生物技术毕业设计（论文）-混合硫酸盐还原菌群还原Cr(VI)的条件优化.doc

学科分类号 0711 本 科 毕 业 论 文 题 目（中文）：混合硫酸盐还原菌群还原cr(vi)的条件优化 （英文）：the conditions optimization of mixed sulfate-reducing bacteria in reduction of cr(vi) 姓 名 学 号 200621170133 院 （系） 树达学院 理工系 专业、年级 生物技术2006级 指导教师 二一年 五 月湖南师范大学本科毕业论文诚信声明本人郑重声明：所呈交的本科毕业论文，是本人在指导老师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，成果不存在知识产权争议，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 本科毕业论文作者签名： 二一年 月 日一、湖南师范大学本科毕业论文开题报告书 论 文 题 目混合硫酸盐还原菌群还原cr（vi）的条件优化作 者 姓 名所属院、专业、年级 树达学院 生物技术 专业 2006 年级指导教师姓名、职称预计字数10000开题日期2010年1月5日选题的根据：1）说明本选题的理论、实际意义 2）综述国内外有关本选题的研究动态和自己的见解 随着电镀、冶金、制革、化工、印染等工业的发展，大量含有重金属的废水被排放到自然环境中，造成了严重的环境污染。在自然环境，尤其是受到cr(vi)污染的环境中，不少微生物对cr(vi)具有抗性或使之解毒，将高毒、易溶于水的cr(vi)还原成低毒、易于沉淀的cr(iii)。目前，已发现对cr(vi)具有较强解毒能力的微生物有硫酸盐还原菌srb等，srb是一类具有能把硫酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐等硫氧化物以及元素硫还原形成硫化氢这一生理特性的细菌的统称。srb菌具有耐铬能力强，去铬效率高的特点，并且生长范围广，性能稳定。这些研究结果可为微生物治理含铬废水提供高效功能菌和适宜的去除铬(vi)的条件。具有良好的去除重金属的功能。 国内外己报道的srb去除重金属的途径主要有h2s还原途径，电子传递途径以及胞外聚合物(eps)吸附途径。本研究就混合硫酸盐还原菌还原cr(vi)的温度和ph范围展开实验。为探寻一种绿色环保的去除cr(vi)的方法创造条件。主要内容：（1） cr(vi)的毒性。（2） cr(vi)的传统处理方法。（3） 硫酸盐还原菌及其生理特性。（4） 硫酸盐还原菌代谢机理。（5） 混合菌群对不同浓度铬离子的耐受性的研究。（6） 不同初始ph条件对混合菌群srb还原cr(vi)能力的影响。（7） 不同温度条件培养对混合菌群srb还原cr(vi)能力的影响。研究方法： 1在不同起始ph条件下，用混合硫酸盐还原菌群分别处理不同浓度的含cr(vi)废水。 2在不同温度条件下 ，用混合硫酸盐还原菌群分别处理不同浓度的含cr(vi)废水。 完成期限和采取的主要措施：完整期限：预计四月底完成。主要措施：二苯碳酰二肼分光光度法测定cr(vi)的含量。探讨硫酸盐还原菌群在不同起始ph条件下，不同温度条件下，处理后含cr(vi)废水，研究其混合菌群在不同条件下对cr(vi)还原能力的影响得出废水处理的最佳条件。主要参考资料：1.张小里，刘海洪，陈开勋等.硫酸盐还原菌生长规律的研究j。西北大学学报(自然科学版)，1999，29(5): 397402.2.瞿建国，中如香，徐伯兴，李福德.硫酸盐还原菌还原cr(vi)的初步研究j.华东师范大学学报(自然科学版),2005,1(3):10510.3.王绍文，姜凤有，重金属废水治理技术m，北京:冶金工业出版社，1993 ，11:20120.4.李福德.微生物治理电镀废水力一法j.电镀与精饰，2002,24 (2):3537.指导教师意见： 签 名： 年 月 日开 题 报 告 会 纪 要时间 地点与会人员姓 名职务（职称）姓 名职务（职称）姓 名职务（职称）会议记录摘要：会议主持人签名：记录人签名：年 月 日指导小组意见负责人签名： 年 月 日学 院 意 见负责人签名： 年 月 日湖 南 师 范 大 学 生命科学 学院指导教师指导毕业论文情况登记表论文（设计）题 目学生姓名所属专业、年级 专业 级指导教师姓名职 称学 历指导时间指导地点指 导 内 容学生签名备 注 二、湖南师范大学本科毕业论文评审表 论文题目混合硫酸盐还原菌群还原cr(vi)的条件优化作者姓名所属院、专业、年级树达学 院 生物技术专业 2006 年级指导教师姓名、职称字 数10000定稿日期2010年5月8日中文摘要近年来，随着生物修复技术的兴起，国内外的科学家更多地将目光聚焦到以微生物为主体处理重金属废水的研究中来.本课题利用株洲清水塘工业园污泥废水富集硫酸盐还原菌(srb)，通过驯化获得对cr(vi)耐受性高的硫酸盐还原菌群。将驯化后的耐受cr（）浓度50mg/l的混合硫酸盐还原菌处理含铬废水，探讨ph、温度对混合硫酸盐还原菌还原能力的影响。实验结果表明：该混合菌群能在cr(vi)起始浓度50mg/l，ph4.08.0，培养温度2842，都可以达到良好的去除效果，36h后去除率都高达97.7以上，处理后含铬浓度小于国家污水综合排放标准gb8978-1996规定，cr ( vi)离子最高允许排放浓度为0.5mg/l。该菌群最大的特点能适应较宽的ph和温度范围且处理效率高，性能稳定，有望成为处理高浓度含铬废水的理想的绿色环保的新方法。关键词（3-5个）六价铬 硫酸盐还原菌 温度 ph英文摘要at present, with the rise of biorestore technology,the scientists in the all of the world focus on the study on biotreatment the waste water contain heavy mental. enrichment srb by using chemical sludge from waste water, through acclimatization obtain cr (vi) tolerance to high sulfate-reducing bacteria. reduction capability of the tolerance of acclimatization cr () concentration of 50mg / l of the mixed sulfate-reducing bacteria treatment waste water was investigated under the different of ph, temperature condtion. the results show that: the mixed bacteria in cr (vi) initial concentration of 50mg / l, ph4.0 8.0, incubation temperature 28 37 , can achieve good removal efficiency, 36h after the removal rate up to more than 97.7%, treated with chromium concentration less than the national integrated wastewater discharge standard gb8978-1996 requirements, cr (vi) ion concentration of the maximum allowable emission 0.5mg / l. the greatest feature of bacteria can adapt to a wide ph and temperature range and high treatment efficiency, stable performance, is expected to be high concentrations of chromium-containing wastewater treatment ideal new method of environmental protection.关键词（3-5个）cr(vi) sulfate-reducing bacterium temperature ph毕业论文指导教师评定成绩评审基元评审要素评审内涵满分实评分选题质量30%目的明确符合要求选题符合专业培养目标，体现学科、专业特点和综合训练的基本要求10理论意义或实际价值符合本学科的理论发展，有一定的学术意义；对经济建设和社会发展的应用性研究中的某个理论或方法问题进行研究，具有一定的实际价值10选题恰当题目规模适当5难易度适中5能力水平35%查阅文献资料能力能独立查阅相关文献资料，归纳总结本论文所涉及的有关研究状况及成果，并恰当运用5综合运用知识能力能运用所学专业知识分析、研究和阐述问题；论文内容有适当的深度、广度和难度10研究方案的设计能力整体思路清晰；研究方案合理可行5研究方法和手段的运用能力能运用本学科常规研究方法及相关研究手段（如计算机、实验仪器设备等）进行实验、实践并加工处理、总结信息10外文应用能力能阅读、翻译一定量的本专业外文资料、外文摘要和外文参考书目（特殊专业除外）体现一定的外语水平5论文质量35%文题相符较好地完成论文选题的目的要求5写作水平论点鲜明；论据充分；条理清晰；语言流畅10写作规范符合学术论文的基本要求。用语、格式、图表、数据、量和单位、各种资料引用规范化、符合标准10论文篇幅文科类不少于10000字，理工科类不少于7000字，艺体类不少于5000字，外国语言文学类不少于5000个实词。5成果的理论或实际价值成果富有一定的理论深度和实际运用价值 5正文部分成绩（上表）：总成绩：评定等级：外文资料译文成绩：指导教师评审意见： 指导教师签名： 说明：此表指标部分为正文部分计分表，正文部分成绩实评总分0.9，外文资料译文成绩满分为10分。总成绩正文部分成绩外文资料译文成绩。评定成绩分为优秀、良好、中等、及格、不及格五个等级，总成绩90100分记为优秀，8089分记为良好，7079分记为中等，6069分记为及格，60分以下记为不及格。若译文成绩为零，则不计总成绩，评定等级记为不及格。三、湖南师范大学本科毕业论文答辩记录表论文题目混合硫酸盐还原菌群还原cr(vi)的条件优化作者姓名彭盛军所属院、专业、年级树达学院 生物技术专业 2006年级指导教师姓名、职称邓乐 教授答 辩 会 纪 要时间地点答辩小组成员姓 名职务（职称）姓 名职务（职称）姓 名职务（职称）答辩中提出的主要问题及回答的简要情况记录：会议主持人签名：记录人签名：年 月 日 答辩小组意见评语：评定等级： 负责人（签名）： 年 月 日学院意见评语：论文学院最终评定等级： 负责人（签名）： 学院（公章） 年月 日学校意见评语：评定等级： 负责人（签名）： 年月 日目 录摘要：1abstract:1引言21铬21.1来源21.2 cr(vi)毒性21.3 cr(vi)的传统处理方法31.3.1物理化学方法31.3.2生物修复法52.硫酸盐还原菌72.1硫酸盐还原菌的特性82.2硫酸盐还原菌的分类及生物学特性.82.3硫酸盐还原菌的代谢机理93本课题研究的目的和意义10实验材料和方法111材料111.1样品来源111.2实验仪器/试剂111.3常用溶液的配制111.4培养基配方122方法132.1 cr(vi)标准曲线的绘制132.2混合菌群对不同浓度铬离子的耐受性的研究142.3不同初始ph条件对混合菌群srb还原cr(vi)能力的影响152.3.1仪器准备，灭菌。152.3.2 接种152.3.3测定处理后剩余cr（vi）的含量162.4不同培养温度条件下混合菌群srb对cr(vi)还原能力影响162.4.1仪器准备，灭菌162.4.2 接种162.4.3测定处理后剩余cr（vi）的含量17结果与分析171不同ph条件下srb对cr(vi)的去除172 不同温度条件下srb对cr (vi)的去除183优化后的srb对cr (v i)的去除作用194不同培养温度对srb去除cr (vi)的影响195不同ph对srb去除cr(vi)的影响20总结与展望20参考文献21致 谢24ii混合硫酸盐还原菌群还原cr(vi)的条件优化生物技术专业 2006级 彭盛军摘要： 近年来，随着生物修复技术的兴起，科学家更多地将目光聚焦到以微生物为主体处理重金属废水的研究中来。本研究利用株洲清水塘工业园废水污泥富集硫酸盐还原菌(srb)，并通过驯化获得了对cr(vi)耐受性高的硫酸盐还原菌群。将驯化后的耐受cr（）的混合硫酸盐还原菌处理含铬废水，并探讨了ph、温度对其还原能力的影响。实验结果表明：该混合菌群在cr(vi) 50mg/l，ph4.08.0，培养温度2842，均可以达到较好的去除效果，36h后去除率可达97.7以上。处理后废水含铬浓度小于国家污水综合排放标准gb8978-1996。该菌群最大的特点能适应较宽的ph和温度范围且处理效率高，性能稳定，有望成为处理高浓度含铬废水的理想的绿色环保的新方法。关键词：六价铬 硫酸盐还原菌 温度 phthe conditions optimization of mixed sulfate-reducing bacteria in reduction of cr ()grade 2006, biotechnology, shengjun pengabstract: at present, with the rise of biorestore technology, the scientists in the all of the world focus on the study on biotreatment of the waste water containing heavy mental by using srb from chemical sludge of waste water which take from qingshuitang industrial park of zhuzhou city. in this experiment, a group of high sulfate-reducing bacteria were obtained through acclimatizing their tolerance for cr (vi). the treatment efficiences for waste water were investigated well under the different condtions of ph, temperature. the results show clearly that: the mixed bacteria in initial cr (vi) concentration of 50mg/l, ph4.0 8.0, incubation temperature 28 37 , can achieve good removal efficiency, and the removal rates are up to more than 98.7% after 36h, which are according with national integrated wastewater discharge standard (gb8978-1996). since these bacteria can adapt to a wider range of ph and temperature, and have high treatment efficiency, stable performance, it is expected to play an important role in treating high concentrations of chromium-containing wastewater.keywords : cr(vi) sulfate-reducing bacterium temperature ph引言1铬铬是法国化学家lvauquelin于1797年首次发现的，是一种用途广泛而又对人体危害较大的重金属元素。1.1来源含六价铬废水主要来源于油墨、染料及油漆颜料的制造、制革、金属清洗、预电镀和电镀等行业1。在制造中直接使用三价铬的工业有玻璃、陶瓷、摄影、无机颜料、纺织染料和动物胶制造。据资料介绍，制革工业通常处理1t原皮，要排出含铬为410mg/l的废水50-60t。炼油厂和化工厂所用的循环冷却水中含铬量也较高。镀铬厂的废水中含铬量更高，尤其在换电镀液时，常排放出大量含铬废水。铬对水体的污染不仅在我国而且在全世界各国都已相当严重了。世界各国普遍把铬污染列为重点防治对象。 三价铬是生物所必需的微量元素。通过动物试验发现三价铬有激活胰岛素的作用，还可以增加对葡萄糖的利用2。国外有人认为三价铬与铝一样，基本上不显示毒性。三价铬不易被消化道吸收，在皮肤表层与蛋白质结合，三价铬在动物体内的肝、肾、脾和血中不易积累，而在肺内存留量较多，因而对肺有一定损害。与六价铬相比，三价铬的毒性仅为六价铬的百分之一。1.2 cr(vi)毒性环境中稳定存在的铬的两种价态cr(iii)和cr(vi)，有着几乎相反的性质，适量的cr(iii)可以降低人体血浆中的血糖浓度，提高人体胰岛素活性，促进糖和脂肪代谢，提高人体的应激反应能力等3；而cr(vi)毒性很大并能致癌, 为美国 epa 公认的 129 种重点污染物之一, 也是我国重点整治的污染物。cr(vi)是一种强氧化剂，具有强致癌变、致畸变、致突变作用，对生物体伤害较大。长期接触六价铬化合物会导致人体产生肺癌、上呼吸道癌和肠胃癌，另外还有皮肤炎、过敏与湿疹性皮肤反应等病症、以及呼吸道病症、眼部病症、口腔黏膜病变、胃肠炎、肾功能障碍等疾病4。这些病变经常出现在工业生产环境的工人身上，因为诸如铬酸、铬酸盐、重铬酸及重铬酸盐的接触，以及金属加工所产生的粉尘、蒸气暴露都有可能产生这些疾病。cr(vi)广泛存在于工业废水中, 如不经处理直接排入水体, 将对生态环境和人类生存产生巨大危害。1.3 cr(vi)的传统处理方法1.3.1物理化学方法 (1)稀释法和换水法稀释法就是把被重金属污染的水混入未污染的水体中，从而降低重金属污染物浓度，减轻重金属污染的程度。此法适于受重金属污染程度较轻的水体的治理。这种方法不能减少排入环境中的重金属污染物的总量，又因为重金属有累积作用，所以这种处理方法目前渐渐被否定。换水法是将被重金属污染的水体移出，换上新鲜水，而减轻水体污染的一种措施，该方法适用于鱼塘等水量较小的情况。(2)混凝沉淀法许多重金属在水体溶液中主要以阳离子存在，加入碱性物质，使水体ph值升高，能使大多数重金属生成氢氧化物沉淀。另外，其它众多的阴离子也可以使相应的重金属离子形成沉淀。所以，向重金属污染的水体施加石灰、naoh、na2s等物质，能使很多重金属形成沉淀。通常六价铬离子以铬酸离子的形式存在，在碱性条件下不易沉淀且毒性很高，而三价铬毒性远低于六价铬，但六价铬在酸性条件下易被还原为三价铬。因此，常采用硫酸亚铁及三氧化硫将六价铬还原为三价铬，以减轻铬污染。(3)离子交换法离子交换法是利用重金属离子交换剂与污染水体中的重金属物质发生交换作用，从水体中把重金属交换出来，以达到治理重金属污染的目的。经离子交换处理后，废水中的重金属离子转移到离子交换树脂上，经再生后又从离子交换树脂上转移到再生废液中。离子还原法和交换法费用较低，操作人员不直接接触重金属污染物，但适用范围有限，并且极易造成二次污染。电修复法淀去除，降低重金属对水体的危害程度。这是目前国内处理重金属污染普遍采用的方法。(4)离子还原法离子还原法是利用一些轻易得到的还原剂将水体中的重金属还原，形成无污染或污染程度较轻的化合物，从而降低重金属在水体中的迁移性和生物可利用性，以减轻重金属对水体的污染。(5) 电修复法电修复法是20世纪90年代后期发展起来的水体重金属污染修复技术，其基本原理是给受重金属污染的水体两端加上直流电场，利用电场迁移力将重金属迁移出水体。ridha等提出，在一个碳的毡状电极上，用电沉积法从工业废水中除去铜、铬和镍的技术。还可以用电浮选法净化含有铜、镍、铬和锌等重金属的工业污水。此外，近年来还有人把电渗析薄膜分离技术应用到污水重金属处理实践当中。 1.3.2生物修复法(1)微生物修复法重金属污染水体的生物修复机理主要包括微生物对重金属的固定和形态的转化。前者是微生物通过带电荷的细胞表面吸附重金属离子，或通过摄取必要的营养元素主动吸收重金属离子，将重金属富集在细胞表面或内部；后者是通过微生物的生命活动改变重金属的形态或降低重金属的生物有效性，从而减轻重金属污染，如cr（vi）转变成cr（iii）而毒性降低。大多数硫酸盐还原菌（sulafte一reducing bacterium，srb）都可以利用硫酸盐、硫代硫酸盐等作为电子受体, 以乳酸盐、氢气、乙酸盐等作为电子供体, 将高价态的金属如:cr(vi)锰（iv）铁（iii）锝（vi）等还原为低价态、易沉淀的形式。利用微生物还原 cr(vi), 不仅去除效率高, 而且运行成本低。 (2)动物修复法应用一些优选的鱼类以及其它水生动物品种在水体中吸收、富集重金属，然后把它们从水体中驱出，以达到水体重金属污染修复的目的。研究发现，一些贝类具有富集水体中重金属元素的能力，如牡蛎就有富集重金属锌和镉的能力。据报导，若以湿量计算，牡蛎对镉的富集量可以达到3-4g/kg。但动物修复法需驯化出特定的水生动物，并且处理周期较长、费用高，再则后续处理费用较大 ，所以在实际应用中推广难度较大。(3)植物修复方法20世纪80年代前期，chaney提出利用重金属超富集植物的提取作用清除土壤重金属污染这一思想后。经过人们不断地实践、总结和归纳才形成了植物修复的概念。植物修复被定义为利用自然或基因工程植物来转移环境中的重金属或使环境中的重金属无害化，是目前生物修复技术中研究最热的一类。对于铬超富集植物，到目前为止，在美国、澳大利亚、新西兰等国已发现能富集重金属的超富集植物500多种，其中有360多种是富集ni的植物。对于铬超富集植物，得到学者们认同的有dicomaniccolifera wild和suterafodina wild两种，铬最高含量分别为1500mg/kg、2400mg/kg，均高于铬超富集植物的参考值1000mg/kg。国内报道的湿生禾本科植物李氏禾也对铬具有较好的富集能力。因此，采用一些水生铬超富集植物用于铬污染水体修复是可行的。这些方法有一定效果,但耗资较大,或周期较长,还可能造成二次污染。有很大的局限性。 (4)生物吸附自然界中生物吸附剂的来源十分广泛，许多生物体都具有优越的金属吸附能力。具有从溶液中分离金属能力的由生物体制备的衍生物通称为生物吸附剂。其中具有价值的生物吸附剂主要来源于微生物和植物等，如细菌、真菌、藻类和植物类副产品等。实验表明，这些吸附剂均表现出对不同重金属的吸附能力。例如真菌中的aspergillu、foetidus、rhiz即usnigrieans、r.01190，orus、r.arrhizus对cr分别表现出了2、47、126、11mg/g的吸附能力。2.硫酸盐还原菌硫酸盐还原细菌(sulfate-reducing bacterium, srb), 是指一类具有能把硫酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐等硫氧化物以及元素硫还原形成硫化氢这一生理特性的细菌的统称, 共包括脱硫弧菌属、 脱硫单胞菌属等 12 个属。广泛存在于土壤、海水、河水、地下管道以及油气井等缺氧环境中。在伯杰细菌鉴定手册第九版中srb被归纳到第7类群中，有4组14个属。早在1924年，bengough和may就认为srb产生的h2s对埋在地下的铁构件的腐蚀起着重要作用，1934年，荷兰学者库尔和维卢特提出了srb对金属腐蚀作用的机制；随后，邦克（1939）、hedelai（1940）、史塔克和威特（1945）也证实腐蚀的主要细菌有铁细菌（好氧）和srb(厌氧)，土壤中钢铁的腐蚀主要是后者。研究表明在无氧或极少氧情况下,它能利用金属表面的有机物作为碳源,并利用细菌生物膜内产生的氢,将硫酸盐还原成硫化氢,从氧化还原反应中获得生存的能量. 近年来，微生物法处理含铬废水越来越受到重视，许多微生物具有较高的耐铬性，并且能在好氧或厌氧状态下将剧毒的铬(vi)还原成低毒的铬（iii）。本实验的主要内容主要是研究不同温度和ph条件对混合硫酸盐还原菌群还原cr（）能力的影响。为今后将srb应用于工业废水的处理打下基础。2.1硫酸盐还原菌的特性srb是一类形态各异、营养类型多样、能利用硫酸盐或其他氧化态硫化物作为电子受体来异化有机物质的严格厌氧菌。srb有极强的生命力,即使在污染严重的环境中也能生存,故这类细菌在自然环境中分布广泛,对环境中许多物质的迁移和转化有着重要影响。2.2硫酸盐还原菌的分类及生物学特性在bergeys细菌分类手册中,按srb对有机物利用性能不同,将其分为8个属:desulfovibrio、desulfomonas、desulfobulbus、desulfotomaculum、desulfococcus、desulfobacter、desulfosarcina、desulfonema。目前已知的srb有40多个种,根据生理生化特性、营养代谢产物,可以对其进行分类。根据不同的生理生化特性,可以分为异化硫酸盐还原菌和异化硫还原菌:前者利用乳酸盐、丙酮酸盐、乙醇和h2等作为碳源和能源,还原硫酸盐生成硫化物;后者只能还原元素硫或者其他含硫化合物(如亚硫酸盐、硫代硫酸盐等)。根据营养代谢产物不同,srb可分为完全氧化型和不完全氧化型完全氧化型最终代谢产物为co2和h2o;不完全氧化型最终产物为乙酸,这类srb不能利用乙酸。srb能利用种类繁多的基质作为有机碳源和电子供体,迄今发现可支持其生长的基质超过100种其中包括乳酸盐、丙酸盐、反丁烯二酸、苹果酸、乙醇等。srb还原作用受到许多环境因子的影响。ph是影响srb活力的主要因素,srb生长最适ph一般在中性范围。温度也是影响srb还原效果的一个重要因子,不同的srb,其发挥还原作用的最佳温度也不同。srb对h2s的毒性影响也较为敏感,h2s的浓度达到一定程度,会抑制srb的生长,当毒性水平持续一定时间,srb的活性会不可逆的丧失。此外,基质碳源的种类、有毒重金属等也会影响srb的生长和还原速率。2.3硫酸盐还原菌的代谢机理srb的代谢过程一般可分为3个阶段:分解代谢、电子传递、氧化(图1)。在第1阶段的分解代谢中,srb在厌氧条件下对碳源(有机物)进行降解,并产生少量atp和高能电子;在第2阶段中,前一阶段释放的高能电子通过srb特有的电子传递链(黄素蛋白、细胞色素c3等)逐级传递,产生大量atp;在最后阶段中,电子被传递给氧化态的硫元素,并将其还原为s2-。从这一过程可以看出,硫酸盐仅在其中起最终电子受体的作用,而有机物既是srb的碳源,起着电子供体的作用,也是srb生长代谢的能源。3本课题研究的目的和意义近一个世纪以来，随着人类人口的不断增加，人类活动的日益频繁，使得环境和资源都面临着很大的压力。我国水资源严重紧缺，资源综合利用率相对较低，重金属的水体污染更是进一步地加剧了这种矛盾。工业革命以来，金属冶炼行业得到了迅速发展，重金属铬己在电镀、制革、染料、颜料、有机合成等工业生产和实验室中得到广泛的应用，与之相伴的是铬的污染问题也越来越严重。铬污染存在于空气、水、食品和土壤中，直接或间接地进入人体将导致严重的后果。全国每年排放铬渣约60万吨，历年累积600万吨，经解毒处理或综合利用的不足17%, 2005年环保年鉴统计数据也显示，仅皮革行业每年排放的含铬废水就高达1.8亿吨。水体中铬主要以三价和六价形式存在。大量研究表明，cr(vi)的毒性比cr(iii)高约100倍。同时，由于铬的毒性强，且不能被微生物分解，通过食物链在生物体内富集，水溶性六价铬已被列为对人体危害最大的8种化学物质之一，是国际公认的3种致癌金属物之一。 目前环境问题已成为国际社会关注的焦点，在要求整体环境状况有所好转的前提下实现经济的持续快速增长，对环境科技创新提出重大战略需求。国家中长期科学和技术发展规划纲要(2006-2020年)规划了中国将在未来15年内把发展能源、水资源和环境等11个重点领域的技术放在优先位置，解决制约经济社会发展的重大瓶颈问题。本课题利用的经富集驯化的高耐铬混合菌群处理含铬废水，有较宽的温度和ph适应范围，不仅成本低廉方便高效，且无二次污染，为将来用绿色环保的方法处理铬污染提供了可能。实验材料和方法1材料1.1菌种来源cr(vi)耐受性高硫酸盐还原菌群来自通过利用取自湖南株州清水塘工业园废水污泥富集，驯化所得。1.2实验仪器/试剂紫外/可见分光光度计uv751gd 、电子天平（mettler toledo）、恒温培养箱、海尔冰箱、高压灭菌锅hve-50、超净工作台sw-cj-1fd、ph试纸及比色卡、pbac试纸、100ml输液瓶若干个、200ml三角瓶若干个、玻璃棒、1000ml烧杯、锥形漏斗、重铬酸钾(99.8 %)、二苯碳酰肼、硫酸亚铁铵(fe(nh4)2(so4)6h2o),分析纯)、氯化铵、（nh4cl分析纯）、磷酸氢磷酸氢二钾（k2hpo43h2o分析纯）、70%乳酸钠、酵母膏、无水硫酸钠（na2so4分析纯）、氯化钙（cacl2分析纯）、七水硫酸镁（mgso47h2o分析纯）、丙酮( 99.5 % ,分析纯)。1.3常用溶液的配制(1)0.2二苯碳酰二肼溶液称取二苯碳酰二肼（c13h14n4o）0.1g，溶于25ml丙酮(c3h6o)中，加水稀释至50ml，摇匀于棕色瓶中，在4低温下保存。(2)硫酸溶液，1:1(v/v) 将硫酸(h2so4 ，=1.84g/ml)缓慢加到等体积的水中，边加边搅，待冷却后使用。(3)磷酸溶液，1:1(v/v) 将磷酸（h3po4，=1.698g/ml)与等体积水混匀。(4)铬标准贮备液的配制:准确称取2.829g重铬酸钾(基准，121干燥2h)，用双蒸水溶解后，转入1000ml容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀。此溶液浓度为1000mg/l(于棕色试剂瓶内避光保存)，本试验所用铬离子溶液均由稀释贮备液得到。1.4培养基配方所用试剂均为国产分析纯，培养基一如表2.1所示。组分浓度/gl-1组分浓度/gl-1磷酸氢二钾（k2hpso4）0. 5硫酸镁（mgso47h2o）2.0氯化氨（nh4cl）1.0硫酸钠（na2so4）0.5氯化钙（cacl2）0.1酵母膏1.0乳酸钠4.0硫酸亚铁铵1.2 表2.1 富集培养基的组成 培养基一：用于硫酸盐混合菌的富集培养，也可以做只是培养基。培养基二：同培养基一不含fe2+，用于驯化和处理含铬废水培养液。将污泥按5%接种到培养基中，在36士1恒温密闭培养，至培养液变黑，以此作为硫酸盐还原反应发生的判据，并以变黑时间的长短衡量污泥中srb活性的强弱。按相同比例反复接种培养，直至得到36小时内变黑的活性较高的srb菌液，将此菌液接入培养基中，放入密闭容器内4冷藏保存，留以后实验使用。2方法2.1 cr(vi)标准曲线的绘制（1）向9个150ml三角瓶中，分别加入铬cr(vi)标准溶液(1.00g/ml) 0.0，0.50, 1.00, 2.00, 4.00, 6.00, 8.00, 10.00, 20.00ml，加水至50ml，用二苯碳酰二肼分光光度法测其540nm处吸光值。以各吸光值为纵坐标，对应铬量为横坐标作出标准曲线。（2）cr(vi)测定参照中华人民共和国国家标准固体废物总铬的测定二苯碳酰二肼分光光度法，取待测cr(vi)溶液0.5ml于50ml容量瓶中，用水稀释至标线，加入0.5mlh2so4,0.5ml h3po4,2ml0.2二苯碳酰二肼溶液，显色10min后用10mm光程比色皿，于540nm处，测定吸光度。记录数据，绘得cr(vi)标准曲线如图2.2所示。图2.2 cr(vi)标准曲线2.2混合菌群对不同浓度铬离子的耐受性的研究将驯化得到的混合菌群以5接种于一系列不同cr(vi)浓度梯度的培养基中，通过观察其菌群的生长情况分析菌群抗cr(vi)的能力。由表2.3可知，当没培养基中没有cr(vi)时，菌体生长明显比加cr(vi)的要好，说明cr(vi)对菌群的生长还是有一定的抑制力，但不是特别明显。当培养基中cr(vi)浓度为1050mg/l的时候，菌体生长无明显变化。在cr(vi)浓度为55mg/l和60mg/l，菌群基本上不再生长。菌群在cr(vi)浓度50 mg/l以下时，菌群生长良好，说明混合菌对cr(vi)耐受能力强。cr(vi) mg/lcr(vi)去除率（）活菌死菌培养基1099.236.120.22081.410.58.53070.37.96.14041.55.63.55028.92.31.9605.05.84.9表2.3生长培养基、活菌和死菌孵化40h后cr(vi)的去除率为了确定还原cr(vi)的主要因素，做了如下研究，分别用培养基，活菌，死菌分别处理含cr(vi)污水，24小时后，我们得到如下数据如图2.4示。实验结果表明活菌在处理含cr(vi)废水中起主导作用。图2.4 不同cr(vi)浓度对菌群生长的影响2.3不同初始ph条件对混合菌群srb还原cr(vi)能力的影响2.3.1仪器准备，灭菌。将100ml输液瓶9个，500ml三角瓶11个，烧杯，锥形漏斗洗净，烘干。将三角瓶分别编号为ph=1，2，3，4，5， 6， 7， 8，9；称取配方一（按配1500ml的量称取），放入烧杯，加双蒸水溶解至1500ml。加热，溶解。在烘干的三角瓶中各均加入150ml培养基溶液，并通过滴加hcl(1mol/l）和naoh（1mol/l），调节其ph,使其ph与其标签相同，ph分别为ph=1, 2，3，4，5, 6，7，8，9，将上述仪器溶液高压蒸汽灭菌(121,20min）。2.3.2 接种 灭菌后，将所有仪器移至超净台。将输液瓶都标号为30mg/lcr(vi),ph分别标为ph= 1，2，3，4，5，6，7，8，9，并加入cr(vi)（1000mg/l）稀释至终浓度为30mg/l，将三角瓶里的培养基分别倒入对应ph编号的输液瓶。分别接种3至5% 硫酸盐还原菌群溶液,37恒温培养。2.3.3测定处理后剩余cr（vi）的含量培养36h后。取ep管，100ml三角瓶各10个，分别编号为ph=1，2，3，4，5，6，7，8，9，空白；浓度均标为30mg/l；从输液瓶中分别取1ml溶液到对应编号ep管中。空白组用双蒸水代替。将ep管4000转离心10min，后从ep管中吸0.5ml溶液到对应的三角瓶。用量筒量量双蒸水稀释至50ml，每个三角瓶中分别加入0.5ml h2so4（1+1），0.5ml h3po4（1+1），2ml 0.2二苯碳酰二肼溶液，10min后，于540nm测吸光值。记录数据并求出cr（vi）去除率。实验步骤同2.3，分别在不同cr(vi)的浓度下分别为40 mg/l ；50 mg/l ；60 mg/l做在梯度ph值混合菌群还原能力的影响。2.4不同培养温度条件下混合菌群srb对cr(vi)还原能力影响2.4.1仪器准备，灭菌将100ml输液瓶8个，1500ml三角瓶1个，烧杯，锥形漏斗洗净，烘干。称取培养基配方一（按1000ml的量称取） 溶解至1000ml， 高压蒸汽灭菌（121,20min）。2.4.2 接种 灭菌后，将所有仪器移至超净台。将输液瓶都标号为30mg/l(cr(vi),温度分别标为18，25，28，30，35，38，42，48；并加cr(vi)至终浓度为30mg/l，然后将三角瓶里的培养基分别倒入输液瓶。分别接种5% 硫酸盐还原菌群溶液。然后放入不同培养箱，分别按其标定温度恒温培养。2.4.3测定处理后剩余cr（vi）的含量培养36h后