生物技术大实验部分操作程序-易.doc

.生物技术大实验操作指南注意事项1、 工作服穿戴，禁止吃东西和大声喧哗和串门聊天。2、 用电、气安全注意事项。3、 节约用水，安全用水，有毒、害废水的正确处理。4、 实验室、台卫生，最后离开实验室的同学检查水电门窗。5、 实验报告，正确记录原始数据，分析结果得出合理的结论。实验一 鸡输卵管总rna提取（溶菌酶基因的提取）一、 原理：组织细胞在冰浴中剪碎（最好有液氮），加trizol快速匀浆碾磨，加一定体积的氯仿振荡，离心，取水相，加等体积的异戊醇（或无水乙醇）沉淀，75%乙醇洗涤，晾干，无rnase的ddh2o溶解。二、 试剂与设备： totalrnaextractor（trizol）或rnasimple total rna kit，氯仿，异戊醇，无水乙醇，ddh2o free rnase。研钵，玻璃匀浆器，16000转低温冷冻离心机。三、 步骤：1、 新鲜鸡输卵管膨大部，50mg，预冷的研钵中剪碎，加1ml trizol冰浴中匀浆，rt 5-10 min。2、 加200ul 氯仿，振荡15 sec，rt 3 min。3、 4 12000rpm，离心10min，吸取上层水相，转入新的离心管。4、 加500ul 异戊醇柔和混匀，rt沉淀30min,离心同上，留取沉淀。5、 加1ml 75%乙醇洗涤沉淀 2次，勿剧烈振荡，离心同上，收取沉淀，rt晾干3-5min。6、 50ul ddh2o free rnase 溶解沉淀。7、 检测rna纯度与浓度。四、 结果五、讨论实验二 溶菌酶基因第一链cdna合成一、 原理： mrna经m-mulv催化，以oligo dt为引物，将mrna反转录合成cdna，此cdna为单链。二、 试剂与设备：m-mulv第一链cdna合成试剂盒，恒温水浴锅，掌上离心机。三、 步骤：1在冰浴的试管中加入如下反应混合物：总rna 或 poly(a)+ rna或特异性rna xgoligo dt (0.5g/l) (20 pmol) 1lrnase free ddh2o 定容至12l2. 轻轻混匀后离心35 s，反应混合物在65温浴5 min后，冰浴30 s，然后离心35 s。3将试管冰浴，再加入如下组分：5reaction buffer 4lrnase inhibitor ( 20 u/l) 1ldntp mix(10 mmol/l) 2lm-mulv rt（200 u/l） 1l注：若5reaction buffer出现白色结晶，需37温浴数分钟至白色结晶完全溶解，震荡混匀。4轻轻混匀后离心35 s。5在 pcr 仪上按下列条件进行反转录反应cdna 合成 42 30-60 min 6.终止反应 95 5 min(酶失活)，处理后，置于冰上放置或-20保存。* m-mulv rt酶最后加。四、结果五、讨论实验三 鸡溶菌酶基因的pcr扩增一、 原理：利用耐热taq酶（一种dna聚合酶），以四种dntp为底物，在引物的诱导下，经过变性、退火、延伸三步反应，体外合成dna双链分子。二、 试剂与设备：2x pcr plus mastermix，ddh2o，模板，上、下游引物，掌上离心机，pcr仪。三、 步骤：1、 反应体系如下：模板dna （第一链cdna） x ul（1ug）引物1（10 um） 1 ul引物2（10 um） 1 ul2x pcr plus mastermix 12.5ulddh2o 10.5-x ul total 25 ul如果体系变化，可按此比例添减。2、 pcr反应条件： 95 5 min 95 30sec 56 30sec 30 cycles 72 30sec 72 10min3、 结果检验 取3-8ul，pcr产物，1%agarose 电泳。（切下目的条带-20保存）四、 结果 五、讨论实验四 pcr产物的回收纯化一、 原理：pcr产物经过琼脂糖电泳分离，切取含目的产物的胶条，用胶回收试剂盒回收。二、 试剂与设备：dna胶回收试剂盒，tbe电泳buffer，琼脂糖，goldview染料，2000 dna ladder，无水乙醇，te或ddh2o，恒温水浴锅，水平电泳仪，高速冷冻离心机等。三、 步骤：1、 通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的dna片段与其它片段分开，用干净的手术刀片将含目的dna片段的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5 ml离心管中，称重。 2、 根据胶块的重量和浓度，按每100 mg琼脂糖（如胶块不足100 mg则用水补充至100 mg）加300- 600 l的比例加入binding buffer ii。3、 将离心管置于55水浴5-10 min，间或混匀，直至胶块完全溶化。4、 当目的片段 500 bp时，加入所使用的binding buffer ii 1/3体积的异丙醇，混匀。当目的片段 500 bp时，此步骤可以省略，直接进行步骤5。5、 将溶化好的溶液全部移入吸附柱，室温放置2 min，8,000 rpm 离心1 min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。6、 向吸附柱中加入500 l wash solution，10,000 rpm 离心1 min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。7、 重复步骤6一次。8、 将空吸附柱和收集管放入离心机，12,000 rpm 离心2 min9、 将吸附柱放入干净的1.5 ml离心管中，在吸附膜中央加入30-50 l elution buffer，室温静置1-2 min，12,000 rpm 离心1 min。将所得到的dna溶液置于-20保存或用于后续试验。四、 结果五、讨论实验五 pcr产物-t载体连接与扩增一、 原理：t vector是一种高效克隆pcr产物（ta cloning）的专用载体，该载体的3端具有突出的“t”末端；dna聚合酶在进行pcr扩增时会在pcr产物双链dna每条链的3端加上一个突出的a，t载体的两端就可以和pcr产物的两端进行正确的at配对，在连接酶的催化下，就可以把pcr产物连接到t载体中，形成含有目的片断的重组载体，该载体即可导入宿主菌扩增。二、 试剂与设备：t-载体，目的dna片段，掌上离心机，冰瓶(低温恒温仪)等。三、 步骤：1、 反应体系 在0.2 ml pcr管中配制下列连接体系：反应组分10 l 反应体系插入的目的片段 x l（0.2 pmol）pucm-t vector 1 l（50 ng）10ligation buffer 1 l50% peg 4000 1 lt4 dna ligase 1 lsterilized ddh2o 补足至10 l（一般最后加入t4 dna ligase。）2、16连接1-12 h（建议连接过夜）。3、连接产物转化进感受态细胞，涂板培养，挑选/鉴定阳性克隆；或将连接产物-20保存。四、结果五、讨论实验六 感受态细胞的制备与转化一、原理：受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，cacl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源dna分子通过的感受态细胞；细菌处于0，cacl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的dna形成抗dnase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42短时间热冲击处理，促使细胞吸收dna复合物，进入细胞的dna分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。二、试剂与设备：lb培养基，0.1m cacl，冰水，平皿，试管，恒温水浴锅，低温冷冻离心机，无菌工作台等。三、步骤：（一）感受态细胞的制备:1前一晚接种受体菌（dh5或其他），挑取单菌落于lb培养基中37摇床培养过夜（约16小时）。2取1ml过夜培养物转接于100ml lb（1：100）培养基中，在37摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm），直至od600为0.4-0.6。3将 0.1m cacl2 溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作。4吸取 1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟。54下3000g冷冻离心5分钟。6弃去上清，加入 100l预冷0.1m cacl2 溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟。74下3000g冷冻离心5分钟。8弃去上清，加入 100l预冷0.1m cacl2 溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮。9细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（ 15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（70）。（二）细胞转化：1、将100 l感受态细胞置于冰上解冻后，加入实验五的连接液 10 l，轻轻混匀，冰上放置30 min。2、42c水浴热激90 sec，再冰上放置5 min。3、加入800 l lb液体培养基，37c振荡培养1 h。4、4000 rpm离心3 min，用枪头吸掉750 l上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮。5、将细菌悬液均匀涂布在含100ug/ml 氨苄青霉素抗性的lb平板上（也可再加含20 l 100 mm iptg 和100 l 20 mg/ml x-gal）。6、将平板于37c培养1 h，然后倒置培养过夜。8、 用接菌环或牙签或小枪头挑取白色菌落，用基因特异性引物进行pcr扩增，确认载体中插入片段的长度大小。或将白色菌落挑至含氨苄青霉素的液体培养基中37c培养过夜，提取质粒后进行酶切鉴定。四、 结果五、讨论试验七 质粒的小量提取（碱裂解法） 一、原理：碱裂解法是基于dna的变性与复性差异而达到分离目的的。碱使细胞破裂，质粒dna变性，再将ph值调至中性使其复性，复性的为质粒dna，而蛋白质和染色体dna不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。 二、试剂与设备：溶液i：50 mm葡萄糖 + 25 mm tris-cl + 10 mm edta，ph 8.0，灭菌，rt保存； 溶液ii（用10m naoh 临用是配），0.2 n naoh + 1% sds； 溶液iii，3 m 醋酸钾 + 2 m 醋酸，灭菌后rt保存；ste，10mmol/ltrishcl，1mmol/l edta，0.1m nacl，ph8.0，灭菌后rt保存；te，100mmol/ltrishcl，10mmol/l edta，ph8.0，灭菌后rt保存（最好含 rna酶 20g/ml）；75%乙醇；hcl；碎冰块；低温冷冻高速离心机，恒温空气摇床，水循环真空泵。五、 步骤：1、 无菌操作台上，取37过夜培养菌体od600=1.0， 1.5ml于离心管（eppendorf管）中，微量离心机上以10000rpm离心1min，或者以4000rpm离心510min，弃上清液，加400ul，ste洗涤2次，弃上清，离心管倒扣于干净的吸水纸上吸干。 2、沉淀中加100l用冰预冷的溶液 i，剧烈振荡，充分混合。冰浴5min。 3、加入200l溶液 ii(新鲜配置)，加盖后轻轻快速颠倒离心管数次混匀（千万不要振荡），冰浴5 min 。 4、加入150l预冷溶液 iii，轻轻颠倒数次混匀（10s），置于冰浴3-5 min 。 5、4，12000rpm 离心10min，上层水相于另一新eppendorf管中。 6、加入等体积酚/氯仿（1：1）或酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）振荡混匀，以4，12000rpm，离心10min。7、吸上层水相至一新的离心管，加等体积的氯仿，振荡混匀，离心同上。8、小心移出上清于一新eppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，温和混匀，rt 10-30 min，4离心12000rpm，10-15min，收集沉淀。 9、70-75%乙醇洗涤沉淀 1-2 次, 每次1.0ml，如上离心2min，离心管开盖倒扣在吸水纸上，室温下晾干（5-10min），最好用真空泵抽掉残留酒精。 10、加入50l te缓冲液（ph 8.0 含20g/mlrnasea）溶解质粒粗提物，在-20保存。五、结果六、讨论实验八 质粒dna酶切鉴定与回收一、 原理：本实验采用ecor和bamh双酶切重组质粒pmd18-chlyz或其它重组的克隆质粒，酶切后产生大小不同的2个片段，大片段来自质粒载体，小片段为目的基因。二、 试剂与设备：ecor，bamh，10k buffer，tbe或tae 电泳buffer，琼脂糖，恒温水浴锅，水平电泳仪等。三、 步骤：1、 酶切体系20ul ecor 0.2ulbamh 0.2ul重组质粒 10ul10k buffer 2ulddh2o 7.6ultotal 20 ul加样毕，混匀，低速离心 30 sec，37-，2-6hr。2、 检测 1% 琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带，称重，放 eppendorf，-20 保存。四、 结果五、 讨论实验九 原核表达载体的构建一、 原理：同时用酶ecor和bamh，分别消化处理目的chly-t载体和pet32质粒载体，回收chly基因和pet32a大片段，产生的粘性末端，可以在t4 dna ligase 作用下，再次连接成完整的质粒，该质粒可以转化导入细胞（宿主体内），随宿主体在内扩增和表达。二、 试剂与设备：pet32质粒，chlyz基因，t4 dna ligase，10 t4 dna ligase buffer，16 恒温水浴锅或冰瓶或pcr仪。三、 步骤：1、 质粒和基因的酶切消化：操作参考实验八，质粒和基因分开酶切。2、 质粒和基因的回收：参考实验四，质粒和基因分开回收。3、基因与载体的连接：酶切回收相关基因，用t4 ligase 16度连接过夜，次日转化，37培养，挑阳性克隆，鉴定。 bamh/ecor 双酶切 bamh/ecor 双酶切 chly dna fragment 载体t4 dna ligase 连接 4、鉴定方法：可提质粒酶切或pcr鉴定。保存阳性克隆，以备后续表达实验。四、 结果五、讨论实验十 鸡溶菌酶的原核表达 概述随着功能基因组研究的不断深入，需要将大量已克隆的基因在模式细胞中获得高效表达进而研究这些基因产物的结构与功能。众所周知，大肠杆菌是现代分子生物学研究中最常用的材料之一，不但已经掌握了它的分子生物学和分子遗传学方面的大量资料，而且在基因表达方面也有深入的了解，因此很自然大肠杆菌便被选作表达外源基因的常用寄主细胞。早期的研究工作己表明，要使己克隆的外源基因能在细菌细胞中成功表达，就必须使基因置于寄主细胞的转录和转译机制的控制之下。在大肠杆菌细胞中参与特定新陈代谢的基因，往往成簇集结成一个转录单位即操纵子，其中主要的控制片段是位于其起始部位的操纵序列和启动子。在基因表达过程中，操纵子先转录成多顺反子mrna，然后转译出多肽分子。已克隆基因在大肠杆菌细胞中的表达，如同正常的基因表达程序一样，也包括dna分子的有效转录和mrna分子的有效转译这两个主要步骤，在某些情况下还涉及到表达产物蛋白质分子的转译后修饰问题。1974年，chang和cohen证实金黄色葡萄球菌的a mpr 基因能够在没有亲缘关系的大肠杆菌中实现功能表达，因而人们期望从基因到表型的生化途径也与遗传密码一样是通用性的，并据此设想任何细菌的基因也都能够在别种细菌中表达。随后st ruhl 等人和 vapnek 等人(1977)又相继发现，两种比较低等的真核生物酿酒酵母和粗糙链抱菌的基因，也能够在大肠杆菌中表达。这样便进一步证实了人们的上述想法。基于这样的原因，研究工作者们纷纷推测，更高等的基因也应该能够在细菌中实现表达。但后来有越来越多的研究报告指出，不少己克隆基因事实上并不能够在新的遗传背景中实现表达。对此的一种解释认为，是由于从基因到表型的过程中有若千步骤发生障碍的缘故。一种功能蛋白的合成，不但取决于适当的基因转录及随后的mrna有效转译，而且在许多情况下，还同转译后的加工和新生多肤的装配有关。在这过程中只要有一个步骤未能正确地进行，有关基因也就不能实现其功能表达。克隆序列的转录必须有一个能被寄主rna聚合酶识别的启动子，而mrna的有效转译则必须有核糖体的结合位点。蛋白质转译后修饰的一个共同特点是信号序列引导蛋白质分子穿过细胞膜。另一可能与蛋白质成功表达有关的现象是蛋白质的降解作用。已经知道在大肠杆菌中，凡是发生了无义突变的基因，它们所编码的短肤链在合成后不久，就会被降解掉，与此相反野生型的蛋白质则十分稳定。可以设想如果外源蛋白质的分子构型或其氨基酸序列，不能保护它们自己免受胞内蛋白酶的作用，则新生蛋白很快就会被迅速地降解掉。研究克隆基因表达的成果，对于某些研究领域有着重要的用途。首先有可能为揭示蛋白质结构与功能之间的关系提供新的研究手段。例如运用dna技术，能够获得可在大肠杆菌细胞中进行有效表达的杂种干扰素。这样便可以将这种蛋白质分子纯化出来，在体外进行生物学方面的研究。运用dna技术还可以用来检测体外突变所产生的变异氨基酸在蛋白质多肤链中的位置，并测定出因这种改变对于酶催化功能的效应。在实际应用方面，基因克隆和表达技术也有着不可忽视的重要性。应用重组dna技术产生的蛋白质，在医药卫生、食品工业等方面的实用价值及其前景也是十分诱人的。在今天几乎所有生物科学领域都受到此项技术的影响。体外表达目基因，纯化出重组蛋白是研究蛋白质结构与功能、蛋白蛋白、蛋白核酸 间的相互作用，制备抗体及突变研究等的基本技术，也是基因克隆的目的所在。目前蛋白质表达的方法大多是将编码所需产物的基因插入表达型质粒或其他载体，然后将该载体导入细胞。典型的表达载体除具有一般克隆载体的特征外还包含指导相应mrna大量合成的启动子、允许其在宿主体内自主复制的序列和能增强mrna翻译效率的序列。一、目的：1.学习原核细胞中目的基因表达所需的条件2.认识常用的表达载体。二、原理提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。常用的有温度诱导和药物诱导。e.coli 的乳糖操纵子（元）含z, y及a三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、乳糖通透酶和乙酞基转移酶，此外还有一个操纵序列o、一个启动序列p及一个调节基因。基因编码一种阻遏蛋白，后者与o序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列p上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白(cap)结合位点。由p序列、o序列和cap结合位点共同构成lac的操纵子的调节去。三个酶的编码基因由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。该操纵子有正负两种调节机制，lac编码的阻遏蛋白的负调节，和camp-cap的正调节。cap必须和camp形成复合物才能结合于dna。在环境中有葡萄糖的情况下，细菌不会利用象乳糖这样的碳源，细胞的camp水平下降，不利于形成camp-cap。阻遏蛋白有2个结合位点，一是操纵基因结合位点，二是诱导物结合位点。如果没有诱导物，阻遏蛋白就以活性状态结合于操纵基因，抑制结构基因转录。其诱导物就是-半乳糖苷，结合于阻遏蛋白后，使其失活，从操纵基因脱落，导致结构基因得以正常表达。如果环境中仅有-半乳糖苷该种碳源，laczya就被激活。在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。此时，i序列在pi启动序列操纵下表达的lac阻遏蛋白与o序列结合，阻碍rna聚合酶与p序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导，这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经-半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与o序列解离、发生转录。iptg是乳糖的结构类似物，可以与乳糖操纵子的阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白的空间构像变化，四聚体解聚成单体，失去与操纵子特异性紧密结合的能力，从而解除了阻遏蛋白的作用，保证基因转录的进行。与乳糖不同的是iptg不会被半乳糖苷酶水解，不受到负反馈调节的抑制，使转录持续进行下去。三、实验设备： 1恒温摇床；2.高速冷冻离心机；3恒温水浴锅；4.牛皮纸和棉纸；5.接种环和涂菌棒。四、实验试剂：1，含重组表达质粒的大肠杆菌（pet系列，购自invitrogen）；2，lb培养基；3，10mmol/l iptg；4. 1样品缓冲液；5100 mmol/l dtt；62%sds；7. 0.1%溴酚兰；8. 10%甘油；9.限制性内切ecori 和bamhi；10.目的基因lysozyme chlyz11. 10mg/ml 氨苄青霉素和卡那霉素。五、操作1.用限制性内切酶ecor i 和bamh i 分别对载体pet28a和目的基因chlyz（鸡溶菌酶）分别进行双酶切，胶回收试剂盒回收纯化载体大片段和目的基因；后连接入表达载体pet28a并转化到相应宿主菌中，筛选出含有重组子的转化菌株，提取质粒dna进行酶切分析或dna序列测定，以确定是否为重组子。2.真核基因的诱导表达和检测（1）挑取含重组子的阳性单菌落，接种于3ml lb培养基中，37摇培过夜。（2) 取5ul 培养物于2m1含适当氨苄青霉素或卡那霉素（根据载体选择合适抗生素）的lb液体培养基，37培养2hr，至菌液 a600=0.6-0.8。（3) 加iptg至终浓度为0.5-lmmol/l，继续培养3-5 hr。（4) 取上述培养液1.5m1，12000rpm离心l min。(5) 沉淀加入100 ul 1样品缓冲液振荡悬浮。（6）100加热5min, 12000 rpm，40离心l 0min。（7）取上清进行sds-page。鉴定目的基因是否表达。六、注惫事项1，本实验可能涉及两种与目的dna连接的载体，弄清它们在性质和功能上的区别。2，双酶切过程与前面的步骤相同，进行实验时还须借鉴之前的经验。七、思考题1真核基因在原核细胞中表达需要哪些条件？2如何防止外源表达蛋白不被宿主细胞降解？实验十一 表达产物鉴定sds-pag（凝胶电泳法鉴定目的蛋白质）一、目的、1.掌握sds-page电泳分离鉴定蛋白质的原理。2.学会sds-page电泳分离鉴定蛋白质技术。二、原理 sds-page为十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。是以聚丙烯酰胺为支持介质，对蛋白质进行分离与鉴定。电泳是指带电的胶体颗粒在电场中移动。胶体分子具有一定大小的分子半径，不同的胶体可以吸附大量的电荷，从而带上正电或负电，在电场力的作用下向与其电性相反的方向移动。蛋白质常以颗粒状态分散在溶液中。在电场中，根据它们所带净电荷向阴极或阳极迁移，迁移的方向取决于它们带电荷的极性。蛋白质一般是由不同数量和比例的20余种氨基酸组成的两性电解质分子。所带电荷的性质和多少随所处环境ph的变化而变化。从电泳的观点来看，蛋白质分子最主要的特征就是它的带电行为。每一种蛋白质分子都处于一定的ph环境中，它的氨基酸侧链基团或解离质子，从而带正电或带负电。在某一特定ph环境中，不同蛋白质分子的带电情况不同，所受电场力有差别，因而在电泳行为上也就会出现差异。再加上各种蛋白质在分子量、三维结构上的不同，3个因素共同影响了蛋白质电泳的涌动速率。 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酞胺（acr）和交联剂n, n一甲叉双丙烯酰胺（bis）在引发剂过硫酸铵（ap）和加速剂四甲基乙二胺（temed）的作用下聚合交联成三维网状结构的。凝胶浓度过高时，凝胶硬而脆，容易破碎。反之凝胶稀软，不易操作。交联度过高，凝胶不透明缺乏弹性，反之凝胶成糊状。凝胶浓度的正确选择尤为重要，如果凝胶浓度太大，孔径太小，电泳时样品分子不能进入凝胶；如果凝胶浓度太低，孔径太大，则样品中各种蛋白质分子均随着缓冲液迁移而不能分开，因此不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。 sds-page采用由浓缩胶与分离胶组成的不连续的凝胶系统。浓缩胶的胶浓度低，孔径大，而分离胶浓度则较高，孔径小。首先，在电场的作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中涌动时受到的阻力小，移动速度快。当进入小孔胶时，蛋白质颗粒受到的阻力大，移动速度减慢，因而在两层凝胶的交界处，就会由于凝胶孔径的不连续性，使样品迁移突然受阻而被压缩成很窄的区带。即在蛋白样品进入分离胶后，以各自迁移速率的不同而彼此分离。如果样品和聚丙烯酞胺凝胶中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(sds )和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于蛋白亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。sds作为变性剂和助溶性试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂如-疏基乙醇和二硫苏糖醇（dtt）则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在蛋白质样品和凝胶中加入sds和还原剂后，蛋白质分子解聚成亚基，解聚后的氨基酸侧链与sds充分结合，形成带负电的蛋白质亚基-sds复合物。sds蛋白质复合物所带的负电荷大大超过了大蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同种类蛋白亚基间原有的电荷差异，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，电泳迁移率仅仅取决于蛋白质分子质量。 sds-page凝胶电泳所需仪器设备较简单，操作方便，重复性好，且不需非常纯的样品，因而被广泛用于蛋白质相对分子质量测定及蛋白质纯度鉴定。三、实验器材1.微型凝胶电泳装置2.三恒稳压稳流电泳仪3. ph计4.高速冷冻离心机5水平摇床6微量取液器（吸头）7.微量注射器8.10ml注射器9.1.5m1离心管10.50m1离心管四、实验试剂1.含重组子的大肠杆菌2.蛋白提取液：25mmol/l tris-hc1 (ph7.5 )、10mmol/l kci, 20 mmo1/l mgcl2, l mmol/l dtt, 1 mmol/l pmsf（现用现加）3.蛋白溶解液：0.0625mmol/l tris-hcl (ph7.5 )、2%sds, 10%甘油、5% -疏基 乙醇、0.001% 溴酚兰。4.电泳储存液52mo1/i tris-hcl（ph8.8），100m16lmol/1 tris-hcl（ph6.8），100m17. 10%sds，100m18.50%甘油：量取50m1 100%的甘油，加入50ml ddh20。高压灭菌，备用。9. 1溴酚兰：称取100mg溴酚兰，加ddh20至loml，搅拌直到完全溶解，过滤去除聚合的染料。10.考马斯亮蓝染液：称取考马斯亮蓝g250 1g，加450ml 乙醇，100ml 冰乙酸、450ml ddh20。11.脱色液：乙醇 250ml , dd h20 675 ml，冰乙酸 75ml。五、操作1.去1.5ml 表达菌液，10000rpm 4 离心10min，加1上样buffer重悬，100煮沸10min，10000rpm 4 离心10min，取上清电泳。如果是提取的纯化蛋白则按下述制样（提取的蛋白质样品最终溶解在1样品缓冲液中，故应事先计算好缓冲液的用量及稀释倍数。关于蛋白质样品的终浓度，由于电泳仪器与凝胶厚度对样品承载量有不同的限定范围。一般而言，可以将蛋白质烘干，称量出100-1000mg，溶解于50-100 u1的l样品缓冲液中）。2.电泳操作灌制分离胶：装配好灌胶用的模具。将分离胶装配在一个小烧杯中，操作时必须戴手套。加入ap和temed后，轻轻混匀不要产生气泡，否则会干扰聚合。小心将凝胶缓慢加入模具中，注意在凝胶中不能产生气泡。凝胶液加至距前玻璃版（较短的玻璃板）顶端约1.5cm处，轻轻在胶面上铺盖一层5mm的水。当凝胶聚合后，在分离胶和水层之间会出现一个清晰的界面，将水层吸净。灌制浓缩胶：将凝缩胶配制在小烧杯中，用移液枪将浓缩胶加至分离胶的上面，直至前玻璃板的顶端，并插入梳子，确保梳子齿的末端没有气泡。凝胶聚合后，将凝胶板装入电泳槽内。加入电泳缓冲液，拔去梳子。蛋白样品的处理： a蛋白样品的变性：100 5min o b10000 rpm 4 离心5min。 c用微量注射器将样品加入样品孔中。电泳：电泳仪与电源相接，电流应流向阳极。可采取稳压或稳流。当溴酚兰的前沿迁移至凝胶的底部时，关闭电源。然后将胶剥离在培养皿中（预先加上固定液），测量溴酚兰的迁移距离。3.染色：立即将电泳后的凝胶放入考马斯亮蓝溶液中染色20-30 min。然后换用脱色液脱去底色，直到蛋白质清晰为止。六、注意事项1固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板。2凝胶配制过程要迅速，催化剂temed要在注胶前再加入，否则凝结无法注胶。3凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。4样梳需一次平稳插入，梳口处不得有气泡，梳底需水平。5. 要使锯齿孔内的气泡全部排出，否则会影响加样效果。6. 注射器不可过低，以防刺破胶体，也不可过高，在样下沉时会发生扩散。7为避免边缘效应，最好选用中部的孔加样。8剥胶时要小心，保持胶完好无损，染色要充分。9水封的目的是为了使分离胶上沿平直，并排除气泡。七、思考题1请思考page凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度关系？2依据sds的作用原理，请思考计算所分离出的蛋白代的分子量是天然蛋白质的分子量吗？3在sds-page测定蛋白质分子量时，必须加入过量的sds和疏基试剂，为什么？实验十二 重组蛋白的分离纯化 近年来随着生物技术的进步，特别是基因工程的迅猛发展，表达蛋白己经变得很容易，相对而言，纯化却是一个非常繁杂的工作，所以越来越多的研究者把需要表达的目标蛋白和亲和纯化用的标签融合表达，这样纯化相对容易，即使如此，由于蛋白的多样性，纯化依然是比较复杂而专业的工作，尤其对于不熟悉纯化的研究者而言，它成为一个项目的瓶颈。重组蛋白可在e.coli、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等体系中得到高效表达，其表达形式一般可分为：（1)细胞外的分泌表达；(2)细胞内可溶性表达；(3) 细胞内不溶性表达，即产物以包涵体的形式存在。因此，对于重组蛋白的纯化要依据其表达形式的不同，采取不同的纯化工艺。例如，当重组蛋白以包涵体形式存在时，就需要对包涵体进行变-复性处理。然而不论以那种表达形式产生的重组蛋白，其纯化的方法都与传统的生物大分子分离方式相似。重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异，即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。当前蛋白质的纯化主要是依靠层析和电泳技术。由于重组蛋白在组织和细胞中仍以复杂混合物的形式存在，因此到目前为止还没有一个单独或一整套现成的方法把任何一种蛋白质从复杂的混合物中分离出来，而只能依据目标蛋白的物理化学性质摸索和选择一套综合上述方法的适当分离程序，以获得较高纯度的制品。 今后重组蛋白的分离纯化的技术发展，将朝着快速，高分辨率，高上样量，易于操作，低成本和自动化等技术方向发展。一、目的 1掌握色谱纯化-复性蛋白质的原理。 2熟悉蛋白质色谱纯化-复性的操作过程。二、原理将目的基因连接在表达载体后，通过iptg诱导目的基因表达。表达载体除具有蛋白表达所需要的启动子外，在终止子前有6个his编码序列，便于蛋白的亲和层析纯化。亲和层析以蛋白质或生物大分子和结合在介质上的配基间的特异亲和力为基础。本实验采用结合了ni2+的介质在变性条件下对融合蛋白进行分离纯化，只需通过“结合-清洗-洗脱”三个简单的操作步骤就可完成。 也可以采用凝胶层析法(gel filtration)就是利用层析凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又称为分子筛层析法或排阻层析法（层析原理见生物化学有关内容)。三、溶液配制：gunta-0 buffer: 20 mm tris-hcl ph 7.9, 0.5 m nacl, 10glycerol，6m guanidium hcl。gunta-20 buffer：20 mm tris-hcl ph 7.9, 0.5 m nacl, 10glycerol，6m guanidium hcl ，20 mm imidazole。gunta-40 buffer: 20 mm tris-hcl ph 7.9, 0.5 m nacl, 10glycerol，6m guanidium hcl ，40 mm imidazole。gunta-60futer: 20 mm tris-hcl ph 7.9, 0.5 m nacl, 10glycerol，6m guanidium hcl ，60 mm imidazole。gunta-100buffer: 20 mm tris-hcl ph 7.9, 0.5 m nacl, 10glycerol，6m guanidium hcl ，100 mm imidazole。gunta-500 buffer: 20 mm tris-hcl ph 7.9, 0.5 m nacl, 10glycerol，6m guanidium hcl ，500 mm imidazole。5m1注射器若干；层析管；高速离心机；层析架、收集器；sephadex g-75葡聚糖凝胶；二硫苏糖醇（dtt），磷酸na；透析袋。四、操作步骤1.重组蛋白表达，见实验10。2.收集细菌（每组50-100m1,分两次收集），5000 rpm 4 离心3min。0.01m ph 7.2 pbs缓冲液清洗2，同样条件离心后再次收集菌体。3破细胞每10 ml 菌液的菌体加入1-2 ml 结合液悬浮。加入溶菌酶4 u1 (100mg/l），使得终浓度为1mg/ml，放置冰浴中30-60min充分酶解，超声破碎。5000 rpm 4离心 5min，收集上清液4贮存，接下一步层析纯化。4. 如果是包涵体表达，则步骤3 离心后，去上清，留沉淀，洗涤（洗涤液1： 60 mm edta，4% triton x-100，1.5 m nacl，ph7.0；洗涤液2：0.1 m tris-cl，20 mm edta, 2m urea, ph7.0 各洗2次），最后用包涵体溶解液溶解（0.1 m tris-cl, 8 m urea，5 mm dtt, ph 8.0），rt 4-5h，或冰箱中过夜。（一）、ni 柱法5.将4 的液体12000 rpm 4 离心 20 min。弃细胞碎片与沉淀，取上清用于过柱。6.过ni 柱1）将nta 树脂装入合适的层析柱，层析柱用10倍nta 体积的gunta-0 buffer洗。2) 将样品（见步骤2 或5）加到nta 层析柱中，流速控制在15 ml/小时 左右，收集流出液，用于sds-page 分析蛋白质的结合情况。3) 层析用5倍n