《吉林大学HE染色》PPT课件.ppt

常规标本的制作和常规标本的制作和HEHE染色染色 薛辉 吉林大学基础医学院 切片的一般程序切片的一般程序 封固 石蜡切片 取材 固定(24-48h) 脱水(70,80%4h;90,95%2h,100%1h(2) 透明(二甲苯10min(2) 浸蜡(30min(3) 包埋 切片 染色 显微标本制作技术显微标本制作技术 从保存时间长短分，有临时玻片标本和永久玻片标本。从制作的方法 来分，有涂片、压片、装片(也叫整装法)、磨片和切片等 。 l切片法 l徒手切片法 l石蜡切片法 l火棉胶切片法 l冰冻切片法 材料和夹持物 切取 的标 本 1.徒手切片法 滴水滴水 放置标本放置标本 加盖盖玻片加盖盖玻片叶的横切叶的横切 取取 材材 1. 材 料 新 鲜 最 好 是 动 物 的 心 脏 还 在 跳 动 时 取 材 ， 立 即 投 入 固 定 液 内 。 应 争 取 在 死 后 半 小 时 内 处理 完 毕 2. 组 织 块 力 求 小 而 薄 ,以 不超 过 5毫 米 为 在 可 能 范 围 内 也 应 力 求 短 小 。 以 使 固 定液 能 迅 速 而 均 匀 地 渗 入 组 织 块 内 部 3. 勿 使 组 织 块 受 挤 压 。 取 材 时 ， 组 织 块 可 稍 取 大 一 点 。 4. 要 熟 悉 取 材 的 部 位 要 能 准 确 地 按 解 剖 部 位 取 材 ， 如 胰腺 ， 一 般 取 胰 岛 较 多 的 胰 腺 尾 部 ， 脊 髓 取 腰 膨 大 与 颈 形 大 5. 选 好 组 织 块 的 切 面 纵 切 或 横 切 往 往 是 显 示 组 织 结 构 明 晰 的 关键 。 6. 保 持 材 料 的 清 洁 组 织 块 上 如 有 血 液 、 污 物 、 粘 液 、 食物 、 粪 便 等 ， 可 用 生 理 盐 水 冲 洗 ， 然 后 再 入 固 定 液 ， 但 要 注 意 防止 组 织 损 伤 。 l空腔性器官 注意横断面和纵断面 保护内皮和粘膜 横断：气管、食管、血管 纵断：胃底、肠、心脏 心瓣膜 左心室 左心 房 l特殊的组织或者器官 血液、骨髓：涂片 肌肉、神经： 骨、牙齿：脱钙 切片 酸 固固 定定 的的 方方 法法 1. 蒸 气 固 定 法 比 较 细 小 而 薄 的 标 本 ， 可 用 饿 酸 或 甲 醛 蒸 气 固 定 。 主 要 用 于 血 液 或 细 胞 涂 片 以 及 某 些 薄 膜 组 织 等 的 固 。 如血液 涂 片 ， 则 应 在 血 片 未 干 燥 前 就 与 饿 酸 蒸 气 接 触 2注 射 、 灌 注 固 定 法. 某 些 组 织 块 由 于 体 积 过 大 或 固 定 掖 极 难 渗 入 内 部 或 需 要 对 整 个 脏 器 或 整 个 动 物 进 行 固 定 。 如 肺 可 将 固 定 液 从 气 管 或 支 气 管 注 入 .全 身 灌 注 固 定 较 大 动 物 如 兔 、 猫 、 狗 、 猴 及 整 个 人 体 ,固 定 液 输 入 后 ， 可 不 必 即 刻 取 材 。小 动 物 ， 如 大 、 小 鼠 ，也可灌流固定. 3. 小 块 组 织 固 定 法. 从 人 体 或 动 物 取 下 的 小 块 组 织 ， 须 立 即 置 入 液 态 固 定 剂 中 进 行 固 定 ， 这 是 应 用 最 广 泛 最 经 常 的 方 法 。 固固 定定 的的 目目 的的 1. 迅 速 阻 止 组 织 、 细 胞 的 死 后 变 化 ， 防 止 自 溶 与 腐 败 ， 使 之尽 量 保 持 生 前 的 状 态 与 结 构 。 2. 使 细 胞 内 的 蛋 白 质 、 脂 肪 、 糖 ， 酶 等 成 分 转 变 为 不 溶 性物 质 ， 以 保 持 其 原 有 状 态 。 3. 使 组 织 内 各 种 物 质 成 分 产 生 不 同 的 折 光 率 ， 以 便 染 色 后 易 于 鉴 别 和 观 察 4. 使 组 织 块 在 脱 水 、 包 埋 、 切 片 、 染 色 等 过 程 中 不 易 损 坏 。 5使 不 同 组 织 成 分 对 染 料 有 不 同 的 亲 和 力 ， 经 过 染 色 处 理 后易 于 辨 认 。 6. 防 止 细 胞 过 度 收 缩 或 膨 胀 而 失 去 其 原 有 形 态 结 构 。 7. 使 组 织 块 硬 化 ， 便 于 制 作 薄 片 。 注注 意意 事事 项项 及及 影响影响 固固 定定 的的 因因 素素 1. 组 织 块 不 宜 过 大 ， 一 般 以 厚 度 5 毫 米 ， 长 宽 不 超 过 15x15毫 米 。 2. 固 定 液 的 量 一 般 以 组 织 块 大 小 的 20倍 为 宜 3. 必 须 选 择 渗 透 力 强 ， 又 不 使 组 织 过 度 收 缩 或 膨 胀 的 试 剂做固定剂. 石蜡切片标本的固定石蜡切片标本的固定 l固定液：10%中性福尔马林 l固定时间：室温3个小时，1个小时后修块。 l固定方法： 容器底部垫上脱脂棉或者滤纸。 肺脏：液体表面覆盖脱脂棉。 空腔脏器：浆膜面平铺在纸板上用大头钉固定。 胆囊放在单独的容器内。 脑、脊髓、松软的肿瘤、病变组织：先固定后切开。 脑最好悬吊在固定液中。 睾丸、囊性组织：向腔内注入较高浓度的固定液。 骨骼标本：剥离软组织后锯成小块固定。 垂体等较小组织：擦镜纸包好滴少量伊红标记后固定。 冲洗和保存 经过长时间福尔马林固定和保存的组织要充分水 洗，否则影响核的染色。 一般置于7080%酒精中40C保存。当酒精混浊时 ，更换新的酒精。 固定易出现的问题与主要原因固定易出现的问题与主要原因 l扭曲变形与过度硬脆 容器过小；标本数量过多；固定时间过长。 取材过于薄小，尤其疏松结缔组织。 l表层过度，中间没有固定透 取材过厚过大；固定时间不足；固定液失效。 固定液浓度高、渗透力强，表面快速硬化。 l局部固定不佳 组织与组织重叠；组织与容器接触；组织露出液面。 注意：根据实验目的不同选择适当的固定液。 脱水脱水 l（ 一 ） 脱 水 的 意 义 与 目 的 l 常 用 的 固 定 剂 中 含 有 很 多 水 分 ， 在 石 蜡 或 火 棉 胶 包 埋 前 。 必 须 l用 某 些 溶 剂 逐 步 将 组 织 块 吸 收 的 水 分 置 换 出 来 ， 再 让 石 蜡 或 火 棉 l胶 将 该 溶 荆 里 换 ， 完 成 包 埋 步 骤 。 将 组 织 块 内 水 份 置 换 的 过 程 就 l叫 脱 水 。 l 脱 水 时 必 须 由 低 浓 度 脱 水 剂 开 始 ， 逐 步 转 入 高 浓 度 脱 水 剂 ， l以 防 组 织 过 度 收 缩 而 变 形 ， 或 脱 水 不 完 全 而 影 响 制 片 效 果 。 l 脱 水 剂 必 须 具 有 下 列 特 性 ： 脱 水 剂 能 与 水 按 比 例 混 合 ， l 高 浓 度 ， 一 般 指 不 含 水 份 ， 脱 水 剂 也 能 与 透 明 剂混 合 。前二者 特 性 能 达 到 逐 步 除 去 组 织 块 内 的 水 份 ， 使 组 织 块 内 的 水 份 全 部 被 脱 水 剂 所 取 代 ， 后二者 特 性 则 为 透明步骤的 透 明 剂 完 全 取 代 组 织 l内 的 脱 水 剂 创 造 条 件 。 l 脱 水 时 间 应 视 组 织 块 的 大 小 及 厚 度 而 定 ， 大 致 处 理 如 下 ： 组 l织 块 为 3-5毫 米 厚 者 ， 各 级 酒 精 为 3-6小 时 ， 无 水 酒 精 对 组 织 l有 脆 化 作 用 ， 浸 泡 时 间 还 应 缩 短 。 实 质 性 器 官 ， 如 肾 、 脾 和淋 巴 结 等 ， 在 酒 情 中 浸 泡 时 间 太 久 易 于 硬 脆 ， 脂 肪 组 织 与 疏 松 结缔 组 织 在 酒 精 中 浸 饱 的 时 间 要 长 ， 特 别 是 在 95 酒 精 中 ， 以 尽 量溶 去 脂 肪 ， 并 脱 净 残 存 的 水 份 ， 有 利 于 包 埋 剂 渗 入 组 织 内 。 脱水脱水 l目的：利于石蜡包埋剂渗入。 l酒精脱水： 70%和80%：可以长期保存 90%、95%：2个小时。 100% I、 II：各1小时。 注意： 某些检查，不能经过低浓度酒精脱水。如糖原、尿酸结晶。 肝、脾、淋巴结：适当缩短在无水乙醇内的时间。 脂肪、疏松结缔组织、脑：适当延长脱水时间。 透透 明明 l二甲苯I和II：各10分钟左右。 l透明时间不宜太长，否则组织收缩硬化。 透明透明 透明在两种情况下进行。透明在两种情况下进行。 第一，透明是在组织脱水后浸蜡前进行，其目的不在于 为了显微镜观察，而是作为从脱水剂进入包埋剂的桥 梁。因此，透明剂必须既能与酒精混合，又能与石蜡 融合无间，二甲苯即具此性质，故被选为常用的透明 剂。 第二，透明是在片子脱水与封藏之间进行。其目的除 了作为从脱水剂进入封藏剂的桥梁外，尚有使标本透 明而便于观察的作用。 浸浸 蜡蜡 l透蜡 是指将材料中的透明剂逐步清除， 以至完全由石蜡充分渗透。 浸浸 蜡蜡 l石蜡熔点选择54580C，浸蜡温度较熔点高 230C。 l较硬的致密组织，例如骨、软骨、肌腱、皮 肤、子宫肌选用熔点较高的石蜡。 l疏松及脆嫩组织，例如脑、脊髓、小动物肝 脾选用熔点较低的石蜡。 l石蜡I：1020分钟。 l石蜡II：2030分钟。 l石蜡III：3040分钟。 包包 埋埋 l是把被石蜡浸透的材料连同熔化的石蜡 一起倒入一定形状的容器内，并立即投 入冷水中，使它凝固成含材料的蜡块， 以备切片。 包包 埋埋 l新蜡反复熔化、冷凝，改善密度，提高韧性，质 地均匀。 l包埋温度65700C. l准备工作 熔蜡备用；预热包埋用具 l注蜡、取放组织 切面向下 l摆正压平 保留适当距离 l附贴标记 l移置冷凝 l修整蜡块 l粘贴标记 l包埋 l修块 注意事项 l实质性器官：最大切面向下。 l空腔性器官：管壁切面向下 l相同性质的小块组织可以包埋在一个蜡块 中。 l难切的组织单独包埋。 l操作要迅速，组织不能在空气中停留太久 。 石蜡切片石蜡切片 l准备工作 l切片 通常46微米 l展片 550C l附贴 蛋白甘油 l标记