，使其原生质 释放出来，受侵染的菌丝顶端停止伸长，最终 萎缩死亡。 n5. 锈生座孢菌(Tuberculinavinosa) 锈生座孢菌主要寄生于梨胶锈菌 (Gymnosporangiumharaeanum)的锈子器及其附近，锈生 座孢菌的分生孢子座将梨胶锈菌的锈孢子牢牢 地封在锈子器内，最终使其消解，从而减少了 锈孢子的侵染机会。 n6. 念珠镰刀菌(Fusariummoniliform) 可以寄生危害鞘锈菌(Coleosporiumspp.)，以寄生在夏孢 子堆上为主。被寄生的夏孢子堆上长满米黄色的菌丝，用 高倍显微镜可观察到夏孢子几乎无色透明;有些夏孢子残 缺不全，在成堆的孢子内，能见到一些菌丝和镰刀菌的小 型分生孢子和大型分生孢子。镰刀菌的寄主使鞘锈菌的夏 孢子失去了活性，从而减少了夏孢子产生的机会。 n 对寄生于莴苣小菌核菌(Sclerotiumminir)的细顶棍孢霉 (Sclerotiniasclerotiorum)和寄生于大丽轮枝菌(V.dahliae)的黄色黄