高通量筛选ENU诱变产生遗传疾病小鼠模型.pdf

高通量筛选e n u 诱变产生的 遗传疾病小鼠模型 贺芳1王子兴1 ，2 赵静1 鲍洁1 丁钧1 阮海斌1葛晓梅1 谢青1张作明3 高翔1 ，2 ，4 ( 1 南京大学模式动物遗传研究中心，南京，2 1 0 0 0 0 2 医药生物技术国家重点实验室，南京，2 1 0 0 9 3 3 第四军医大学航空航天医学系，重庆，4 0 0 0 0 0 4 通讯作者g a o x i a n g n i u e d u c n ) 摘要由于小鼠和人类基因组的高度同源，修饰和改造小鼠基因组已经成为建 立人类疾病模型和研究基因功能的最重要的手段。本研究通过c 5 7 b l 6 j 雄性小鼠的 e n u 化学诱变和子代的表型筛选的方法，对g 1 代3 1 7 2 只小鼠的形态学、行为学、 神经功能、学习记忆、听力、视觉生理、骨代谢、血糖、心功能等一系列生理生化指 标进行了高通量检测，筛选出5 9 5 只与人类疾病相关的显性基因突变个体。其中毛色 异常、眼疾和听力缺陷发生频率较高，而代谢性异常的显性突变率较低，提示血糖和 心电等重要代谢功能的遗传调控稳定性高于外周神经系统功能。小鼠单侧性眼疾存在 明显的雌雄不均一性和左右不对称性。骨密度异常与小鼠性别也有一定相关性。在对 1 0 4 只g 1 代突变小鼠和野生型小鼠交配的可遗传性检测中，已有1 4 只的异常表型被 确认可以遗传。其中肢体缺陷表型韵可遗传性较高，而行为学异常小鼠的可遗传性较 低，提示行为学异常可能和多基因突变相关。这些突变小鼠品系的建立，为疾病表型 的发生和病理过程的细胞生物学及分子生物学机制研究，突变基因的染色体定位和克 隆奠定了良好的基础。 关键 e n u 化学诱变表型筛选疾病模型 基因组学的核心内容之一是通过建立整体动物模型，研究特定的生理病理学表型 和相关基因突变及表达之间的关系。基因组改造的技术，无论是对遗传学基础研究的 发展，还是对医学药学领域的进步，都已经起到了关键性的推动作用。而在人类疾病 的遗传学基础及相关基因的功能等研究方面，模型动物的基因组改造直接导致了许多 疾病相关突变基因的发现和克隆。通过基因组改造技术建立的各种整体动物模型，还 被广泛用于人类相关疾病的新型疗法的实验及新型药物的筛选，新型疗法包括干细胞 治疗和基因治疗等。 从上世纪9 0 年代起，线虫、果蝇、斑马鱼和小鼠等模式动物基因组改造的技术 已经从转基因基因打靶寻找特定基因的功能，扩展到了随机性饱和诱变( s a t u r a t e d 6 7 r a n d o mm u t a g e n e s i s ) 和筛选特定表型的动物模型，然后进行染色体定位及克隆突变 基因的“经典”思路1 。从特定基因到表型分析( 转基因基因打靶) ，又称为r e v e r s eg e n e t i c s ，主要是通过显微操作的方法，在受精卵或胚胎干细胞水平进行基因组 改造。这种分析方法针对性强，但研究周期较长，技术相对复杂，而且每次只能研究 单个基因的一种特定模式。而从表型到基因克隆( d n a 载体插入诱变侑射诱变化 学诱变) ，也称之为f o r w a r dg e n e t i c s ，其最大优点可进行高通量、大规模筛选。化学 诱变，特别是乙烷亚硝基脲( e n u ，e t h 5 r l n i t r o s o u r e a ) 诱变主要诱发单碱基突变，更 加接近于大多数的人类遗传性疾病的基因突变情况。同时，e n u 诱变率高，随机性 强，适用于饱和性诱变和系统分析整个动物基因组【2 j 。基于上述原因，e n u 化学诱 变和表型筛选已成为目前引人注目的高通量建立特定人类疾病的动物模型和克隆疾病 相关基因的方法。德国、英国、美国、加拿大、澳大利亚和日本等国家在过去的几年 中已经开始了这项具有重大基础理论价值和广泛医疗应用前景的研究，并取得了很好 的结果 3 5 j 。 由于小鼠和人类基因组的高度同源，修饰和改造小鼠基因组已经成为建立人类疾 病模型和研究基因功能的最重要手段j 。本研究通过c 5 7 b l 6 j 雄性小鼠的e n u 化 学诱变和子代的表型筛选方法，对3 1 7 2 只小鼠的形态学、行为学、神经功能、学习 记忆、听力、视觉生理、骨代谢、血糖、心功能等一系列的生理生化指标进行了高通 量检测，其中从g 1 代筛选出5 9 5 只与人类疾病相关的显性基因突变个体。在对1 0 4 只突变小鼠的可遗传性检测中，已有1 4 种表型被确认可以遗传。这是国内首次报道 针对重要的生理生化指标高通量筛选人类重大疾病的动物模型。 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 实验动物及饲养条件 研) f 级c 5 7 b l 6 j 小鼠购自中科院上海实验动物中心，所有实验用小鼠均在s p f 级动物房饲养、繁殖( 饲料经c 0 6 0 辐射消毒，温度控制在2 2 ( 3 ，1 2 小时明暗交 替) 。 1 1 2 实验试剂 e n u 购自美国s i g m a 公司。s d m ( 二甲基磺胺嘧啶) 购自上海三维制药厂。2 ， 2 。2 一t r i b r o m o e t h a n o l 购于美国a l d r i c h 公司，2 - m e t h y l 一2 一b u t a n o l 购于美国f i s c h e r 公 司。麻醉剂速眠新( 8 4 6 合剂) 购自长春农牧大学兽医研究所。散瞳药托品酰胺购自 北京双鹤现代医药技术有限责任公司。 1 1 3 实验仪器 a b r 听力检测和心电仪采用澳大利亚a & d 公司的p o w e r l a b 系统，l u n a r 骨密 度仪购自美国g e 公司，s h i r p a 实验仪由南京大学生化系仪器厂制造，优利特血糖仪 和血糖试剂条购自广西医疗器械厂，c l i c kb o x ，p a s s i v ea v o i d a n c eb o x 、f e a rc o n d i t i o n i n g 装置和w a t e rm a z e 由南京大学仪器厂和生理教研窒制造，视觉电生理检测采用重 庆国特医疗设备有限公司的国特g t 2 0 0 0 n v 系统。 6 8 1 2 方法 1 2 1e n u 注射与子代繁殖 雄性b 6 小鼠( 1 0 1 4 周龄) 经腹腔注射按1 0 0 m g k g 体重给予e n u ( 浓度为 8 0 m g m 1 ) 。每星期固定时间注射一次，连续注射三周【7 j 。从e n u 注射开始向小鼠 饮水中添加s d m ，用于预防由于e n u 注射可能引发的小鼠免疫系统受损导致的病原 微生物感染。注射期间和随后一周s d m 使用浓度为2 0 0 p p m ，随后的两个月为 1 0 0 p p m 。 充分诱变的雄性小鼠约有7 0 天不育期，经e n u 注射后雄性小鼠与正常b 6 雌性 小鼠合笼，进行可育性检验，7 0 天内可育小鼠定义为诱变不充分，不再用于进一步 实验。通过可育性检验的小鼠定义为g 0 代小鼠，从e n u 注射后1 2 0 天起g o 代小鼠 与正常的b 6 雌性小鼠合笼交配，繁殖产生小鼠为g 1 代小鼠，用于下列突变表型的 筛选。 1 2 2 可见形态异常和行为神经功能异常小鼠的筛选 可见形态异常指标包括体形，感觉器官，皮肤和被毛，毛色和白化斑点，躯干和 肢体发育等，行为及神经功能测试按r o g e r s 等设计的s h i r p a 方法进行旧j ，检测包 括4 0 个指标，用于发现肌肉缺陷、运动神经功能低下、感官缺陷、精神、小脑平衡、 自律行为方面的缺陷等。初次s h i r p a 检测在小鼠出生后5 6 周进行，一周后进行 复检。 1 2 3 视觉电生理异常小鼠的筛选 视觉电生理检测指标包括视网膜电位( e r g ) 和视觉诱发电位( v e p ) j ，初次 检测在小鼠出生后1 1 周进行，一周后进行复检。 视网膜电位的操作：小鼠暗适应后使用速眠新麻醉，托品酰胺散瞳，在暗红灯下 安放电极；记录电极置于小鼠左眼角巩膜缘，参考电极和接地电极分别置于左侧颊部 及尾部皮下，右眼遮盖，电极安放后，重复暗适应5 分钟。依次记录杆体视网膜电图 ( r o d e r g ) 、最大混合反应视网膜电图( m a x e r g ) 、振荡电位( o p s ) ，均为单次闪 光记录，闪光间隔时间为1 分钟。于2 0 e d m 2 背景光下明适应1 0 分钟后，记录锥体 视网膜电图( c o n e e r g ) 、2 0 h z 一闪烁反应视网膜电图( f l i c k e r g ) ，此两种反应分 别叠加3 次和1 0 次。除o p s 通频带为1 0 0 3 0 0 f i z ，其余波形记录通频带均为1 3 0 0 h z 。r o d e r g 刺激光强度为3 0 8 1 0 吒c d s m 2 ，其余均为1 0 c d s m 2 。 视觉诱发电位( v e p ) 的操作：记录电极置于小鼠双耳前缘连线中点皮下，参考 电极置于口腔内，接地电极位于尾部皮下，对侧眼遮盖。刺激光强分别为1 0 c d s m 2 ，频率为1 3h z ，记录信号叠加1 0 0 次，通频带l 1 0 0i - i z 。 1 2 4 听力异常小鼠的筛选 听力异常的筛选包括c l i c kb o x 和听力脑干反应诱发电位( a b r ) 两项测试。c l i c k b o x 检测在小鼠出生后5 6 周进行，c l i c kb o x 能发出2 0 k h z ，9 0 分贝高频纯音，正 常小鼠会有惊恐反应( p r a y e rr e f l e x ) ，不出现该反射小鼠表明听力严重丧失。a b r 测 试在出生后9 周进行，小鼠经a v e r t i n 麻醉后，头部固定，刺激电极刺入右耳乳突皮 下，记录电极刺入头顶正中皮下，地极刺入左耳乳突皮下，声音刺激强度为4 0 、5 0 、 7 0 分贝，刺激重复率8 次s ，滤波带宽2 0 1 5 0 0h z ，a b r 波形平均叠加次数5 0 0 6 9 次，通过p o w l a b8 s 记录仪记录【1 0 j ，小鼠a b r 反应在听阈以上能够记录到5 个波 峰，显示两个以上峰可认为小鼠能够听到声音。如果小鼠在5 0 分贝刺激时a b r 波形 少于两个峰，被认为听阈升高。一周后进行复检。 1 2 5 心功能异常小鼠的筛选 心功能异常筛选通过心电图( e l e c t r o c a r d i o g r a p h ，e c j 3 ) 检测实现，在出生后8 1 0 周进行。小鼠经a v e r t i n 麻醉后，四肢伸展放于热板上，按标准i i 导联的接线方 式把针形电极插入皮下后开始检测。心电信号通过p o w e r l a b 系统的c h a r tv 4 0 程序 采集，然后用s a e c g 程序作详细的数据分析，包括心率，q r s 波、p 波、t 波的形 状，潜伏期等【l l j 。一周后进行复检。 1 2 6 骨密度异常小鼠的筛选 骨密度在出生后1 2 1 3 周进行，检测前禁食1 天。小鼠经a v e r t i n 麻醉后，四肢 伸展，头朝左放入l u m rp i x m o u s 骨密度仪检测孔内，按照仪器的说明进行测量。对 测量结果选取相应的区域计算全身骨密度和股骨中段骨密度。一周后进行复检。两个 骨密度值和平均值差异均超过两倍标准差的个体被认为异常个体。 1 2 7 血糖水平异常小鼠的筛选 血糖检测在出生后1 1 1 2 周进行，检测前禁食四小时，眼眶采血法获得2 0 u l 以 上血液，利用便携式优利特血糖仪和配套试剂条进行血糖初次检测。血糖水平和平均 值差异均超过两倍标准差的个体被认为异常个体。初检异常的小鼠两周后复检，仍旧 异常的被确认为异常小鼠【1 3 j 。 1 2 8 学习记忆异常小鼠的筛选 学习记忆功能检测在出生后8 1 7 周进行。通过3 种不同的方法依次对小鼠进行 筛选，3 种检测均未通过的小鼠为异常小鼠。首先是p a s s i v ea v o i d a n c e 检测，未通过 的进入下一步f e a rc o n d i t i o n i n g 检测，最后再进行水迷宫的实验 1 4 。 1 2 9 显性异常表型的可遗传性检测 出现显性异常表型的g 1 代小鼠与正常b 6 小鼠交配，出生的小鼠定义为g 2 代小 鼠。g 2 代小鼠( 总数在1 6 只以上) 出现与g 1 代相同异常表型的个体则定义为可遗 传突变。g 2 代异常表型出现的比例符合1 ：1 ，认为是单基因显性遗传，如果小于1 ： l ，可能是多基因遗传。 1 2 1 0 小鼠胚胎透明标本骨骼染色 除去鼠胚表皮、内脏和脂肪，在9 5 乙醇固定，丙酮脱脂，重置于9 5 乙醇固 定，然后用a l c i a nb l u e 染色( 0 0 8 a l c i a nb l u e ：冰醋酸：无水乙醇= 1 ：4 ：4 0 ) ，1 2 k o h 中透明，最后用a l i z a r i nr e d 染色( 1 a l i z a r i nr e d ：1 k o h = l ：1 0 0 0 ) ， 1 k o h 坩油梯度分色兼透明，标本在纯甘油中保存【1 5 。 2 结果 2 1e n u 处理小鼠的可育性检验和子代繁殖 本实验共有1 9 1 只b 6 雄性小鼠经e n u 注射诱变，其中1 0 1 只小鼠通过了可育 性检测( g o 代小鼠) 。g o 代雄性小鼠和正常b 6 雌性小鼠交配后，生产3 1 7 2 只g 1 代 7 0 小鼠，其中雄性小鼠1 6 1 0 只，雌性小鼠1 5 6 2 只。经表型筛选后确认5 9 5 只g 1 代突 变小鼠( 表1 ) 。其中2 4 4 只g 1 代异常小鼠和正常b 6 雌性小鼠交配后，共生产3 7 1 8 只g 2 代小鼠。 表1g 1 代异常表型小鼠筛选结果 2 2 形态学和行为神经功能异常小鼠 按形态学可见异常和行为神经功能异常筛选方法( s h i 融) a ) ，我们共检测了 3 1 7 2 只g 1 代小鼠，共检测到2 9 8 只异常小鼠，分属2 0 个类别( 图1 和表2 ) 。在这 些突变小鼠中，眼疾、毛色变异和负趋地性差的小鼠占5 0 以上，值得关注的是， 雌性小鼠的眼疾诱发率几乎是雄性小鼠的3 倍( 雌性6 6 只雄性2 3 只) ，同时眼疾分 单侧型和双侧型，在单侧型中，右眼眼疾诱发率是左眼眼疾的4 倍( 右眼眼疾4 8 只 左眼眼疾1 1 只) 。 表2 形态学和行为神经功能异常( s h i r p a ) g i 代小鼠 表型分类 异常小鼠总数( 雌鼠雄鼠) 7 1 围l 部分g 1 代可见异常小鼠 a 腹部目背部皮肤有白噩小鼠；b 尾部考曲小鼠； c 无眼小鼠；d 白内障小鼠；e 后胜六指( 前肢t 常) 小鼠； f 由田e 小鼠生产的g 2 代小鼠柱胎后胺骨髅聋邑( 1 95 天旺胎) 。 续表 表型分类异常小鼠总数( 雌鼠催鼠) 角膜反射 转圈 颤抖 头顶毛发异常 皮肤白点 多趾 尾巴异常 流涎 肥胖 眼疾 1 ( 1 o ) 4 ( 3 1 ) 1 ( i 0 ) 2 ( 0 2 ) 3 5 ( 1 5 2 0 ) 4 ( 2 2 ) 1 5 ( 9 6 ) 1 7 ( 1 6 1 ) l ( i 0 ) 9 2 ( 2 8 1 6 4 ) 2 3 视觉电生理异常小鼠 本实验共检测了5 4 8 只g 1 代小鼠，1 3 只表现异常，其中6 只与完全先天性夜盲 症模型相似。5 只小鼠可能是视锥细胞发育不全( 图2 ) 。 2 4 听力异常小鼠 本实验通过c l i c kb o x 和a b r 检测了2 6 0 0 只g 1 代小鼠，1 9 9 只小鼠表现为听力 异常，其中雄性小鼠1 1 3 只，雌性小鼠8 6 只( 图3 ) 。 2 5 心功能异常小鼠 本实验共检测了1 2 5 3 只g 1 代小鼠心电图，图谱分析诊断得到8 0 只心律失常 ( 图4 ) 。数据分析上我们把所有测得的数据视为一个统计总体，q t 平均值为 2 5 0 4 m s ，q t 值超过2 8 。7 8 m s 视为异常，有2 1 只表现出q t 间期的延长，其中有6 只大于4 0 m s ，7 只大于3 0 m s 。 2 6 骨密度发育异常小鼠 本实验对1 3 9 8 只g 1 代小鼠进行了骨密度检测，包括全身和股骨中段的骨密度。 雄鼠的全身骨密度分布为0 0 4 8 7 ( 0 0 0 2 7 6 9 c m 2 ) ，股骨中段骨密度的分布为： 0 0 4 8 2 ( 0 0 0 4 7 9 c m 2 ) 。全身和股骨中段骨密度变化超过2 倍标准差的小鼠为异常小 鼠。检测发现有1 3 只雄鼠高于正常值，3 只雄鼠低于正常值；3 只雌鼠高于正常值， 1 3 只低于正常值。 2 7 血糖水平异常小鼠 本实验对2 4 0 3 只g 1 代小鼠进行了血糖检测，血糖平均值为8 1 2 3 m m o l ，标准 差为i 9 0 。发现1 7 只异常，其中6 只雄性，初检血糖值( 大于是1 1 7 m m 0 1 ) 偏高， 而其余1 1 只雌性，除两只初检值偏高外，其余9 只小鼠血糖值偏低( 小于5 4 m m 0 1 ) 2 8 学习记忆功能异常小鼠 由于单项学习记忆功能检测无法进行复检，本研究采用了三种方法顺序检验的程 序。只有小鼠在三项检测均不通过时才确认为学习记忆功能异常。实验共检测了 7 3 m ，、_ - 一 一，、 o 。* h 嶙e 咐、一一、 ，_ 一 d e ”“m ” 。j - “4 ”。“誊i ”“”o 一r r ”t 1 r ”“r 图2g 1 代异常小鼠的视觉电生理图和听力脑干反应 at 常m r 的税觉屯生理目包括杆体槐呵膜自图( r o d e r g ) 、最大合& 应 视阍膜电圈( m a x - e r g ) 、振荡电位( o p s ) ，锥体视月膜电田( p h o te r g ) ， 2 0 h z - 闪烁匣柱目膜电图( h k k e r g ) ，视觉诱发电位( v e p ) 。 br 出e 肼自m e r g 目负渡目+ p h o t - e r g 图* 奉f 常v e p 无异常。 表明槐杆系统功能丧先视锥系统功能反应完好。类似完全基* 性静m 性夜盲症。 cr o d - e r g # m a x e r g 目暗适应诬同膜电田置异常p h o t - e a g 囤无明显泣形。 表明杆系辘功能完好。视锥系统功能丧失。类似枧锥日胞营养不良。 d 常小鼠的听力脑千e 应( a b r ) 有i 个峰组成。 e 小鼠听阚升高，在柏d b 5 0 d b 时，社有明的波峰7 0 皿时有波峰。 f 小鼠在柏西s o 扭7 0 皿时都投有渡蟑。 1 4 0 5 只g 1 代小鼠，共有1 8 只表现为学习记忆异常。其中1 4 0 5 只g l 代小鼠进行 p a s s i v ea v o i d a n c e 实验后( 杏仁核依赣型) 得到3 5 9 只异常小鼠，对这3 5 9 只小鼠再 进行f e a rc o n d i t i o n i n g t a s k 检测( 海马回依赖型) ，4 6 只显示异常反应，4 6 只小鼠再 进行水迷宫实验( 海马回依赖型) ，得到1 8 只异常小鼠【1 6 - 1 7 i 。 29 小鼠表型的可遗传性检测 表型筛选得到g 1 代异常小鼠5 9 5 只，已经检测了1 0 4 只g 1 代小鼠的突变表型 7 4 。一 4 ，”d * ，* h 蓐io 鞯 l i 川，| j，n 阱计t 什t 一”竹1 “ 引 “汁”，计 ”“ f “剁0 o 0 0 “ h 轴捌“h “o 越i “t 。， 誊： 1 1 寸f 。雕i1 1 i l t 叫滁 | l n 黼僧1 i - _ + ! 。臻研骶善l 鬻阱嘲蝌獬 羹+ h 。“ 一 誓。了 ，_ 曹。 专+ 。j ：重誊j 蔓i 囊， ” “0 。 。一 。， j _ _ 。”7 = ； ，h ：。一。蛹 一 一一，- v 掣，y 一 l 。rt：l ，十，+ j 藩黼鏊。尊蒲誊满蔫曲 i 1 ： 瓣 ei f ：受 谰零巧黼；囊，w 溪联霹露臻 爱憋 霹蕊蔫霉；辫g 黑鬻戮坚： 图3g i 代心电异常小鼠 a 正常小曩的心电圈；b 正常小氨。电经过s b c g 连加后得剜的波形； c e 心电呈现房性心动过建；d ，f 心电星现2 ：1 的赛房阻滞。 可遗传性共对3 7 1 8 只g 2 代小鼠进行了表型检测，发现有1 4 只g 1 代小鼠表型已 确认可遗传( 表3 ) 。 寰3 寰型可遗传性小 续表 3 讨论 本诱变研究表明小鼠e n u 诱变是一种快速产生和大规模筛选人类疾病模型的有 效手段。为了得到新的小鼠突变表型，我们采用了大量不同的筛选方法，包括心血管 系统、骨骼发育、神经系统和血糖水平等多种指标。在对1 0 4 只g 1 代突变小鼠的遗 传性检测中，筛选到了1 4 种可遗传显性表型突变。考虑到约1 8 的g 1 代小鼠 ( 5 9 5 3 1 7 2 ) 有特定表型，可以推算可遗传的异常小鼠约为g 1 代小鼠总数的2 。这 个数值和早期大规模e n u 诱变实验报道的显性突变小鼠检出率相同【3 4 i 。值得指出 的是，本实验的研究对象是b 6 品系，而英国和德国的大规模诱变分别运用了b a i 。b c 和c 3 h 小鼠品系，e n u 剂量、诱变时间和检测表型也和本实验有所不同【3 - - 4 j 。 s h i r p a 检测方法中相当一部分是测定行为学指标，但是，在已进行的可遗传性 检测中，3 6 只g l 代行为学异常小鼠均没有将异常表型遗传到g 2 代。这个结果和 n o l a n 等的报道有很大差异【3 j 3 。我们认为这可能有两种解释，一是小鼠行为学指标的 严格测定非常困难，对各种环境因子( 噪声、光照、饮食、垫料等) 的变化极其敏 感，以至于结果重复性较差，这和我们观察到的复检通过率低相一致。另一方面，行 为过程可能受多基因的的控制，多基因突变( g 1 代小鼠) 在和正常小鼠交配后产生 分离，因而在g 2 代不表现行为异常【l8 f 。 一般认为e n u 诱变和其他诱变方法相比有很高的全基因组随机性。但是，我们 的实验显示，毛色异常、眼疾和听力缺陷等的发生频率远较高于其他异常表型，相 反，代谢性异常的显性突变率较低。这种差异可能有四种解释，首先是e n u 对全基 因组的诱变不是完全随机的，而是存在一些热点区域。最近，e n u 对小鼠p 5 3 基因 的特定位点的高突变率支持这一观点【l9 l 。第二种可能性是毛色异常等高诱变率表型 对小鼠等重要生理生化功能影响较小，因而进化选择压力小，而容易产生显性突变， 相反，血糖和心电等重要代谢功能的遗传调控稳定性较高，可能多为隐性突变。第三 7 6 种可能性是控制毛色、眼和听力功能的相关基因较多，在基因组上占有较大区域，因 而被e n u 诱变的几率也较高。最后，不同表型的出现频率差异还可能和我们选择的 小鼠品系有关，例如，已有报道表明b 6 小鼠在诱变过程中比b a l b c 小鼠更易产生 眼疾 2 0 2 l | 。 在眼疾小鼠中，我们还观察到了特定性别的倾向性。雌性小鼠比雄性小鼠更易于 产生眼疾( 雌性6 6 只雄性2 3 只) 。b a i r d 等报道了相类似的结果【2 1 。由于e n u 诱 变并不引起后代群体的性别比例差异，所以这种雌性眼疾的倾向性的分子机制有待于 进一步研究。另一方面，g 1 代诱变小鼠单侧性眼疾还存在明显的左右不对称性，右 眼发病率是左眼的4 倍( 右眼眼疾小鼠4 8 只左眼眼疾小鼠1 1 只) 。这种眼疾左右不 对称性在正常b 6 小鼠也有表现【2 2j ，目前在人类还未有相类似的雌雄不对称性和左右 不对称性眼疾的相关报道。 已知人类女性骨密度平均小于男性骨密度幢3 | ，我们的实验发现雄性小鼠股骨中 段骨密度明显大于雌性股骨中段骨密度。值得注意的是骨密度异常小鼠中高骨密度小 鼠中雄性居多数( 雄性高骨密度1 3 只雄性低骨密度3 只) ，而低骨密度小鼠中雌性 居多数，这一结果和人类女性更容易患骨质疏松相一致【2 4 j 。同时，我们已确定了2 只低骨密度异常小鼠的突变表型的可遗传性，这些低骨密度的小鼠可能从一定程度上 模拟了人类的骨质疏松的发生，从而相关研究将对揭示这种骨代谢病的分子机制有重 要作用。 目前，我们还在进一步确定突变小鼠的可遗传性，对特定小鼠的表型进行发育学 和生理生化分析，同时通过杂交回交确定突变的染色体定位，为克隆突变基因打下良 好基础 2 5 。我们认为，一系列人类疾病的小鼠模型的建立，将不但对了解疾病的发 病机理及筛选新的药物及其他治疗方法提供基础，还将对功能基因组的研究产生重要 影响。 最后，感谢南京中医药大学陆茵教授对心电检测和听力异常检测的帮助，感谢南 京大学生理教研室的李红召和王良斌老师对听力异常检测的帮助。本课题由国家 “8 6 3 计划”项目和国家“十五”攻关重点项目资助。 参考文献 1 b r o w ns d ，b a i l i n gr s y s t e m a t i ca p p r o a c h e st om o u s em u t a g e n e s i s c u r r e n to p i n i n i ng e n e t i c s & d e v e l o p m e n t2 0 0 1 。1 1 ：2 6 8 - 2 7 3 2 9 n o v e r o s k ej k ，w e h e rj s ，j u s t i v em j t h em u t a g e n i ca c t i o no fn e t h y l n n i t r o s o u r e ai nt h em o u s e m a m mg e n o m e2 0 0 0 ，1 l ：4 7 8 - - 4 8 3 3 n o l a npm ，p e t e r sj ，s t r i v e n sme ta 1 as y s t e m a t i c ，g e n o m e w i d e ，p h e n o t y p e - d r i v e nm u t a g e n e s i sp r o g r a m m ef o rg e n ef u n c t i o ns t u d i e si nt h em o u s e n a t u r eg e n e t i e s ，2 0 0 0 ，2 5 ：4 4 0 4 4 3 4 h r a b ed ea n g e l i sm ，f l a s w i n k e lh ，f u c k sh e ta 1 g e n o m e w i d e ，l a r g e s c a l ep r o d u c t i o no fm u t a n tm i c eb ye n u n a t u r eg e n e t i c s ，2 0 0 0 ，2 5 ：4 4 4 - - 4 4 7 7 7 5 h e r r o nb j ，l uw ，r a oc e ta 1 e f f i c i e n tg e n e r a t i o na n dm a p p i n go fr e c e s s i v ed e v e l o p m e n t a lm u t a t i o n su s i n ge n um u t a g e n e s i s n a t u r eg e n e t i c s ，2 0 0 2 ，3 0 ：1 8 5 1 8 9 6 g r e g o r ys g ，s e k h o nm ，s c h e i nje ta 1 ap h y s i c a lm a po ft h em o l l 8 eg e n o m e n a - t u r e ，2 0 0 2 ，4 1 8 ：7 4 3 7 5 0 7 n o l a np m ，k a p f h a m e rd ，b u c a nm r a n d o mm u t a g e n e s i ss c r e e nf o rd o m i n a n tb e h a v i o u r a lm u t a t i o n si nm i c e m e t h o d s ，1 9 9 7 ，1 3 ：3 7 9 3 9 5 8 r o g e rd c ，f i s h e re m ，b r o w ns d e ta 1 b e h a v i o r a la n df u n c t i o n a la n a l y s i so fm o u s e p h e n o t y p e ：s h i r p a ap r o p o s e c lp r o t o c o lf o rc o m p r e h e n s i v ep h e n o t y p ea s s e s s m e n t m a m m a l i a ng e n o m e ，1 9 9 7 ，8 ：7 1 1 - - 7 1 3 9 g uy h ，z h a n gz m ，l il e l e c t r o p h y s i o l o g i c a lc h a n g e so fs t r e p t o a o t o c i n i n d u c e d d i a b e t i cr a t si ne a r l ys t a g e d i s ij u n y id a x u ex u e b a o 2 0 0 2 。2 3 ：9 9 0 - - 9 9 3 1 0 z h e n gq y ，j o h n s o n t ，e r w a yl c a s s e s s m e n to fh e a t i n gi n8 0i n b r e ds t r a i n so f m i c eb ya b rt h r e s h o l da n a l y s e s h e a r r e s 1 9 9 9 ，1 3 0 ：9 4 1 0 7 1 1 w e h r e mx h ，k i r c h h o f fs ，d o e v e n d a n sp a m o u s ee l e c t r o c a r d i o g r a p h y ：a ni n t e r v a lo ft h i r t yy e a r s c a r d i o v a s c r e s 2 0 0 0 4 5 ：2 3 1 2 3 7 1 2 m a z e s sr b ，n o r di 矾，h a n s o nj ae ta 1 b i l a t e r a lm e a s u r e m e n to ff e m o r a lb o n e m i n e r a ld e n s i t y jc i i nd e n s i t o m e t r y ，2 0 0 0 ，3 ：1 3 3 1 4 0 1 3 h i s t o t s u m a c h is ，c a r p e n t e rd a ，r u s s e l lw l d o s e - r e p e t i t i o ni n c r e a s e st h em u t a g e n i ee f f e c t i v e n e s so fn - e t h y - n n i t r o s o u r e ai n r t l o u s es p e r m a t o g o n i a p r o c o ft h e n a t 。a c a d s e i 。u s a ，1 9 8 5 ，8 2 ：6 6 1 9 6 6 2 1 1 4 b r a m b i l l ar ，g n e s u t t an ，m i n i c h i e l l ole ta 1 ar o l ef o rt h er a ss i g 商i n gp a t h w a yi ns y n a p t i ct r a n s m i s s i o na n dl o n g - t e r mm e m o r y n a t u r e 1 9 9 7 3 9 0 ：2 8 1 2 8 6 1 5 j e n s hr p ，b r e n tr l r a p i ds c h e d u l e sf o rk o hc l e a r i n ga n da l i z a r i nr e dss t a i n i n g o ff e t a lr a tb o n e s t a i nt e c h n 0 1 1 9 6 6 ，4 1 ：1 7 9 8 3 1 6 t a n gy p ，w a n gh ，f e n gr e ta 1 d i f f e r e n t i a le f f e c t so fe n r i c h m e n to nl e a n i n ga n d m e m o r yf u n c t i o ni nn r 2 bt r a n s g e n i cm i c e n e u r o p h a n n a c o l o g y ，2 0 0 l ，4 1 ：7 7 9 7 9 0 【1 7 b o u r t c h u l a d z er ，f r e n g u e u ib ，b l e n d yje ta 1 d e f i c i e n tl o n g - t e r mm e m o r yi nm i c e w i t hat a r g e t e dm u t a t i o no ft h ec a m p - r e s p