高效液相色谱结果分析-第二讲.ppt

高效液相色谱 结果处理与分析 第二部分 (High performance Liquid Chromatography，HPLC) 一、色谱数据处理 二、色谱图 三、色谱图名词术语 四、色谱峰检测 五、HPLC测定步骤与内容 一.色谱数据处理 检测器记录仪积分仪 色谱工作站 色谱仪信号输出图 l色谱数据处理是通过ADC转换器,把模拟信号转换成数 字信号,然后采用色谱软件处理给出色谱图等信息。 l数据处理原理 自动处理 人工修正 峰的检测 数据采集 基线校正和重叠峰的分离 l数据处理方法 l色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的 曲线图, 其纵坐标为信号强度, 横坐标为时间 二.色谱图 (Chromatogram) 样品组分分离示意图 三.色谱图名词术语(1) l色谱峰(Peak):色谱柱流出组分通过检测器时产生的响 应信号. l峰底(Peak Base):峰的起点与终点之间连接的直线. l峰高(Peak Height):峰最大值到峰底的距离. 色谱峰 时间(分) 峰高 峰底 响应值 (mV) 基线 l切线峰宽(Peak Width, 峰宽):在峰两侧拐点处所作切 线与峰底相交两点之间的距离. l半峰宽(Peak Width at Half Height):通过峰高的中点 作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间的 距离 . l峰面积(Peak Area):峰与峰底之间的面积,又称响应值. 三.色谱图名词术语(2) 色谱峰的判断 (最小面积) 响应值 时间 峰面积 切线 半峰宽 切线峰宽 三.液相色谱图名词术语(3) l保留时间(TR)(Retention time): 组分从进样到出峰最大 值所需的时间. l死时间(t0)(Dead time): 不被固定相滞留组分的出峰时 间.（其测定测定通常是使用不被柱子保留而又有紫外吸 收的惰性物质，例如：正相色谱常用四氯化碳，反相色 谱常用甲醇、尿嘧啶、NaNO3等）. l调整保留时间：tR tRt0 l保留体积(VR)(Retention volume): 组分从进样到出 现峰最大值所需的流动相体积. l死体积(V0)(Dead volume): 不被固定相滞留的组分, 从进样到出现峰最大值所需的流动相体积. l调整保留体积：VRVRV0tR FC lFc: 流动相的流速 mL/min. 三.液相色谱图名词术语(4) l谱带扩展(Band Broadening): 由于纵向扩散,传质阻 力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽 度增加的现象. 三.液相色谱图名词术语(5) 三.液相色谱图名词术语(6) l拖尾峰(Tailing Peak): 后沿较前沿平缓的不对称峰. l前伸峰(Leading Peak): 前沿较后沿平缓的不对称峰. l鬼峰(Ghost Peak): 并非由试样所产生的峰,亦称假峰. Excellent t = 1.0 - 1.05 Acceptable t = 1.2 Unacceptable t = 2 Awful t = 4 正常前伸 三.液相色谱图名词术语(7) l基线(Baseline): 在正常操作条件下,仅由流动相所产生 的响应信号. l基线噪声(Baseline Noise): 由各种因素所引起的基线 波动. l基线飘移(Baseline Drift): 基线随时间定向的缓慢变 化. 基线 基线噪音 基 线 飘 移 峰宽 半峰宽 标准偏差 l标准偏差()(Standard deviation): 0.607倍峰 高处峰宽的一半，为便于测量，改用半峰宽。目的 是为了计算柱效率(柱效)。 l柱效（理论塔板数） ： 或 三.液相色谱图名词术语(8) 进样 图示中塔板数为3. l 塔板理论 类似蒸馏中的气液平衡 l峰的检测和判别是依据在基线的讯号水平上，预设一个 “阈值”，超过该值时，判别为峰可开始检测。一般采 用下面两种方式判别峰讯号的变化： 依照信号斜率的变 化检测信号 依照积分面积检测 峰信号 四.色谱峰检测 切线 色谱峰的判断 最小面积 五.HPLC 测定步骤与内容 1.确定色谱条件: 色谱柱的选择，流动相、流速 、检测波长、柱温及进样量等。 2.绘制标准工作曲线 3.精密度试验与回收率试验 4.实际样品含量测定 1.确定色谱条件 l 色谱柱的选择 l 流动相 l 流速 l 检测波长 l 柱温 l 进样量 2.绘制标准工作曲线 l标准曲线是定量分析的根本依据. l药物浓度（或质量）与药物在检测器上的产生的信号 （通常采用峰面积A）成比例(正比). l标准曲线的范围确定取决于样品最低浓度与最高浓度. l标准曲线线性一般采用5-9点，并非点越多越好! l准确度 指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近 的程度，用百分回收率表示。 l相对回收率 直接反映测定结果与真实值的接近程度,应 控制在100%左右(95%105%)。 l绝对回收率 模拟生物样品经整个样品处理过程,而相 应标准溶液直接分析,两者的响应值之比称为绝对回收 率。绝对回收率一般应大于70%,过低说明方法中待测物 质损失严重。 l测定回收率R（recovery）的具体方法可采用“回收试 验法”和“加样回收试验法”。 3.准确度(accuracy) (1)回收试验 空白+已知量A的对照品（或标准品）测定 ，测定值为 M 回收率100% = A M R 空白 X (2)加样回收试验 已准确测定药物含量P的真实样品+已 知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M 100%X = A PM R 数据要求 在规定的范围内，至少用9次测定结果评价， 如高、中、低三个不同浓度样品各测三次. 回收率 4.精密度(precision) l精密度是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取 样测定所得结果之间的接近程度,表示测定的重现性。用 偏差（d）、标准偏差(SD )、相对标准偏差(RSD )(变异 系数，CV )表示. (1)偏差(d）： 测量值与平均值之差 (2)标准(偏)差(SD或S） (3)相对标准(偏)差（RSD），也称变异系数(CV,有日内 变异与日间变异两种) 5.检测限(limit of detection,LOD) l指在确定的实验条件下，HPLC能检测出待测物的最低浓 度或含量。(是限度检验效能指标，无需定量测定，只 要指出高于或低于该规定浓度即可). (1)信噪比法 把已知低浓度试样测出的信号与空白样 品测出的信号进行比较，算出能被可靠地检测出的最低 浓度或量。一般以信噪比（S/N）31或21时的相应 浓度或量确定检测限。 (2)非仪器分析目视法 用已知浓度的被测物，试验出 能被可靠地检测出的最低浓度或量. l指样品中被测物能被定量测定的最低量，结果应具有一 定准确度和精密度要求。 6.定量限(1imit of quantitation，LOQ) (1)信噪比法确定定量限，一般以信噪比（S/N）为101 时相应的浓度或注入仪器的量进行确定. (2)按1984年国际纯粹和应用化学联合会(IVPAC)规定： 用仪器所测空白背景响应标准差（SD）的10倍为估计值 ，再经试验确定方法的实际测定下限. 7.专属性(specificity,或称选择性） l指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在的情 况下，采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映 该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力， 是用于复杂样品分析时是否受到相互干扰程度的度量. 8. 线性（Linearity） l在设计范围内，测试结果与试样中被测物浓度呈正比关 系的程度。 l线形通常用最小二乘法处理数据求得回归曲线的斜率（ Slope）来表示。 l数据要求：至少需要五个浓度考察线形，需提供相关系 数、y截距（检定的可能偏差）、回归斜率及方差等参 数，应列出回归方程数和线性图。 l指达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测试方法 适用的高、低限浓度或量的区间。 l范围的确定可因测定项目不同而有不同要求： 9.范围（Range） 含量测定范围为80%-120%； 含量均匀度范围为70%-130%； 杂质测定应为被测杂质限度的50%-120%； 溶出度应为测定范围的20%。 l指测定条件稍有变动时，结果不受影响的承受程度， 为常规检验提供依据。是衡量实验室和工作人员之间 在正常情况下实验结果重现性的尺度。 l分析方法重现性的测定是通过在不同的实验室内不同 的实验者对同一样品的分别测试而获得的。(获得的这 种再与正常检定下的精密度进行比较,从而确定该法的 耐用性,或称粗放度). 10.耐用性 (1)鉴别试验除专属性、耐用性外，其它都不要求. (2)杂质的限量检查除专属性、检测限、耐用性外,