《哺乳动物细胞克隆》PPT课件.ppt

哺乳动物的克隆 From the skin cells 第八章 动物细胞工程实践之 本章主要内容 8.1 动物克隆技术发展简史与意义 克隆“多莉”羊的具体操作过程 “多莉”羊独特点及成功的根本原因 克隆人胚胎引发争议 克隆技术未来的发展 8.3 体细胞克隆动物 胚胎分割法 细胞核移植技术的原理与方法 8.2产生遗传相同个体(克隆）的原理与方法 简史、克隆动物研究意义 克隆定义 n克隆(clone)的音译，原意指用于扦插的枝条，也 即无性繁殖。1963年Haldane最先使用“clone”, 至世纪7080年代，克隆一词开始广泛使用。 n遗传学定义的“克隆”:指遗传上完全相同的分子 、细胞或来自同一祖先的生物个体，通过无性繁殖 而形成的群体。在不发生突变的情况下，它们具有 相同的遗传结构。 n“克隆”分为分子克隆、细胞克隆和个体克隆三 个层面。 n在分子层次上，-“分子克隆”。将DNA片段 插到一个载体中，在宿主细胞中自我复制。 n在细胞层次上，-单克隆抗体。指由一个单一 的共同祖先细胞所形成的一个细胞“群体”。 n 在个体层次上，克隆是指基因型完全相同的2 个或更多个体组成一个“群体” 。 n1997年，世界卫生组织（WHO）解释克隆： 克隆为遗传上同一的机体或细胞系（株）的无性 繁殖。 8.1 动物克隆技术发展简史与意义 n8.1.1 简史 n 由“胚胎分割”开始。1978年，建立了 卵裂球分离和桑葚胚分离技术。之后对胚 胎分割程序简化和提高胚胎分割效率研究 ；现已发展到不依赖于显微操作，而在实 体显微镜下操作的胚胎分割。 n 在胚胎分割基础上，开始“细胞核移植 ”研究。“细胞核移植”才是技术含量最 高的动物克隆。 n1938年，Spemann提出以核移植生产克隆动物 的设想开始，1952年，产生了世界上第一种克 隆动物非洲豹蛙； n1963年，我国胚胎学家于克隆出亚洲鲤鱼； n1997年Wilmut等利用成体细胞核移植技术获得 克隆绵羊“Dolly”，在动物克隆研究领域取得 了重大突破。 n迄今为止，动物克隆在各国如火如荼，成功克 隆的动物有20余种，包括鱼、羊(绵、山羊)、老 鼠、猫、狗、牛、马、兔子、骡子、猪、狼、猕 猴等。 动物克隆的里程碑事件： 20余种克隆动物大盘点 1 鲤鱼 童第周早在1963年就通过将一只 雄性鲤鱼的遗传物质注入雌性鲤鱼的卵中 从而成功克隆了一只雌性鲤鱼。 2 克隆羊 1996年7月5日，世界上第 一头由成年羊体细胞经过无性繁殖生成 的克隆羊多莉诞生 3、克隆老鼠Cumulina 1997年，夏 威夷科学家从成年小老鼠的细胞复 制出第一只克隆小老鼠，名叫 Cumulina。 4、克隆奶牛 日本石川县家畜研究中心在 世界上率先从体细胞复制牛，首两头克隆牛 分别名为“KAGA-号”和“NOTO一号” 5、克隆山羊 世界上第一批三只克 隆山羊已由美国一家生物公司于 1998 年“制造”出来。克隆山羊Mira 和她的姐妹们都来自美国的实验室 ，它们生产含有人类抗凝血酶-3（ antithrombin lll ）的羊奶。 6、首个克隆猪 英国产生克隆绵羊“ 多莉”的公司，在美国的分部成功地 产生了5头克隆猪。 图8-5 耳上皮细胞克隆羊”阳阳”左和其原型”青 青” 出自：西北农林科技大学张涌等，2000.6.22 图8-6 “阳阳” 5岁生日及其后代，四世同堂，当上太姥 姥 证明了第一代克隆羊及其后代都具有正常的生育能力. 7、克隆摩弗伦羊 摩弗伦羊（又称欧洲盘羊 ）是一种濒危物种，全世界所存野生盘羊不足 一千只，2000年，科学家从两头分别死亡将近 18小时和24小时的雌盘羊卵巢内取出DNA，将 其注入盘羊的“近亲”普通白羊的去核卵细胞 内，155天后正常的产下一只小盘羊。首次把克 隆技术应用于一种濒临灭绝的哺乳类动物身上 。 8、克隆猕猴 2000年1月，一只 克隆猕猴在美国俄勒冈地区灵长 类动物研究中心呱呱坠地。这是 全世界第一次成功地克隆灵长类 动物在基因上与人类最接 近的动物。 9、克隆野牛 2001年1月8日，这 只名叫“诺亚”的印度野牛（濒危 野生动物 ）在美国爱荷华州诞生 ，体重80磅。只活了一天。 10、克隆兔 2001年，体细胞克隆兔诞生。 出自：山东莱阳农学院教授 董亚娟，柏学进等，2001.12 美科学家进行商业猫克隆 售价5万美元的克隆猫小尼基和它 的主人 Opening the way to replicating pets and other valued animals 11、克隆猫CC 美国得克萨斯农工大学于 2001年培育的第一只克隆猫CC。 12、克隆老鼠“拉尔夫” 大 老鼠难以复制，2002年复制的 名为“拉尔夫（Ralph）”的老鼠 是第一只。 13、克隆骡子 2003年5月5日，一头 名为“Idaho Gem”的骡子在母驴子宫 中经过346天的正常妊娠期后降生。 克隆骡子：“爱达荷宝石” n2003年5月29日,美国科学家宣布克隆了一头骡子，为 世界范围内第一次克隆出马科动物，也是克隆杂种动物 的首次成功尝试。 n方法：从骡子胚胎细胞核内提取DNA（脱氧核糖核酸） ，将其与去核的马卵母细胞细胞结合.形成杂种胚胎。 n该成果意义:首先,有助于克隆其他自身繁殖有困难的 濒危动物;其次,对研究癌症等疾病有重要的参考价值。 一些癌症患者细胞内Ca2+含量异常高。而马科动物细胞 内的钙含量比人低,已识别出其细胞中含有一种化学物质 ,能够抑制细胞内钙含量增高。 克隆骡“爱达荷宝石” 2004年在西雅图展出的三匹克隆骡子 两头“出身竞赛名门”的克隆骡子兄 弟于2006年6月参加了美国西部地区 举行的一次“专业赛跑比赛”，结果 它们最终仅仅在有八名“参赛选骡” 参加的短距离跑步项目中名列第三和 第七名。 -为美国的癌症研究活动筹集更科研 经费。 -海外博览 2006年06月06日 14、克隆马 意大利克雷莫纳的 再生技术实验室的研究人员于2003 年5月底克隆出了第一只驮马，这 意味着马也加入了猫、山羊、母牛 、兔子以及绵羊等被人类克隆过的 动物行列。 15、克隆非洲野猫 2003年8月6号 ，奥特朋濒危动物研究中心的研究 人员通过单体克隆技术首次成功克 隆出一只非洲野猫。 16、克隆鹿 2003年5月23日，美国 德州农业机械大学克隆出世界第一 只白尾鹿，名字叫“杜威（Dewey） ”。从一头死去的白尾雄鹿皮肤样本 的成纤维细胞作核供体. 17、克隆雪貂 2004年，就职于美国 依阿华大学的李子义教授成功培育 出了世界首批“克隆雪貂”， 18、克隆水牛 印度克隆出的 世界上的首头水牛已经死于肺 部感染。 19、克隆狗 2005年，韩国汉城国 立大学兽医学院的科学家率先在世 界上首次成功进行了狗的克隆。 20、克隆狼 首尔大学教授李柄 千和申南植领导的研究小组于 2005年10月18日和26日先后获得 了两头体重分别为430克和530克 的雌性克隆狼。 两只克隆狼的名字分别为 Snuwolf和Snuwolfy。被克隆的 灰狼是韩国环境部指定的1级野 生保护动物。 治疗性克隆 动物模型 器官移植 濒危动物 转基因动物乳腺生物反应器 基础研究 遗传育种 克 隆 （2）克隆动物研究意义 8.2 产生遗传相同个体(克隆）的原理与方法 n胚胎分割 n细胞核移植（包括连续细胞核移植或 继代核移植或重复克隆）。 n以奶牛为例，产生相同遗传个体的方 法有五种：胚胎分割；胚胎细胞； 胚胎干细胞；胎儿成纤维细胞； 体细胞克隆等。 8.2.1 胚胎分割法-“多胚胎复制”的原理与方 法 n定义：着床的早期胚胎经显微手术后，分 割为二、四、六等多等份，给每个受体子 宫内移植一块分割物而妊娠产仔，这样由 一个胚胎产生出多个遗传性能完全一样的 后代个体。 n严格讲，这种胚胎克隆只能算“多胚胎复 制”。随着分割次数增加，发育成完整个 体的能力越差。 (1)基本原理 n软体动物和部分昆虫为镶嵌发育类型:从胚胎发育的2 细胞起，每个分裂球将要发育成什么样的器官组织，在 受精以后就已规定下来。去掉任何一个分裂球，就不能 发育成为一个完整胚胎。 大多数哺乳动物为调节发育类型:具有调节发育的能 力。特点： 第一,去掉早期胚胎的一半，其余部分可以调整发育 方向，仍可形成一个完整胚胎。 第二，将两个胚胎融合在一起，仍发育成一个胚胎 。 第三，调整发育分化能力随胚胎发育的进行逐渐减 弱，组织发育方向变得愈来愈固定。直至调整能力完 全丧失。 n研究表明，哺乳动物从早期分裂阶段到 原肠胚胚胎都能够复制。此后，胚胎的发 育能力会随着胚胎所达到的发育阶段而改 变。 n如：分割胚的胚细胞只负责构成胚盘， 胚盘的正常发育需要滋养层细胞。所以,在 分割胚时应包括应滋养层细胞，否则不足 以引起妊娠产仔。 （1）卵裂球分离培养法 用吸管固定胚胎，用玻璃针自上而下切开透明 带使其形成一个切口，用微吸管自切口处伸入 透明带吸住半数卵裂球，等分胚胎为两部分。 将分得的半胚装入空透明带中，置于血清中使 其中充满血清。 琼脂包埋后，移入受体输卵管。 培养35d,发育到桑葚胚或囊胚时回收琼脂筒 ； 去掉琼脂，选择发育好的胚胎进行移植，产仔 。 (2)桑葚胚及其以后阶段的直接分割法 n这一阶段的胚胎分割时，可用固定吸管固定胚 胎或不进行固定而直接分割。 n囊胚阶段前的胚胎，要对透明带作软化处理。 否则，由于透明带的韧性，在分割时一部分卵裂 球会受到机械损伤。 n之后，将胚胎连同少量分割操作液置于分割皿 上，用显微玻璃针、显微刀片分割或徒手分割。 图8-1 分割针垂直分割胚胎示意图 图8-2 半胚装入透明带示意图 图8-3 “分割刀”水平分割胚胎示意图 8.2.2 细胞核移植技术 n细胞核移植（nuclear transfer）技术是目前最 常用的、科技成分含量高的动物克隆技术 ，是动物克隆技术的核心。 n细胞核移植技术：是利用显微操作仪，将 外源细胞的核移植入去核卵母细胞中，经 人工活化和体外培养后再移植入代孕母体 内，使其发育为含有与供体细胞相同遗传 物质的个体。 (1)原理 胚胎细胞核移植到成熟卵母细胞中，可 因其特殊因子的作用，使植入的核基因表 达被重新编排或调整，将“发育钟”拨回 到受精状态，即恢复全能性。 胚胎干细胞具有全能性及调整能力。 胎儿成纤维细胞和成年体细胞等分化细 胞在经过“去分化”培养后，可以恢复其 全能性。 (2)细胞核移植技术 n第一,有三种做核受体的胞质：卵母细胞（ M期）胞质、原核期受精卵胞质、2C胚胎的 胞质。 n研究表明，以M期卵母细胞胞质为核移植 的受体细胞最好,目前应用也最普遍。 n卵母细胞来源有两种：超排（数量少）、屠 宰场收集卵丘-卵母细胞复合体（COC）在体 外培养成熟后作为受体（数量大）。 n受体胞质的准备 图8-4 核受体成熟卵去核过程示意图 第二,受体卵去核 核供体细胞的准备 n核供体细胞主要有两大类三种：胚胎细 胞(胚胎细胞、胚胎干细胞)和体细胞 。 n第一,胚胎细胞核移植：通过显微手术分 离未着床早期胚胎的单个细胞，并将其导 入去核的成熟卵母细胞，核质融合后发育 为胚胎。 n方法：消化掉卵裂球外面的黏 蛋白层和透明带，用细玻璃管吹 打胚胎细胞，使其分散成单细胞 后进行核移植。 n如果连续对核移植胚胎分散为 单细胞，作细胞核移植供体，得 到的克隆胚胎称为第二、第三代 .克隆胚，依次类推。这种技 术称为“胚胎继代克隆”（ multiple generational embryo cloning）或胚胎再克隆（ embryo re-cloning）。 n在山羊，已获得15代连续核 移植山羊45只，其中有7只山羊 来自一个胚胎。 n第二,胚胎干细胞核移植：胚胎干细胞是 将早期胚胎或胎儿的原始生殖细胞经体外 抑制分化培养后，筛选出的具有发育全能 性的细胞。 n核移植方法：与胚胎细胞相同。利用胚 胎干细胞核移植能生产更多的动物个体。 但目前仅在小鼠分离克隆出胚胎干细胞系 并成功克隆出成体鼠。 n第三,体细胞核移植：用已高度分化的细 胞作核供体。包括： -胎儿体细胞：由妊娠早期胎儿组织分离 、克隆以及传代培养的胎儿成纤维细胞。 -成年体细胞：卵丘细胞、颗粒细胞、乳 腺上皮细胞以及皮肤成纤维细胞等。 受体 受体 体细胞供体 核供体 再稀释沉淀，分散沉淀细胞 体细胞核移植方法： 将组织切成碎片 消化、低速离心（1 000r/min） 取上清，中速离心（3 000r/min），获沉淀的细胞核 获得单个体细胞，在37、5%CO2下培养，备用 1 2 3 4 5 (3)核移植胚的重构（核质融合 ） 按照供体核植入受体卵的部位，将细胞核移植 分为两种：即胞质内注射和透明带下注射。 A.胞质内注射：用一个外径510m的注核针 吸取卵母细胞核后，刺破卵质膜，将核直接注射 到受体细胞质内的方法（见下图）。 B.透明带下注射：把供体细胞核注射在透明带 与卵母细胞之间的卵周隙中，核移植后用电刺激 进行细胞融合，形成重组胚。 图4-4-17直接注射法制作重组胚过程示意图 图85 直接注射法制作重组胚过程示意图 (4)核移植重组胚的激活 激活是胚胎发育所必需的。受精和人工 方法均能激活卵母细胞。 原理：通过电刺激、钙离子载体等方法 ，使卵母细胞从MII中解放出来，并转入 “受精”状态。电融合时的电脉冲也施加 了激活重组胚的作用。 (5)重组胚的体内或体外培养： 将融合和激活的重组胚移入中间受体作体内 或体培养，观察重组胚的发育率。羊、牛、猪的 核移植胚常采用体内培养方法获得桑葚胚和囊胚 。大鼠、小鼠和兔的核移植胚多作体外培养，发 育至桑葚胚或囊胚。 (6) 胚胎移植 将合格重组胚胎移植至假孕母体至发育到期 产出。 图8-6 小鼠核移植实验 与供体基因型一致 图8-8 体细胞克隆小鼠 图8-7 体细胞克隆小鼠 技术路线 奶牛克隆过程 代孕牛 图8-9 以奶牛为例的产生克隆动物技术路线示意图 1 2 3 4 5 供卵动物 (黑牛) 供核动物 (黑白花牛) 几种克隆方法汇总 8.3 体细胞克隆动物-多莉羊的产生 图8-10 克隆多莉羊技术路线示意图 （或植入到另一只羊的结扎的输卵管内，体内培养） 1997.2.23，英格兰爱 丁堡罗斯林研究所和 PPL制药公司宣布，于 1996年7月无性繁殖了 一头雌性小绵羊“多莉 ”。被誉为二十世纪生 物学领域的突破性成就 。 图8-11 克隆羊多莉组图 8.3.1 克隆“多莉”羊的具体操作步 骤 n(1)获取供体细胞 取处于后1/3妊娠期的6岁白色（白面 ）母绵羊A（芬兰多塞特绵羊）的乳腺细胞作核供体细胞 (具54条染色体,体外培养传代到第3代至第6代细胞),用 “饥娥法” 10%FCS（foetal calf serum小牛血清 ）、1%FCS和0.5%FCS连续培养5天，使其进入G0期用作供 体细胞。 n(2)获取卵母细胞 给另一只母羊B（苏格兰黑面绵羊） 注射促性腺激素Gn促使其排卵，取其未受精卵并去核。 用饥饿法连续培养5d，使其进入G0期用作受体细胞。 (3)重构胚的融合 将核供体细胞注入去核的卵母细胞 的卵周隙。之后，将乳腺细胞与无核卵放入同一培养皿 中，在微电流的作用下使乳腺细胞融入卵中，形成一个 含有新的遗传物质的卵细胞。 (4)重构胚的孵育与移植 新的卵细胞在体外培养（或 植入到另一只羊的结扎的输卵管内），6天后发育为桑 椹期胚胎或囊胚（816细胞期），再移植给假孕母羊 的子宫内。 (5) 产下6岁母羊的复制品-白色“多莉”羊。 8.3.2 多莉”羊独特点及成功原因 (1)独特点: 核供体是高度分化了的体细 胞-乳腺上皮细胞，而非早期胚胎细胞 。 (2)成功的根本原因：采用血清逐级递减 的“饥饿法”减慢细胞生长速度，使核 供体细胞与核受体细胞的细胞周期同时 进入G0期，通过这一同步方法，实现了 胚胎正常发育到期。 8.3.3 对“多利”羊身份的质疑及最后的定 论 (1)质疑： 第一，成功率在低，具有偶然性。 Ian Wilmut用 了434体细胞 277(融合成功)247(输入子宫 )29(桑椹胚)13(只绵羊)1头多莉羊。以此计 算体细胞移植的成功率，总体是1/434，即成功率 为0.23%。 第二，多莉羊是否真来源于乳腺上皮细胞? 供体 细胞来源于已死于1995年的一只6岁怀孕绵羊， 多莉羊是否来源于乳腺组织中混入的胚胎细胞， 若如此，则与几十年前已成功的胚胎细胞核移植 无异。 （2）验证 n首先，从生理上讲，由循环系统得到的 胚胎可能性很小。因为“胎盘”是一道天 然的过滤屏障，胚胎细胞很难透过“胎盘 ”进入血液循环再到达乳腺。 n其次，用微卫星DNA技术和DNA指纹分 析冷冻的供体乳腺组织、体外培养的乳腺 细胞系及多莉羊的血样后，证明产生多莉 羊的供体来自高度分化的乳腺细胞 8.4 动物克隆存在的问题 动物克隆技术的不完善性; 克隆胚胎妊娠率低、流产 率高； 胎儿胎盘大、出生率低； 出生后常出现呼吸、消化 等系统的异常。 人们认为这与体细胞在受 体卵母细胞中全能性的恢复 有关。 图812 克隆动物异常 在核移植胚胎中，细胞核和细胞质可以是来源 于不同的动物个体，甚至是不同的物种。核质 之间协调互作是供核完成重编程并指导全程发育 的先决条件。 哺乳动物核移植中，无论采用电融合法还是胞 质内注射法重构卵，不可避免的将部分供体线粒 体带入受体卵胞质，即重构卵胞质中有供体又有 受体来源的线粒体。 8.5 线粒体与核移植的关系 只剩下受体类型的线粒体。和正常受精胚胎发育 中线粒体变化相似，供体来源的线粒体被受体卵胞 质所识别，被蛋白水解作用降解并消失; 两种来源的线粒体可同时存在。重构胚或核移植 个体中的线粒体呈异质性; 重构胚或核移植个体中以供体类型的线粒体占主 导。受体来源的线粒体被选择性降解，供体来源的 线粒体选择性复制。 核移植中线粒体可能的三种命运 n用线粒体细胞色素B 基因特异的引物扩增体外 培养的猕猴-兔异种克隆胚胎中的线粒体DNA， PCR产物经测序证明，细胞至囊胚期胚胎中同时 存在猕猴体细胞与兔卵胞质来源的线粒体。 n通过实时荧光定量监测表明，就单个胚胎讲， 供体细胞来源的线粒体与受体卵来源的线粒体从 1-细胞期到桑椹胚期其含量都保持恒定； n卵子来源的线粒体在囊胚期经历复制，而供体 细胞源的线粒体在囊胚期略有降解。 8.6 克隆动物的生命力与生育力 (1) 早衰问题 1995年5月，克隆“多莉”羊的 英国PPL医疗公司和罗斯林研究所宣布，“多莉 ”的染色体端粒长度比同年龄普通绵羊短20% 。随年龄增长，端粒变短。这就意味着“多莉 ”可能比普通羊衰老得更早。但杨向忠等对10 头克隆牛研究发现，克隆动物与并无差异。 (2) 生育能力 杨向忠（1999）利用1头13岁母 牛的耳朵皮肤细胞克隆牛诞生(在人类相当于80 岁) 。这头牛的后代通过自然繁殖产下一头重 40.2kg的牛犊。说明老龄细胞经过克隆后可以 在遗传和生理上转化成全新的新生细胞。 图8-13 英科学家克隆出人类胚胎 8.7 克隆人胚胎引发争议 图813 治疗性克隆与生殖性克隆技术路线示意图 克隆人违犯了伦理学三原则 (1)