生化试验大纲ZZ.doc

题型：名解 问答 计算，名解考书上有的，最好看一下ppt，蓝白筛的以ppt为主，问答考原理，步骤 大纲，实验设计（如克隆胰岛素基因怎么做），计算考蛋白质浓度计算，lambert-Beer定律（注意稀释倍数），酶动力学分析的km值和双导数法，酶切实验酶切带大小生物化学与分子生物学基本实验技术基本操作(一)目的要求：掌握：分光光度法的基本原理及波长的选择；利用标准管法计算待测溶液的浓度；离心原理熟悉：生物化学与分子生物学实验基本操作：常用玻璃仪器的洗涤、干燥的使用及移液器；7220型分光光度计；台式离心机的使用了解：生物化学与分子生物学实验须知及安全措施（二）学时安排：1学时（三）教学内容：1.关键词：分光光度法：根据物质对光的吸收特性和吸收强度，对物质进行定性和定量的分析方法摩尔消光系数：指在一定波长下，C=1mol/L，L=1cm时的吸光度。百分消光系数：指在一定波长下，C=1g/100ml,L=1cm时的吸光度。标准曲线：又称校正曲线或工作曲线，是比色分析法中不可缺少的步骤，从浓度-光密度值直线的直线特性，可判断所采用方法的成色反应是否符合Lambert-Beer定律Lambert-Beer定律： Lambert-Beer 定律是说明物质对单色光吸收的强弱与吸光物质的浓度（C）和 液层厚度（l）间的关系的定律，是光吸收的基本定律，是紫外-可见光度法定量的基础。实验一蛋白质定量分析技术(一)目的要求：掌握：几种测定蛋白质浓度的原理和方法、优缺点及操作注意事项；标准曲线的绘制；利用标准曲线或者吸光系数（消光系数）进行换算，求待测溶液的浓度熟悉：标准曲线的作用。(二）学时安排：5学时(三）教学内容：1.关键词：双缩脲反应：双缩脲在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应2.主要教学内容：（1）双缩脲法：原理：蛋白质分子中含有许多肽键在碱性溶液中能与Cu2+反应生成紫红色化合物，在1-10mg/ml的范围内，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比。优点：操作简便、迅速，受蛋白质种类性质的影响较小缺点;灵敏度差，特异性不高，除与-CONH-由此反应外，还与-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团有此反应。试剂：蛋白质标准液、待测血清样本、生理盐水、双缩脲试剂紫外分光光度法：原理：蛋白质分子中含共轭双键的酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸，其吸收高峰在280nm处，但核酸在280nm处也有一定吸收能力，其吸收峰最大值在260nm处，经经验公式校正，可推算出蛋白质的真实含量。优点：操作简便、迅速，蛋白质不损失，可回收缺点;结果不准确，仅可作为粗略的测定方式试剂：血清样本、生理盐水BCA法：原理：碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合两个BCA分子，试剂从原来的苹果绿变成紫色复合物，在一定范围内，颜色深浅与蛋白质成正比。优点：操作简便、快速，灵敏度高，准确，试剂稳定，经济实用，抗干扰能力强。缺点：反应时间长且蛋白质也会发生不可逆的变性。试剂：蛋白质标准液、待测样本、双蒸水、BCA工作液主要方法：1.配比好各管试剂，混匀。2.置水浴保温一段时间。3.用波长比色，以空白管调零，读取各管光密度值。实验二酶动力学分析技术（一）目的要求：掌握：米氏常数测定的原理和方法；碱性磷酸酶活性的测定方法和注意事项；可逆抑制剂类型中，抑制剂、底物、酶三者的相互关系及测定方法熟悉：底物浓度曲线（双矩形曲线）和双倒数曲线的作图方法及利用图解法求得Km值和Vmax值；验证抑制作用的类型，并计算Ki值（二）学时安排：5学时（三）教学内容：1.关键词：酶促反应动力学：研究各种因素对酶促反应速率的影响，并加以定量的阐述。米曼氏方程：表示酶促反应中反应速率与底物浓度关系的数学方程式。Km：酶促反应达到其最大速度Vm一半时的底物浓度竞争性抑制：有些抑制剂与底物结构相似或部分相似，可与底物共同竞争与酶的活性中心结合而抑制酶的活性，表现竞争性抑制作用，该种抑制方式称为竞争性抑制，为可逆性抑制。双倒数作图法：即林-贝氏作图法，为求得Vmax和Km的最常用方法，即将米曼氏方程的两边同时取倒数，并加以整理，即得出一线性方程式，以1/V对1/S作图得纵轴截距为1/Vmax，而横轴截距为-1/Km的直线2.主要教学内容：（1）米氏常数测定的原理：在酶促反应中，当反应体系的温度、 pH及酶浓度恒定时，底物浓度对反应速率的影响呈矩形双曲线关系，AKP催化磷酸苯二钠水解产生游离酚和磷酸盐。酚在碱性溶液中与4-氨基安替吡啉作用，经铁氰化钾氧化，可生成红色的醌衍生物。；碱性磷酸酶活性的测定方法：1.各管底物、缓冲液、蒸馏水配比好，37水浴保温5min 2.加入酶液，混匀后置于37水浴准确保温15min，保温后立即加入碱性溶液终止反应。3.各管加入4-氨基安替吡啉和铁氰化钾，混匀静置，以空白管调零，于波长处比色，测定各管吸光度。和注意事项：试剂滴加和水浴加热时间准确性十分重要。（2）底物浓度曲线（双矩形曲线）：以吸光度为纵坐标，底物浓度为横坐标和双倒数曲线：以1/A为横坐标，以1/S为纵坐标的作图方法，各管吸光度与其酚含量成正比，故可用吸光度来代表酶促反应速度。竞争性抑制剂非竞争性抑制剂反竞争性抑制剂原理E不同时与底物和抑制剂结合，不形成EISE可形成EIS，但不进一步转变为产物抑制剂必须在酶和底物结合后才与酶结合形成EIS鉴别特点Vm不变，KmVm，Km不变Vm，Km（3）酶抑制剂型别的判定及测定原理和方法实验三蛋白质的分离、纯化与鉴定（一）目的要求：掌握：蛋白质的分离、纯化与鉴定、层析技术、电泳技术、分子印迹技术的原理、方法及操作技术；盐析法、凝胶通透层析法、离子交换层析法实验方法原理及操作技术；醋纤薄膜电泳分离血清蛋白、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量、Western blotting检测血清IgG的实验方法原理及操作技术熟悉：蛋白质分离提纯的总体思路；层析法的分类；常用的层析技术；混合物在凝胶通透层析柱中的洗脱行为和分配系数；聚丙烯酰胺凝胶的性能、制备原理；聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用；SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳、Western blotting的操作方法及注意事项（二）学时安排：19学时（三）教学内容：1、关键词：层析法：又称色谱法，是一种重要的分离分析手段，利用混合物中各组分的吸附力、带电性、相对分子质量、极性或生物活性等差异，当固定相和流动相相对运动时，使各组分在两相中反复多次受到溶解、析出、吸附、脱附等作用从而以不同速度相对固定相移动而达到分离。电泳：带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向运动，称为电泳。分配系数：指一定温度下，处于平衡状态时，组分在流动相中的浓度和在固定相中的浓度之比，以K表示。洗脱体积：洗脱时间是指从加样开始到检测器检测出峰所经过的时间。在这期间内流出的洗脱液体积称为洗脱体积。 迁移率：带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度称为迁移率。电渗作用：有些支持物为多孔结构，多孔支持物表面可吸附电极溶液中的正离子或负离子使靠近支持物的溶液层相对带电，在电场作用下，溶液就会向一定方向移动。这种在电场作用下液体对固体支持物相对移动的现象称为电渗。分子筛：凝胶支持物结构的孔隙对带电颗粒分子产生阻力，分子大的在凝胶中泳动速度慢，分子小的泳动速度快。等电点（pI）：在某一PH的溶液中，氨基酸或蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势或程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液的pH成为该氨基酸或蛋白质的等电点。凝胶总浓度：用T%表示，即100毫升凝胶溶液中所含Acr和Bis的总克数。（PS：T%愈大则胶愈硬也易脆裂，T%过小，则胶稀软不易操作。）交联度：用C%表示，即Bis占Acr和Bis总克数的百分数。（PS：C%过高不仅胶变脆缺乏弹性且透明度降低；C%过低则胶聚合不良呈糊状。）印迹术：将各种生物大分子从凝胶转移到一种固定基质上的过程叫做印迹技术。2、主要教学内容：（1）蛋白质的分离、纯化及盐析法（向蛋白质溶液中加入某些浓的无机盐如(NH4)2SO4或Na2SO4溶液后，可以使蛋白质凝聚而从溶液中析出，这种作用就叫做盐析。）的实验方法原理及操作技术（2）层析技术层析技术的基本概念：又称色谱法，是一种重要的分离分析手段，利用混合物中各组分的吸附力、带电性、相对分子质量、极性或生物活性等差异，当固定相和流动相相对运动时，使各组分在两相中反复多次受到溶解、析出、吸附、脱附等作用从而以不同速度相对固定相移动而达到分离。层析法的分类：按两相的物态分：流动相固定相总称层析名称气体固体气相层析气-固层析（GSC）液体气-液层析（GLC）液体固体液相层析液-固层析（LSC）液体液-液层析（LLC）按固定相所处形式：柱层析（CC）、纸层析（PC）、薄层层析（TLC）按层析的分离机制：吸附层析法、分配层析、离子交换层析、凝胶层析法、亲和层析，其他：如金属螯合层析等常用的层析技术；凝胶通透层析法、离子交换层析法的原理、方法、操作技术及混合物在凝胶通透层析柱中的洗脱行为和分配系数（3）血清-球蛋白的分离纯化与鉴定的实验原理：1.盐析法：利用清蛋白和球蛋白在高浓度中性盐中溶解度的差异，将球蛋白沉淀析出。2.凝胶层析法：利用蛋白质和无机盐间分子质量的差异，将小分子的盐洗脱出来3.DEAE纤维素阴离子交换层析柱：利用各种球蛋白间等电点的差异，将-球蛋白洗脱出来。方法、操作：盐析脱盐（装柱-上样-洗脱-收集-蛋白质和NH4+的检查）纯化（装柱-上样-洗脱-收集-蛋白质的检查）浓缩纯度测定分子质量测定免疫学活性鉴定及注意事项（4）电泳技术电泳技术的基本原理、分类及影响电泳的因素；醋纤薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理、方法及应用；聚丙烯酰胺凝胶的性能、制备原理；聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳的实验原理、方法、应用及鉴定血清球蛋白的分离纯度、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的实验原理、方法、应用及鉴定血清球蛋白的分离纯度并测定其分子量1. 分子印迹技术Western blotting的基本原理、方法、应用及操作注意事项并检测血清球蛋白中IgG轻链和重链（6）实际操作：1）血清-球蛋白的分离纯化与鉴定（计划学时数：9学时）1.盐析：血清+生理盐水+饱和硫酸铵，静置、离心，倾去含清蛋白的上清液，+生理盐水+饱和硫酸铵，静置、离心，倾去上清液，+磷酸盐缓冲液，使之溶解，得粗提-球蛋白溶液2.脱盐：凝胶柱层析（1）.装柱：凝胶表面盖一圆形滤纸，床面保持有洗脱液。（2）.上样与洗脱：缓冲液液面刚好下降至凝胶床表面，5滴/min滴加，+少量缓冲液，洗净内壁及洗脱，每管收集1ml.（3）.蛋白质和NH4+的检查:蛋白质：黑色底的比色板，20%磺基水杨酸2滴，出现白色浑浊或沉淀；NH4+:奈氏试剂1滴，出现黄色浑浊或沉淀。3.纯化：DEAE纤维素阴离子交换层析4.浓缩：取纯化的中段-球蛋白+葡聚糖凝胶G-25干胶，摇动、离心5.纯度鉴定：分别对血清和纯化后的-球蛋白液进行乙酸纤维薄膜电泳法测定（点样：点在膜粗面点样线上电泳：点样端在阴极染色定量：紫外分光度法）6.分子质量测定：SDS-PAGE7.免疫学活性鉴定：western blotting2）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量（计划学时数：5学时）原理：SDS与蛋白质混合，重量比达到1.4:1时，使蛋白质变性解离成单一亚基，形成SDS-蛋白质负离子，电泳时，蛋白质的迁移率和相对分子质量的对数呈直线关系B液：PH=6.8 C液：PH=8.8操作：凝胶制备加样电泳染色脱色测定注意事项：1.凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶。2.多余的上样槽不能空，加入等量上样缓冲液3） Western blotting检测血清IgG（计划学时数：5学时）原理：经SDS-PAGE,将待测样品转移到固相支持体上（常为NC膜），膜可与抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）反应，后可与有标记的二抗结合进行检测，本实验直接使用辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体直接检测人血清IgG，无需使用抗体，漂洗后可加入生色底物进行特异性显带。操作：SDS-PAGE组装：正极-海绵-3层滤纸-NC膜-凝胶-3层滤纸-海绵-负极（胶负膜正）拆下装置，用考马斯亮蓝染液染色，检查蛋白质转移是否完全；用丽春红S对NC膜染色至蛋白带出现NC膜放入塑料袋，加入封闭液，摇床温浴将封闭过的NC膜放入另一袋中，加抗体稀释液，摇床将NC膜转移至盛有漂洗液的托盘上，摇动漂洗三次加入生色底物，一旦蛋白带的颜色达到要求，立即取出NC膜实验四物质代谢及调节的研究(一)目的要求：掌握：激素对血糖浓度影响的实验方法及调节熟悉：小鼠断尾取血、腹腔注射药物的基本操作要点及注意事项；葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度的原理了解：胰岛素与肾上腺素对小鼠血糖浓度影响的实验设计；糖尿病患者对三大代谢的影响及调节（二）学时安排：5学时（三）主要教学内容：1、关键词：血糖：指血中的葡萄糖。正常人血糖浓度为3.896.10mmol/L(70110mg/dl)葡萄糖氧化酶法测定血糖，胰岛素、肾上腺素对血糖的影响（个人认为不会出名解）2、主要教学内容：（1）体内血糖的来源与去路激素对血糖浓度的影响的实验方法及调节（2）胰岛素与肾上腺素对小鼠血糖浓度影响的实验设计及操作（3）葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度的原理及操作注意事项原理：葡萄糖氧化酶利用空气和水催化葡萄糖分子中的醛基氧化，生成葡萄糖酸并释放过氧化氢。过氧化氢酶在有氧受体时，将过氧化氢分解为水和氧。后者将还原性氧受体4-氨基安替吡啉和酚氧化，缩合生成红色醌类化合物。醌的生成量与葡萄糖量成正比。因此。将测定样品与经过同样处理的葡萄糖标准液进行比色，即可计算出血糖的含量。注意事项：由于温度对本实验影响较大，水浴时应严格控制温度，防止酶活性丧失。（4）实际操作：胰岛素与肾上腺素对小鼠血糖浓度的影响实验五质粒DNA的提取与DNA的凝胶电泳(一)目的要求：掌握：碱裂解法小量提取质粒DNA中溶液I、II、III的作用；DNA琼脂糖凝胶电泳技术熟悉：酚:氯仿纯化DNA的原理了解：DNA的其他电泳技术（二）学时安排：7学时（三）教学内容：1、关键词：碱裂解法：利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们的方法。质粒DNA：主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，独立于染色体之外的、能自主复制的双链环状脱氧核糖核酸物质。琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法，与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。2、主要教学内容：（1）碱裂解法小量制备质粒DNA的方法原理：十二烷基磺酸钠(SDS) 可使细胞膜裂解。经SDS处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA和蛋白质变性，而共价闭合环状DNA（cccDNA)的两条链不会相互分开。当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。溶液I：重悬细菌葡萄糖：比重大，使细菌不易沉淀Tris-HCL：缓冲体系EDTA：螯合金属离子，抑制DNase溶液II：破膜，变性基因组DNA和蛋白质SDS：破膜作用，解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性NAOH：破坏氢键，变性基因组DNA溶液III：中和溶液，复性质粒DNA （2）酚:氯仿纯化DNA原理：酚：变性蛋白质 氯仿：萃取溶液中的酚乙醇：沉淀得到高质量的DNA（3）DNA琼脂糖凝胶电泳原理：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45 开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。因此琼脂糖凝胶可作为分子筛，常用于凝胶层析和电泳。线性DNA分子在电场中分子越大，受到的摩擦阻力越大，迁移速度越慢。因此DNA在凝胶中获得有效的分离并测得其分子量大小。荧光染料溴化乙啶（EB）通过插入DNA双螺旋结构两个碱基之间，与DNA形成荧光络合物，可确定DNA在凝胶中的位置；而发射的荧光强度正比于DNA的含量，与已知浓度的标准品作电泳对照，可估算出待测样品的浓度。超螺旋结构泳动最快，其次为线性结构，最慢的是复制中间体。 实验六基因组DNA的提取与DNA的限制性内切酶消化(一)目的要求：掌握：基因组DNA的提取方法；DNA的限制性内切酶消化熟悉：II型限制性核酸内切酶的作用特点；酶切的影响因素了解：限制性核酸内切酶的分类（二）学时安排：7学时（三）教学内容：1、关键词：基因组DNA：生物所携带的遗传信息的总和。限制性内切酶：一类能识别双链DNA特定碱基顺序的核酸水解酶，来源于原核生物，可水解核酸链中的磷酸二酯键。2、主要教学内容：（1）小鼠肝细胞基因组DNA提取的方法细胞内的核酸多以核糖核蛋白的形式存在，且胞内存在脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白两种核蛋白。1.分离：这两类核蛋白在0.14mol/L的氯化钠中的溶解度相差很大，因此可以用0.14mol/L的氯化钠溶液抽提将两种核蛋白分离。2.解聚:在含有脱氧核糖核蛋白的溶液中加入SDS可使DNA与蛋白质分离开，用氯仿将蛋白质沉淀除去，最后用冷乙醇将DNA析出，从而获得纯化的DNA。在氯仿中加入少量异戊醇有助于分相。3.测定：DNA在波长260nm处有很高的吸收峰值，蛋白质则在280nm处有很高的吸收峰值，利用这个原理来测定纯化样品在260nm和280nm处的吸光度，再求的A260/A280的比值，若该比值大于1.6则说明样品基本能达到要求。 （2）酚:氯仿纯化DNA：原理同上个实验（3）DNA的限制性内切酶消化实验七质粒DNA的转化、重组子的筛选、凝胶中DNA的回收(一)目的要求：掌握：感受态细菌的制备；质粒DNA的转化；重组子的筛选；熟悉：重组子筛选的主要技术；凝胶中DNA的回收了解：转化、转染、转导的区别（二）学时安排：7学时（三）教学内容：1、关键词：感受态细菌：受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。质粒DNA：细菌染色体以外的遗传物质，是环状闭合的双链DNA，存在于细胞质中，具有自我复制的能力，所携带的遗传信息能赋予宿主菌某些生物学性状。转化: 是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。 蓝白筛选：是在指示培养基上用颜色直接筛选重组克隆的方法。-互补现象：各自都没有酶活性的两种肽段可以融为一体，形成具有酶活性的蛋白质的现象。重组子：两个突变位点之间可发生交换产生野生型的最小单位，即不能由重组分开的基本单位。（熟悉）2、主要教学内容：（1）大肠杆菌感受态细胞的制备方法1、Top10菌株培养过夜，以1:100比例接种培养3小时，冰浴30min，分装于EP管，2500rpm 4离心4min。2、弃上清，沉淀重悬于1ml预冷0.1mol/L CaCl2 ，冰浴15min，2500rpm 4 离心4min。3、弃上清，沉淀轻悬于0.2ml预冷0.1mol/L CaCl2 (此时细菌易破碎)，置冰浴。（2）质粒DNA的转化转化的方法有：化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞；电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞步骤：1、在消毒过的管中，加30100ng外源DNA与200ul感受态细胞混匀。 2、冰浴30min 3、将管转移到42水浴中加热冲击2min使之热休克，或用37水浴5min。 4、加800ul LB培养基在37摇动或在摇床转动生长45min，转速不超过220r/min，使抗性基因表达。（3）重组子的蓝白筛选原理：利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。当在质粒中插入外源DNA-半乳糖苷酶的N端基因失活不能与宿主-半乳糖苷酶的C端进行-互补产生白色菌落。 反之，能进行-互补的细菌表达： -半乳糖苷酶活性，形成蓝色菌落。（4）凝胶中DNA的回