中科院生物物理所2011-2015年生物化学考博真题及答案.pdf

6 个简答和个简答和 2 个论述题个论述题 CAS-ibp-2004 名词解释：名词解释： 肽平面；肽键中的 CN 键具有部分双键的特征，不能自由旋转，这些现象是因共振而产生 的。其结果使肽键处在一个刚性的平面上，此平面被称为肽键平面(酰胺平面)。 磷酸戊糖途径；一个葡萄糖-6-磷酸经代谢产生 NADPH 和核糖-5-磷酸的途径。其过程可以分 为两个阶段： 六碳糖 （6-磷酸-葡萄糖） 脱羧形成五碳糖 （5-磷酸-核酮糖） ， 并伴有 NADPH+H+ 和 CO2 的生成；5-磷酸-核酮糖通过异构化，转酮基，转醛基与糖酵解途径联系起来。 荧光共振能量转移（FRET） ；当一个荧光分子（又称为供体分子）的荧光光谱与另一个荧光 分子（又称为受体分子） 的激发光谱相重叠时， 供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出 荧光， 同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。 简答：简答： 1 “限制性内切酶是原核生物抵抗外界，免疫防御的一道防线”这句话如何理解“限制性内切酶是原核生物抵抗外界，免疫防御的一道防线”这句话如何理解。 定义： 限制性核酸内切酶是可以识别特定的核苷酸序列， 并在每条链中特定部位的两个核苷 酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。 在 20 世纪 60 年代，人们就注意到 DNA 在感染宿主后会被降解的现象，从而提出限制性 切酶和限制酶的概念。 1968 年，首次从 E.coli K 中分离到限制酶，它有特定的识别位点但 没有特定的切割位点，其中切割位点离识别位点达 1000bp 以上。 1970 年，美国约翰霍 布金斯大学的 H. Smith 于偶然中发现，流感嗜血杆菌 （Haemophilus influenzae）能迅速降 解外源的噬菌体 DNA ，其细胞提取液可降解 E.coli DNA ，但不能降解自身 DNA ，从而找 到 Hind 限制性内切酶。限制性核酸内切酶分布极广，几乎在所有细菌的属、种中都发现 至少一种限制性内切酶，多者在一属中就有几十种，例如在嗜血杆菌属中（Haemophilus） 现已发现的就有 22 种。限制作用实际就是限制酶降解外源 DNA，维护宿主遗传稳定的保护 机制。甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌呤 A 和胞嘧啶 C 甲基化而受到保护。通过甲基 化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。 所以， 能产生防御病毒侵染的限制酶 的细菌， 其自身的基因组中可能有该酶识别的序列， 只是该识别序列或酶切位点被甲基化了。 2 限制性内切酶限制性内切酶 2 的分类及特点？的分类及特点？ 限制性核酸内切酶（ restriction endonucleases ） ，简称限制酶，是一类能识别和切割双链 DNA 分子中的某些特定核苷酸序列的核酸水解酶，主要从细菌中分离得到。根据结构和功 能特性，把限制酶分为、和型。型限制性内切酶既能催化宿主 DNA 的甲基化，又 催化非甲基化的 DNA 的水解；而型限制性内切酶只催化非甲基化的 DNA 的水解。III 型限 制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。 3 原核表达载体，画图表示，指出各部分的功能。原核表达载体，画图表示，指出各部分的功能。 原核表达载体指：能携带插入的外源核酸序列进入原核细胞中进行表达的载体。 原核表达载体调控原件： 启动子：是 DNA 链上一段能与 RNA 聚合酶结合并起始 RNA 合成的序列，它是基因表达不可 缺少的重要调控序列。在转录起始点上游 510 bp 处，有一段由 68 个碱基组成，富含 A 和 T 的区域，称为 Pribnow 盒，又名 TATA 盒或10 区。来源不同的启动子，Pribnow 盒的 碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游 35 bp 处，有一段由 10 bp 组成的区域，称为-35 区。 SD 序列：它们是起始密码子 AUG 和一段位于 AUG 上游 310 bp 处的由 39 bp 组成的序 列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与 16S rRNA 3末端的富含嘧啶的序列互补，是核 糖体 RNA 的识别与结合位点。 终止子：一个操纵子的 3末端往往有特定的核苷酸序列，且具有终止转录功能，这一序列称 之为转录终止子，简称终止子(terminator)。 4 酵母表达载体，画图表示，指出各部分的功能。酵母表达载体，画图表示，指出各部分的功能。 载体基本信息 载体名称: pYES2-CT, pYES2/CT 质粒类型: 酿酒酵母表达载体 表达水平: 高拷贝 诱导方法: 半乳糖 启动子: GAL1 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 5 测序引物及序列: GAL1-F: AATATACCTCTATACTTTAACGTC 3 测序引物及序列: CYC1-R: GCGTGAATGTAAGCGTGAC 载体标签: C-His, C-V5 载体抗性: 氨苄青霉素 筛选标记: URA3 报告基因 克隆菌株: TOP10, E.coli 表达菌株: INVSc1, Saccharomyces cerevisiae 备注: 酿酒酵母表达载体 pYES2/CT 含有 URA3 报告基因；GAL1 启动子驱动目的基因高水 平表达；半乳糖诱导目基因表达，葡萄糖阻遏目的基因表达，二者起到分子开关作用。 组成型/诱导型: 诱导型 5 以以 lac 为例说明操纵子。为例说明操纵子。 操纵子（operon） ：很多功能上相关的基因前后相连成串，由一个共同的控制区进行转录的 控制，包括结构基因以及调节基因的整个 DNA 序列。 当在培养基中只有乳糖时由于乳糖的代谢产物异乳糖是 lac 操纵子的诱导物，它可以结合在 阻遏蛋白的变构位点上，使构象发生改变，破坏了阻遏蛋白与操纵基因的亲和力，不能与操 纵基因结合，于是 RNA 聚合酶结合于启动子，并顺利地通过操纵基因，进行结构基因的转 录，产生大量分解乳糖的酶，这就是当大肠杆菌的培养基中只有乳糖时利用乳糖的原因。 6 判断判断 PCR 产物产物 1.琼脂糖凝胶电泳 同时点分子量 marker,根据 marker 条带判断产物分子量大小,从而大致判 断是不是你要的 2.酶切 已知你产物的序列,看上面有什么酶切位点,用一个酶或者两个酶切断,看与理论预测 的条带数目和大小是否一致.一般检测有以上两步就行了,如果需要知道确切的需要进行 3 3.测序 连接到 pMD-18t 载体上,转到大肠杆菌中.拿到公司去测序,测序结果通过 gene bank 比对看与哪个基因一致,这种方法最准确 4.表达 pcr 产物连到真核或者原核表达载体上,适宜条件表达出来以后的蛋白做质谱分析,看 与理论产物表达的蛋白是否有一致的片段。 7 真核表达调控真核表达调控 真核基因表达调控的特点： 真核基因表达调控的环节更多；基因表达是基因经过转录、翻译、产生有生物活性的蛋白质 的整个过程。 真核基因的转录与染色质的结构变化相关；真核基因组 DNA 绝大部分都在细胞核内与组蛋 白等结合成染色质，染色质的结构、染色质中 NA 和组蛋白的结构状态都影响转录。 真核基因表达以正性调控为主；真核 RNA 聚合酶对启动子的亲和力很低，基本上不依靠自 身来起始转录， 需要依赖多种激活蛋白的协同作用。 真核基因调控中虽然也发现有负性调控 元件，但其存在并不普遍。 真核基因转录水平的调控： 顺式作用元件：一、启动子，真核同启动子间不像原核那样有明显共同一致的序列，而且单 靠 RNA 聚合酶难以结合 DNA 而起动转录，而是需要多种蛋白质因子的相互协调作用，不同 蛋白质因子又能与不同 DNA 序列相互作用，不同基因转录起始及其调控所需的蛋白因子也 不完全相同，因而不同启动子序列也很不相同，要比原核更复杂、序列也更长。 ；二、增强 子，增强子提高同一条 DNA 链上基因转录效率，可以远距离作用，通常可距离 14kb、个 别情况下离开所调控的基因 30kb 仍能发挥作用， 而且在基因的上游或下游都能起作用。 三、 沉寂子， 最早在酵母中发现， 以后在 T 淋巴细胞的 T 抗原受体基因的转录和重排中证实这种 负调控顺式元件的存在。 反式作用因子：以反式作用影响转录的因子可统称为转录因子(transcription factors, TF)，在 真核细胞中 RNA 聚合酶通常不能单独发挥转录作用，而需要与其他转录因子共同协作。转 录因子从功能上分析其结构可包含有不同区域，DNA 结合域(DNA binding domain)，多由 60100 个氨基酸残基组织的几个亚区组成； 转录激活域(activating domain)， 常由 30100 氨基酸残基组成，这结构域有富含酸性氨基酸、富含谷氨酰胺、富含脯氨酸等不同种类，以 酸性结构域最多见；连接区，即连接上两个结构域的部分。常见 DNA 结合域：螺旋-转 角-螺旋及螺旋-环-螺旋，锌指(zinc finger)，碱性亮氨酸拉链等。 8 如何设计引物将两个基因片段融合在一起？如何设计引物将两个基因片段融合在一起？ 9 化学合成的寡核酸片断在连接前为何化学合成的寡核酸片断在连接前为何 5端要磷酸化，磷酸化的方法？端要磷酸化，磷酸化的方法？ DNA 连接酶 （DNA Ligase） 也称 DNA 黏合酶， 在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色， 那就是连接 DNA 链 3-OH 末端和，另一 DNA 链的 5-P 末端，使二者生成磷酸二酯键， 从而把两段相邻的 DNA 链连成完整的链。 5端磷酸化： T4 多聚核苷酸激酶(T4 Polynucleotide Kinase)该酶能够催化磷酸在 ATP 的-位和寡核苷酸链 （双链或单链 DNA 或 RNA） 的 5-羟基末端的磷酸化， 以便进行连接反应。 它的缓冲液为:70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT,在液中加入终浓度为 1 mM 的 ATP，37C 温 育 1 小时。 该酶在新鲜缓冲液中表现最适酶活力（在旧缓冲液中，由于 DTT 氧化而造成的实际 DTT 含 量减少会降低酶活力） 。 要提高 5平滑末端或 5凹陷末端的磷酸化效率，可在加 T4 多聚核苷酸激酶前，先将 DNA 溶 液于 70C 加热 5 分钟，然后冰上冷却，或者加入 5% (W/V)的 PEG-8,000。 由于 T4 多聚核苷酸激酶可被铵离子所抑制，所以磷酸化步骤前，DNA 不要在含铵离子的溶 液中沉淀。 FPLC FPLC 全称为快速蛋白液相色谱（Fast protein liquid chromatography） ，FPLC 是专门用来分离 蛋白质、多肽及多核苷酸的系统，是 HPLC 近年来的一项重要革新，它不但保持了 HPLC 的 快速、 高分辨率等特性， 而且还具有柱容量大、 回收效率高及不易使生物大分子失活等特性。 原理与 HPLC(高效液相色谱)相同：都是由经典的液体柱层析引入气相色谱理论，并且对相体 进行了改革，配用高压输液泵，采用高灵敏检测器、梯度洗脱装置、自动收集装置和微机等 发展起来的现代液相色谱。 特点：二者均具有快速、分辨率高、检测灵敏度高、分离效能高等特点，而且 FPLC 还具有 柱容量大、回收效率高及不易使生物大分子失活等特性。 应用范围：HPLC 可分析低分子量沸点样品；高沸点、中分子、高分子有机化合物（包括极 性、非极性） ；离子型无机化合物；热不稳定，具有生物活性的生物分子。FPLC 是专门用来 分离蛋白质、多肽及多核苷酸的系统，应用于蛋白、有机化合物的分离纯化，比 HPLC 操作 过程简单，费时少，重复性好，但购买商品化. 论述题：论述题： 1 质谱的原理及在分子生物学的应用？质谱的原理及在分子生物学的应用？ 原理：使试样中各组分电离生成不同荷质比的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入 质量分析器， 利用电场和磁场使发生相反的速度色散离子束中速度较慢的离子通过电场 后偏转大，速度快的偏转小；在磁场中离子发生角速度矢量相反的偏转，即速度慢的离子依 然偏转大，速度快的偏转小；当两个场的偏转作用彼此补偿时，它们的轨道便相交于一点。 与此同时， 在磁场中还能发生质量的分离， 这样就使具有同一质荷比而速度不同的离子聚焦 在同一点上，不同质荷比的离子聚焦在不同的点上，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确 定其质量。 分子生物学中的应用： 一、质谱在核酸水平上检测疾病相关基因也是近年来的一个热点。 基因变异导致的疾病往往会引起标志基因 SNP 的改变, 质谱能够测定突变前后的 SNP 的分子量, 通过比较,推定其突变方式。 Bunger 等人 3 的研究应用质谱分析鸟枪法处理 后的 SNP 编码序列, 得到了与疾病相关的蛋白组学的正交分析数据。二、在蛋白质的研究方 面, 质谱测定内容包括蛋白质的一级结构如分子量的测定、 蛋白质组研究、 肽指纹图谱测定、 肽序列的测定、巯基和二硫键的定位、蛋白质翻译后的修饰等。 2 别构酶？别构酶？ 当某些化合物与酶分子中的别构部位可逆地结合后， 酶分子的构象发生改变， 使酶活性部位 对底物的结合与催化作用受到影响， 从而调节酶促反应速度及代谢过程， 这种效应称为别构 效应。具有别构效应的酶称为别构酶。 别构酶的反应初速度与底物浓度（V 对S）的关系不服从米氏方程。而是呈现 S 形曲线。S 形曲线表明，酶分子上一个功能位点的活性影响另一个功能位点的活性，显示协同效应 （cooperative effect ）, 当底物或效应物一旦与酶结合后，导致酶分子构象的改变，这种改 变了的构象大大提高了酶对后续的底物分子的亲和力。 结果底物浓度发生的微小变化， 能导 致酶促反应速度极大的改变。 天冬氨酸转氨甲酰酶（Aspartate transcarbamoylase ATCase）是了解最清楚的一个别构酶。它 催化嘧啶核苷酸合成途径中的第一个中间物 N 氨甲酰天冬氨酸的合成， ATCase 受其代谢 途径的终产物 CTP （三磷酸胞苷）的别构抑制。 3 蛋白质结构的研究方法及新进展？蛋白质结构的研究方法及新进展？ 一级：一级： Edman 降解法、 （Edman degradation） ：是测定蛋白质一级结构的方法，主要是从蛋白质或多 肽氨基末端进行分析。由埃德曼（PEdman）在上世纪 50 年代所创立。分为耦合、切割、 萃取、转化、鉴定等几个步骤。首先在 pH9.0 的碱性环境下，将异硫氰酸苯酯(PhN=C=S， PITC)和蛋白质或多肽 N 端氨基酸耦合， 形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物； 然后以三氟乙酸(TFA) 处理耦合后产物，将多肽或蛋白的 N 一端第一个肽键选择性的切断，释放出该氨基酸残基 的噻唑啉酮苯胺衍生物； 随后萃取出释放的氨基酸衍生物并在强酸性条件下转化为稳定的乙 内酰苯硫脲氨基酸(PTH-氨基酸)；最后以色谱法鉴定出降解下来的 PTH-氨基酸种类，从而得 到蛋白质或多肽 N 端序列信息。 质谱法、待测化合物分子吸收能量（在离子源的电离室中）后产生电离，生成分子离子，分 子离子由于具有较高的能量， 会进一步按化合物自身特有的碎裂规律分裂， 生成一系列确定 组成的碎片离子， 将所有不同质量的离子和各离子的多少按质荷比记录下来， 就得到一张质 谱图。 由于在相同实验条件下每种化合物都有其确定的质谱图， 因此将所得谱图与已知谱图 对照，就可确定待测化合物用电场和磁场将运动的离子（带电荷的原子、分子或分子碎片） 按它们的质荷比分离后进行检测的方法。 测出了离子的准确质量， 就可以确定离子的化合物 组成。 生物信息预测。 三级结构：三级结构： x 射线衍射法、 X 射线晶体学是一门利用 X 射线来研究晶体中原子排列的学科。 更准确地说， 利用电子对 X 射线的散射作用，X 射线晶体学可以获得晶体中电子密度的分布情况，再从中 分析获得原子的位置信息，即晶体结构。X 射线晶体学将 X 射线与晶体学联系在一起，从而 可以对各类晶体结构进行研究，特别是蛋白质晶体结构。 核磁共振技术、核磁共振技术可以直接研究溶液和活细胞中相对分子质量较小(20，000 道 尔顿以下)的蛋白质、核酸以及其它分子的结构， 而不损伤细胞。与此同时，其可以解决蛋 白质、DNA/RNA、碳水化合物的结构，可以鉴定动态特征。 三维电镜重构技术、 电镜三维重构技术是电子显微术、 电子衍射与计算机图像处理相结合而 形成的适于分析难以形成三维晶体的膜蛋白等大的复合体三维结构的分析技术。 总结：总结：X 线晶体衍射是最经典的测定生物大分子结构的方法。蛋白质晶体衍射中最大的难点 就在于蛋白质的结晶，也在一定程度上限制了它的发展。NMR 技术后起之秀，相对于 X-RAY 较为简单，近年来技术越发成熟，可测定蛋白质的分子量也在攀升，而且其分辨率也很高， 三维电镜重构技术也是结构生物学研究中的一种较新的技术。技术难点在于算法。 荧光共振能量转移技术（FRET） ：荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的， 一种能量转移现象。 当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠， 并且两个 分子的距离在 10nm 范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即 FRET 现象，使得 供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭） ，而受体发射的荧光却大大增强（敏 化荧光） 。 4 从生物样品中纯化蛋白，应注意些什么？从生物样品中纯化蛋白，应注意些什么？ 在进行任何一种蛋白质纯化的时候，都要时刻注意维护它的稳定性，保护它的活性，有一些 通用的注意事项需要牢记，它们包括： 1、操作尽可能置于冰上或者在冷库内进行。 2、不要太稀，蛋白浓度维持在g/mLmg/mL。 3、合适的 pH，除非是进行聚焦层析，所使用的缓冲溶液 pH 避免与 pI 相同，防止蛋白质的 沉淀。 4、 使用蛋白酶抑制剂， 防止蛋白酶对目标蛋白的降解； 在纯化细胞中的蛋白质时， 加入 DNA 酶，降解 DNA，防止 DNA 对蛋白的污染。 5、避免样品反复冻融和剧烈搅动，以防蛋白质的变性。 6、缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环境。 7、 在缓冲溶液中加入 0.11mmol/LDTT （二硫苏糖醇） (或-巯基乙醇） ， 防止蛋白质的氧化。 8、加 110mmol/LEDTA 金属螯合剂，防止重金属对目标蛋白的破坏。 9、使用灭菌溶液，防止微生物生长。 CAS-ibp-2008 名词解释：名词解释： 染色质重塑: 染色质重塑复合物依靠水解 ATP 提供能量驱动核小体的置换或重新排列， 而造 成的染色质结构的改变。 同源蛋白：氨基酸序列具有明显的相似性,在不同生物体或同一机体内行使相同或相似功能 的蛋白质。同源蛋白质具有物种差异性和共同的进化起源。 糖异生(gluconenogenesis)：非糖的前体物质如丙酮酸、甘油、乳酸和绝大多数氨基酸、三羧 酸循环的中间代谢物等转变为葡萄糖和糖原的过程。主要在肝脏中进行，在肾脏也可进行。 酶竞争性抑制（competitive inhibition） ：抑制剂和酶底物结构相似，可与底物竞争酶活性中 心，从而抑制酶和底物结合成中间产物。 逆转座子(retrotransposons)：在基因组内存在着通过 DNA 转录为 RNA 后，再经逆转录成为 cDNA 并插入到基因组的新位点上的因子， 被称为逆转座子。 逆转座作用的关键酶为逆转录 酶和整合酶。 亲和层析（affinity chromatography） ：将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层 析柱中， 当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时， 与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸 附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的 蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液， 改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分 离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。 简答及论述：简答及论述： 给出给出 6 中非编码中非编码 RNA 说明其作用。说明其作用。 非编码 RNA（Non-coding RNA）是指不编码蛋白质的 RNA。其中包括 rRNA，tRNA，snRNA， snoRNA 和 microRNA 等 snRNA 是 small nuclear RNA 的简称，也称作小核 RNA。其功能是与蛋白因子结合形成小核 核糖蛋白颗粒（small nuclear ribonucleo-protein partcle，简称 snRNPs） ，行使剪接 mRNA 的 功能。snRNA 主要包括 5 种：U1，U2，U4，U5 和 U6。 snoRNA 是最早在核仁发现的小 RNA，称作小核仁 RNA，最初发现它们的生物功能是用来修 饰 rRNA 的。 MicroRNA 是一类 2123 nt 的小 RNA，其前体大概是 70100 nt 左右，形成标准的 stem 结 构， 加工后成为 2123 nt 的单链 RNA。 microRNA 的作用机制是与 mRNA 互补， 让 mRNA 沉 默或者降解。 circularRNA：很多环状 RNA 是蛋白编码 RNA 经过不同方式剪接形成的非编码 RNA，没有 5 和 3端相对不被核酶剪切相对稳定。 siRNA：体内行驶 RNAi 功能的小分子。 tRNA，氨基酸的携带和 rRNA 蛋白质的合成等 蛋白质免疫沉淀和染色质免疫沉淀的原理及在网络调控中的作用。蛋白质免疫沉淀和染色质免疫沉淀的原理及在网络调控中的作用。 蛋白质免疫沉淀原理（CO-IP） ：免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方 法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白 A/G（ProteinA/G）或二 抗偶联的 agarose 或 Sepharose 珠子孵育，通过离心得到珠子-蛋白 A/G 或二抗-抗体-目的蛋 白复合物，沉淀经过洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸 5-10min，在高温及还原剂的作 用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。 染色质免疫沉淀的原理（Chip） ：基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质DNA 复合物，并 将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段， 然后通过免疫学方法沉淀此复合体， 特异 性地富集目的蛋白结合的 DNA 片段， 通过对目的片断的纯化与检测， 从而获得蛋白质与 DNA 相互作用的信息。它能真实、完整地反映结合在 DNA 序列上的调控蛋白，是目前确定与特 定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的一种很好的方法。 RNA 免疫共沉淀（RIP） ： 实验基本原理；1. 用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中 内源性的 RNA 结合蛋白。2. 防止非特异性的 RNA 的结合。3. 免疫沉淀把 RNA 结合蛋白及 其结合的 RNA 一起分离出来。4.结合的 RNA 序列通过 microarray（RIP-Chip） ，定量 RT-PCR 或高通量测序（RIP-Seq）方法来鉴定。 RNA-pull down：使用体外转录法标记生物素 RNA 探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成 RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成 分分离。复合物洗脱后，通过 western blot 实验检测特定的 RNA 结合蛋白是否与 RNA 相互 作用。 给出给出 5 例绿色荧光蛋白在生物化学中的应用。例绿色荧光蛋白在生物化学中的应用。 它之所以能够发光，是因在其包含 238 个氨基酸的序列中，第 65 至 67 个氨基酸(丝氨酸 酪氨酸甘氨酸）残基，可自发地形成一种荧光发色团。 详述真核生物从转录到翻译后的基因表达调控。详述真核生物从转录到翻译后的基因表达调控。 转录前调节 ：染色体丢失,基因扩增,染色体 DNA 修饰和异染色质化,基因重排 转录水平：染色质活化,顺式作用元件与反式作用因子等 加工水平：hnRNA 的加工形成成熟 mRNA,如果是 rRNA、tRNA 及其他小分子 RNA 也有一些 加工修饰 翻译水平：主要是 mRNA 稳定性调节 翻译后水平：涉及蛋白质的剪切和激活,蛋白质的修饰与加工折叠等 线粒体蛋白，膜蛋白，核蛋白和分泌蛋白是如何被线粒体蛋白，膜蛋白，核蛋白和分泌蛋白是如何被运输至靶部位的。运输至靶部位的。 从蛋白质分选的转运方式和机制来看，可将蛋白质转运分为 4 类： 1、蛋白质的跨膜转运（transmembrane transport） ：主要是指在细胞质基质中合成的蛋白质 转运到内质网、线粒体、质粒（包括叶绿体）和过氧化物酶体等细胞器，但进入内质网与线 粒体、叶绿体和过氧化物酶体等细胞器的机制又有所不同。与分泌蛋白 N 端信号肽引导序 列定位于内质网不同， 进入线粒体、 叶绿体和过氧化氢酶体等细胞器的蛋白质分选是一个多 步过程，需要多个不同的寻靶序列，定位到叶绿体的前体蛋白 N 端具有 4050 个氨基酸组 成的转运肽， 用以指引多肽定位到叶绿体并进一步穿透叶绿体膜进入基质中。 转运到线粒体 和过氧化物酶体的蛋白与此类似，但靠的是不同的引导序列，线粒体蛋白 N 端的导肽或过 氧化物酶体蛋白 C 端的内在引导信号。 至于这些细胞器蛋白最终是定位在不同的膜上还是不 同的基质空间，除与 N 端不同转运肽相关外，还需要其他空间定位信号序列参与决定。此 外，通过翻译后转运途径进入线粒体、叶绿体和过氧化物酶体等细胞器的蛋白质，也必须在 分子伴侣的帮助下解折叠或维持非折叠状态， 这有利于通过膜上的输入装置。 蛋白质输入这 些细胞器通常是需要能量的过程。 2 膜泡运输（vesicular transport） ：蛋白质通过不同类型的转运小泡从糙面内质网合成部位转 运至高尔基体， 进而分选转运至细胞的不同部位， 其中涉及各种不同的运输小泡的定向转运， 以及膜泡出芽与融合的过程。 3、选择性的门控转运（gated transport） ：在细胞质基质中合成的蛋白质通过核孔复合体选 择性地完成核输入（核输入）或丛细胞核返回细胞质（核输出） ，参见核孔复合体的选择性 运输。 4、细胞质基质中的蛋白质转运：上述几种分选类型也涉及蛋白质在细胞基质中的转运，这 一过程显然与细胞骨架系统密切相关， 但由于细胞质基质的结构并不清楚， 因此对其中的蛋 白质转运特别是伴随信号转导途径中的蛋白质分子的转运方式了解很少。 CAS-ibp-2010 名词解释：名词解释： mitochondrion， 是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包被的细胞器， 是细胞中制造能量的 结构，是细胞进行有氧呼吸的主要场所，其直径在 0.5 到 1.0 微米左右。 端粒 （Telomeres） ， 存在于真核细胞线状染色体末端的一小段高度重复 DNA 序列和蛋白质构 成的染色体末端结构，DNA 分子每次分裂复制端粒就缩短一点，端粒其长度反映细胞复制 史及复制潜能，被称作细胞寿命的“ 有丝分裂钟” 。 iPS；用病毒载体将四个转录因子（Oct4, Sox2, Klf4 和 c-Myc）的组合转入分化的体细胞中， 使其重编程而得到的类似胚胎干细胞和胚胎 APSC 多能细胞的一种细胞类型。 stem cell, 早期胚胎（原肠胚期之前）或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养 无限增殖、自我更新和多向分化的特性。它可以诱导成为外胚层、中胚层及内胚层三种胚层 的细胞组织 表观遗传：表观遗传学即研究没有 DNA 序列变化的、可遗传的基因表达改变。表观遗传现 象包括 DNA 甲基化、RNA 干扰、组蛋白修饰和染色质重塑等。 糖胺聚糖（glycosaminoglycan） ，曾称粘多糖，由含己糖醛酸（角质素除外）和己糖胺成分 的重复复合单位构成不分支的长链聚合物。 主要存在于高等动物结缔组织中， 植物中也有发 现。 简答简答及及论述题：论述题： 癌细胞的基本特征癌细胞的基本特征 癌细胞是由正常细胞转化而来， 它除了仍具有来源细胞的某些特性 （如上皮癌仍可合成角质 蛋白）外，还表现出癌细胞独具的特性。 无限增殖；在适宜条件下，癌细胞能无限增殖，成为“不死”的永生细胞。 接触抑制现象丧失；正常细胞生长相互接触后，其运动和分裂活动都要停顿下来。在体外 培养条件下则表现为细胞贴壁生长汇合成单层后即停止生长。 癌细胞则不同， 其分裂和增殖 并不因细胞相互接触而终止， 在体外培养时细胞可堆累成立体细胞群， 故癌细胞接触对癌细 胞的增殖无抑制作用。 癌细胞间粘着性减弱；癌细胞与其同源正常组织相比，细胞间的粘着性降低，故癌细胞在 体内容易分散和转移。 易于被凝集素凝集；与正常细胞相比，癌细胞更容易被凝集素所凝集，故引起癌细胞凝集 所需的凝集素浓度要比正常细胞的低得多。 粘壁性下降；在体外培养中，细胞贴壁生长，这与细胞分泌葡糖胺聚糖粘性物质有关。葡 糖胺聚糖是构成细胞外基质的主要成分，可形成水合凝胶。癌细胞合成葡糖胺聚糖减少，导 致细胞粘壁性能下降。 细胞骨架结构紊乱；癌细胞中微管变短，排列紊乱，微丝亦发生结构异常。 产生新的膜抗原； 癌细胞丢失了质膜上的主要组织相容性抗原， 而出现了一些新的相关性 膜抗原。 这些新的膜抗原是由正常细胞表面的糖蛋白修饰而成。 同时由于表面蛋白质运动增 强，使表面蛋白更易被相应抗体所凝集。 对生长因子需要量降低； 正常细胞在体外一般要在含有 10%以上的血清的培养液中才能生 长，血清中含有一些细胞生长所需要的生长因子，如表皮生长因子(PGF)、血小板衍生生长 因子(PGDF)、胰岛素等。而转化细胞却能在血清浓度很低的培养液中生长，对生长因子的需 求量大大降低。 （9）线粒体功能障碍；即使在氧供应充分的条件下也主要是糖酵解途径获取能量。与三个 糖酵解关键酶（己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶）活性增加和同工酶谱的改变，以及 糖原异生关键酶活性降低有关。 （10）可移植性；正常细胞移植到宿主体内后，由于免疫反应而被排斥，多不易存活。但是 肿瘤细胞具有可移植性，如人的肿瘤细胞可移植到鼠类体内，形成移植瘤。 RTK 信号通路信号通路 RTKs (receptor tyrosine kinase, RTKs)：是最大的一类酶联受体， 它既是受体，又是酶， 能够 同配体结合，并将靶蛋白的酪氨酸残基磷酸化。所有的 RTKs 都是由三个部分组成的：含有 配体结合位点的细胞外结构域、单次跨膜的疏水螺旋区、含有酪氨酸蛋白激酶（RTK）活 性的细胞内结构域。 RTK-Ras 信号通路是这类受体所介导的重要信号通路，具有广泛的功能，包括调解细胞的增 值与分化，促进细胞存活，以及细胞代谢过程中的调节与校正作用。RTK-Ras 信号通路的基 本模式是：配体RTK接头蛋白GRFRasRaf（MAPKKK）MAPKKKMAPK进入细 胞核其他激酶或基因调控蛋白（转录因子）的磷酸化修饰。 脂筏模型脂筏模型 什么是干细胞和多能干细胞，各有什么特点？什么是干细胞和多能干细胞，各有什么特点？ 蛋白质运输的类型蛋白质运输的类型 研究一个基因的功能研究一个基因的功能 已知一个基因在一个信号通路中，怎么确定该基因的位置？已知一个基因在一个信号通路中，怎么确定该基因的位置？ 先通过激活或抑制目的基因/通路 （可以通过药物或者转染表达/干扰质粒等） ， WB 检测下 游关键蛋白的表达水平是否有所变化后，确定有作用的通路后再进一步细做、铺开 做 knock-out 和过度表达，然后看其他基因和产物的变化，推出上下游 N-连接寡糖和 O-连接寡糖有什么区别，N-连蛋白和 O-连蛋白分别是怎么生成的？ N-连接寡糖：结合在糖蛋白的天冬酰胺侧链氨基上的分支寡糖链 O-连接寡糖：结合在糖蛋白的丝氨酸或苏氨酸羟基侧链上的寡糖链。 N-连蛋白：末端葡萄糖胺的糖环 C1 原子与多肽链上天冬酰胺侧链氨基上的 -NH2 氮原子共 价链接。 O-连蛋白： 末端乳糖胺的糖环 C1 原子与多肽链上丝氨酸或苏氨酸羟基侧链上的 -OH 氧原子 共价链接。 蛋白质翻译后的修饰机制蛋白质翻译后的修饰机制 (1)N端修饰 原核生物修饰时是由肽甲酰基酶除去甲酰基， 多数情况甲硫氨酸也被氨肽酶 除去，真核生物中甲硫氨酸则全部被切除。 (2)多肽链的水解切除 水解切除其中多余的肽段，使之折叠成为有活性的酶或蛋白质。如 酶原激活 (3)氨基酸侧链的修饰 氨基酸侧链的修饰包括羟化、羧化、甲基化及二硫链的形成等。 (4)糖基化修饰 糖蛋白是细胞蛋白质组成的重要成分。它是在翻译后的肽链上以共 价键与 单糖或寡聚糖连接而成。糖基化是在酶催化下进行的。 高能磷酸化合物有哪几种？高能磷酸化合物有哪几种？ 高能磷酸化合物是指水解时释放的能量在 20.92kJ/mol 以上的磷酸化合物。机体内有许多磷 酸化合物如 ATP，1,3二磷酸甘油酸，氨甲酰磷酸，磷酸烯醇式丙酮酸，磷酸肌酸，磷酸精 氨酸等，它们的高能磷酸键断裂时，可释放出大量的自由能，这类化合物称为高能磷酸化合 物。 从化学结构上含高能磷酸键的化合物分为：1、磷酸酐（P-O） ，如焦磷酸，核苷酸；2、羧酸 和磷酸合成的混合酸酐（P-O） ，如乙酰磷酸，1，3-二磷酸甘油酸，氨基酰-AMP；3、烯醇 磷酸，如磷酸烯醇式丙酮酸；4、磷氨酸衍生物（R-NH-PO3H2） ，如磷酸肌酸 ATP 酶的种类有哪几种（酶的种类有哪几种（P,V,F 型）型） 四种类型的运输 ATPase 编辑 P 型离子泵（P-type ion pump)，或称 P 型 ATPase。此类运输泵运输时需要磷酸化（P 是 phosphorylation 的缩写） ，包括 Na+-K+泵、Ca2+离子泵。 V型泵 （V-type pump） ， 或称V型ATPase， 主要位于小泡的膜上 （V代表vacuole或vesicle） ， 如溶酶体膜中的 H+泵，运输时需要 ATP 供能，但不需要磷酸化。 F 型泵（F-type pump） ，或称 F 型 ATPase。这种泵主要存在于细菌质膜、线粒体膜和叶绿 体的膜中， 它们在能量转换中起重要作用， 是氧化磷酸化或光合磷酸化偶联因子 （F 即 factor 的缩写） 。F 型泵工作时不会消耗 ATP，而是将 ADP 转化成 ATP，但是它们在一定的条件下也 会具有 ATPase 的活性。 ABC 运输蛋白（ATP-binding cassette transportor） ，这是一大类以 ATP 供能的运输蛋白， 已发现了 100 多种，存在范围很广，包括细菌和人。 CAS-ibp-2011 名词解释：名词解释： 简答：简答： 1、生物膜的基本成分，每种成分又分为哪几类、生物膜的基本成分，每种成分又分为哪几类 膜脂；构成膜的脂类有磷脂、胆固醇和糖脂,其中以磷脂为最多.这三种脂类都是双亲媒性分 子,即它们都是由一个亲水的极性头部和一个疏水的非极性尾部组成.由于膜脂的这一结构特 点,它们在水溶液中能自动聚拢形成脂双分子层,其游离端往往有自动闭合的趋势,形成一种 自我封闭而稳定的中空结构,称脂质体. a 磷脂 真核细胞膜中的磷脂主要有卵磷脂（磷脂酰胆碱） 、脑磷脂（磷脂酰乙醇胺） 、磷脂 酰丝氨酸、鞘磷脂合磷脂酰肌醇. b 胆固醇 是细胞膜内的中性脂类. 在膜中,胆固醇分子散布在磷脂分子之间,其极性的羟基 头部紧靠磷脂的极性头部,将固醇环固定在近磷脂头部的碳氢链上,其余部分分离.这种排列 方式对膜的稳定性十分重要. c 糖脂 是含一个或几个糖基的脂类, 动物细胞膜中的糖脂主要是鞘氨醇的衍生物,结构与鞘 磷脂相似,只是其头部以糖基替代了磷脂酰碱基.脑苷脂是最简单的糖脂,只含一个糖基 （半乳 糖或葡萄糖） .在所有细胞中,糖脂均位于膜的非胞质面单层,并将糖基暴露在细胞表面,其作用 可能是作为某些大分子的受体,与细胞识别及信息传导有关 膜蛋白；生物膜所含的蛋白叫膜蛋白,是生物膜功能的主要承担者.根据蛋白分离的难易及在 膜中分布的位置,膜蛋白基本可分为两大类：外在膜蛋白和内在膜蛋白 a 外在膜蛋白约占膜蛋白的 2030,分布在膜的内外表面,主要在内表面,为水溶性蛋白, 它通过离子键、 ； 氢键与膜脂分子的极性头部相结合,或通过与内在蛋白的相互作用,间接与膜 结合。 b 内在蛋白约占膜蛋白的 7080,是双亲媒性分子,可不同程度的嵌入脂双层分子中.有 的贯穿整个脂双层,两端暴露于膜的内外表面,这种类型的膜蛋白又称跨膜蛋白.内在膜蛋白 露出膜外的部分含较多的极性氨基酸,属亲水性,与磷脂分子的亲水头部邻近；嵌入脂双层内 部的膜蛋白由一些非极性的氨基酸组成,与脂质分子的疏水尾部相互结合,因此与膜结合非常 紧密 膜糖；糖蛋白、糖脂细胞膜糖类主要是一些寡糖链和多糖链，它们都以共价键的形式和膜脂 质或蛋白质结合，形成糖脂和糖蛋白；这些糖链绝大多数是裸露在膜的外面（非细胞质）一 侧的。 （多糖-蛋白质复合物，细胞外壳 cell coat）单糖排序上的特异性作为细胞或蛋白质的 “标志、天线” 膜的流动性膜的流动性 生物膜的流动性是膜脂与膜蛋白处于不断的运动状态,它是保证正常膜功能的重要条件.在生 理状态下,生物膜既不是晶态,也不是液态,而是液晶态,即介于晶态与液态之间的过渡状态.在 这种状态下,其既具有液态分子的流动性,又具有固态分子的有序排列.当温度下降至某一点 时,液晶态转变为晶态； 若温度上升,则晶态又可溶解为液晶态.这种状态的相互转化称为相变, 引起相变的温度称相变温度.在相变温度以上,液晶态的膜脂总是处于可流动状态.膜脂分子 有以下几种运动方式：侧向移动；旋转运动；左右摆动；翻转运动.膜蛋白分子的 运动形式有侧向运动和旋转运动二种. 膜的不对称性膜的不对称性 以脂双层分子的疏水端为界,生物膜可分为近胞质面和非胞质面内外两层,生物膜内外二层的 结构和功能有很大差异,这种差异称为生物膜的不对称性. 膜脂分布的不对称主要体现在膜内外两层脂质成分明显不同.如磷脂中的磷脂酰胆碱和鞘磷 脂多分布在膜的外层,而磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇多分布在膜的内层,其中 磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸的头部基团均带负电,致使生物膜内侧的负电荷大于外侧.膜蛋 白分布的不对称主要体现在三个方面：即使是膜内在蛋白都贯穿膜全层,但其亲水端的长 度和氨基酸的种类与顺序也不同；外在蛋白分布在膜的内外表面的定位也是不对称的,如 具有酶活性的膜蛋白 Mg2-ATP 酶、5核苷酸酶、磷酸二酯酶等均分布在膜的外表面,而腺 苷酸环化酶分布在膜的内表面；含低聚糖的糖蛋白,其糖基部分布在非胞质面 2、信号肽的、信号肽的含义，作用，怎样起作用的含义，作用，怎样起作用的 定义：分泌蛋白新生肽链 N 端的一段 2030 氨基酸残基组成的肽段。有指导新合成多肽链 跨膜转移（定位）的 N-末端的氨基酸序列（有时不一定在 N 端） 。 作用：当信号肽序列合成后，被信号识别颗粒(SRP)所识别，蛋白质合成暂停或减缓，信号 识别颗粒将核糖体携带至内质网上，蛋白质合成重新开始。在信号肽的引导下，新合成的蛋 白质进入内质网腔而信号肽序列则在信号肽酶的作用下被切除 机制：信号肽假说认为，编码分泌蛋白的 mRNA 在翻译时首先合成的是 N 末端带有疏水氨 基酸残基的信号肽，信号肽翻译后被 SRP（信号识别颗粒）识别，然后 SRP 和其受体结合， 核糖体结合到膜上被内质网膜上的受体识别并与之相结合。 SRP 受体在蛋白质转运中的作用 是短暂的。 当 SRP 和信号肽结合时， 它阻止了翻译。 蛋白合成停止。 当 SRP 与其受体结合时， SRP 释放出信号肽， 然后核糖体和膜上的其它成分 （尚未鉴别出） 结合， 此时翻译得到恢复。 信号肽经由膜中蛋白质形成的孔道到达内质网内腔， 随即被位于腔表面的信号肽酶水解， 由 于它的引导，新生的多肽就能够通过内质网膜进入腔内，最终被分泌到胞外。翻译结束后， 核糖体亚基解聚、孔道消失，内质网膜又恢复原先的脂双层结构。 3、体外蛋白相互作用的方法有那些，列举、体外蛋白相互作用的方法有那些，列举 3 中常用的方法，简述其原理中常用的方法，简述其原理 Far-western：在传统的 western blotting 中，凝胶电泳被用来从样品中分离蛋白质，然后这些 蛋白质在 blotting 过程中被转移到膜上。目标蛋白在 western blot 中被抗体探针识别。 far-western blotting 用非抗体蛋白（探针）来检测目标蛋白，通过这种方式，与探针结合的 蛋白质就被检测出来了。探针蛋白经常通过一种表达克隆载体在大肠杆菌中被生产出来。 GST-Pulldown：将靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase 谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲 和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋 白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的 “捕获蛋白” (目的蛋白),洗脱结合物后通过 SDS-PAGE 电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白。GST：谷胱甘肽巯基转移 酶(glutathione S-transferase)。 蛋白质芯片技术：将一个蛋白芯片与荧光标记的探针蛋白孵育，洗脱非特异性结合的蛋白， 可以通过扫描芯片上的荧光点来检测稳定的相互作用的蛋白点。 免疫共沉淀技术： 首先把把靶蛋白的抗体通过亲和反应链接到固体基质上， 再将可能与靶蛋 白相互作用的待筛选蛋白加入反应体系中， 用低离心力沉淀或微膜过滤法在固体基质和抗体 的共同作用下将蛋白复合物沉淀到试管的底部或微膜上， 那么待筛选蛋白通过靶蛋白与抗体 和固体基质相互作用被分离出来。 4、现代结构生物学中三种最重要的研究方法是什么，各有什么优缺点、现代结构生物学中三种最重要的研究方法是什么，各有什么优缺点 结构生物学主要是用物理的手段,用 X-射线晶体学,核磁共振波谱学,电镜技术等物理学技术 来研究生物大分子的功能和结构。 X 射线晶体衍射。 X 射线晶体学：是一门利用 X 射线来研究晶体中原子排列的学科。更准确地说，利用电子对 X 射线的散射作用，X 射线晶体学可以获得晶体中电子密度的分布情况，再从中分析获得原 子的位置信息，即晶体结构。晶体中含有数量巨大的方位相同的分子，X 射线对这些分子的 衍射叠加在一起就能够产生足以被探测的信号。 X 射线晶体结构测定优点：分辨率高；不损伤样品；无污染；相对快捷；能得到晶体完整性 的大量信息。 X 射线晶体结构测定存在问题：晶体构象是静态的，不能测定不稳定的过渡态的构象；很多 蛋白质很难结晶，或者很难得到用于结构分析的足够大的单晶（瓶颈） ； X 射线晶体衍射的 工作流程较长。 核磁共振 核磁共振主要是由原子核的自旋运动引起的。不同的原子核，自旋运动的情况不同，它们可 以用核的自旋量子数I来表示。 自旋量子数与原子的质量数和原子序数之间存在一定的关系。 用核磁方法研究蛋白质结构的主要优点在于：蛋白质处于溶液状态；适合研究蛋白质-蛋白 质，蛋白质-核酸，蛋白质-配基相互作用；可研究蛋白质分子内部运动；可研究膜蛋白。缺 点在于。缺点在于：