《DNA芯片技术》PPT课件.ppt

第十三章 DNA芯片技术 第一节 概 述 一、DNA芯片技术的概念 基因芯片(Gene chip)技术是指通过微阵 列(Microarray)技术将高密度DNA片段 阵列通过高速机器人或原位合成方式 以一定的顺序或排列方式使其附着在 如玻璃片等固相表面，以荧光标记的 DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进 行大量的基因表达及监测等方面研究 的最新革命性技术。 DNA Chip Technology Solid support (glass, plastic, metal, silicon) Miniaturized array of DNA (genetic material) Work on the biochemical principle of DNA/DNA hybridization Hybridized probes (DNA molecules) are fluorescently labeled 通常用计算机硅芯片作为固相支持物， 所以称为DNA芯片 。 DNA芯片为生物芯片的一种： 生物芯片包括： DNA芯片 蛋白质芯片 其它芯片 按用途分 样样品制备备芯片 生化反应应芯片 检测检测 芯片 芯片实验实验 室是生物芯片技术发术发 展 的最终终目标标 基因芯片发展历史基因芯片发展历史 Southern & Northern Southern & Northern BlotBlot Dot Dot BlotBlot MacroarrayMacroarray MicroarrayMicroarray 二、DNA芯片的主要类型 按制备方式分： 原位合成芯片：采用显微光蚀刻等技 术在特定部位原位合成寡核苷酸而 制备的芯片。探针较短 DNA微集阵列：将预先制备的DNA片 段以显微打印的方式有序地固化于 支持物表面而制成的芯片。探针的 来源较灵活 Comparison of DNA Chip Technologies Sensitivity of DNA chip based assays is a function of: Probe and target DNA/RNA (Complexity) Chip surface (autofluorescence & non-spec. bkg) Attachment chemistry/methodology (hyb. efficiency & crosshyb.) Hybridization efficiency (lots of factors) Detection technology (signal type, efficiency, noise) OligoOligo-Chip-Chip cDNAcDNA-Chip-Chip Genomic Chip Genomic Chip 8 n or 20 n 50,000 n 8 n or 20 n 50,000 n sequencingsequencingexpressionexpressionexpressionexpression genomic analysisgenomic analysis 第二节 DNA芯片技术的 基本原理与方法 一、芯片的制备 （一）支持物的预处理 实性材料：硅芯片、玻片和瓷片 需进行预处理，使其表面衍生出羟基 、氨基活性基团。 膜性材料：聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤 维膜 通常包被氨基硅烷或多聚赖氨酸 （二）原位合成芯片的制备 1.显微光蚀刻技术 支持物表面活性基团连接有光敏保护基团 （X）受到保护。 产率较低 原位合成(In Situ Synthesis) Light directed oligonucleotide synthesis. A solid support is derivatized with a covalent linker molecule terminated with a photolabile protecting group. Light is directed through a mask to deprotect and activate selected sites, and protected nucleotides couple to the activated sites. The process is repeated, activating different sets of sites and coupling different bases allowing arbitrary DNA probes to be constructed at each site. 2.压电打印法 压电毛细管喷射器 产率较高 喷墨打印技术 （三）DNA微集阵列的制备 方式：预先合成DNA或制备基因探针然 后打印到芯片上 探针的制备 已克隆的基因片段 PCR，RT-PCR扩增的基因片段 人工合成的DNA片段 单链、双链、DNA或RNA 均可作为探针 2. 打印 喷墨打印（非接触式点样） 优点、缺点 针式打印（接触式点样） 优点、缺点 针式打印法（接触式点样） Best!Best! 3. 探针的固化 打印探针后，需要将其固定在支持物 表面，同时也要封闭支持物上未打 印区域以防止核酸样品的非特异性 固定 二、样品的准备 样品的分离纯化 DNA , mRNA 扩增 PCR, RTPCR，固相PCR 标记等过程 荧光标记（常用Cy3、Cy5），生物素、放 射性标记 三、分子杂交 样品与DNA芯片上的探针阵列进行杂交 。 与经典分子杂交的区别： 杂交时间短，30分钟内完成 可同时平行检测许多基因序列 影响杂交反应的因素： 盐浓度、温度、反应时间、DNA二级 结构 肽核酸( peptide nucleic acid , PNA) 是一类以氨基酸替代糖-磷酸主链的 DNA类似物，骨架由重复的N-甘氨酸 通过酰胺键相连构成，碱基则通过甲 叉碳酰基与骨架相连。 PNA分子内不会形成二级、三级结构 DNA与PNA杂交不需要盐离子 四、检测分析 激光激发使含荧光标记的DNA片段发 射荧光 激光扫描仪或激光共聚焦显微镜采集 各杂交点的信号 软件进行进行图象分析和数据处理 Research Use From Sequence to function 计算Ratio 值 (= Cy3/Cy5)。在 0.5-2.0 之外的定义为在两样本中有明显差异 表达。进而获取初步功能信息。 Clustering。 第三节 DNA芯片技术的应用 DNA测序；杂交测序（SBH） 基因表达分析： 基因组研究：作图、测序、基因鉴定、 基因功能分析 基因诊断：寻找和检测与疾病相关的基 因及在RNA水平上检测致病基因的表 达 药物研究与开发： cDNA microarray expression patterns of small (S) and large (L) neurons 应用之一 基因表达谱（gene expression pattern) BiologicalBiological SampleSample FunctionalFunctional Information Information 红色 上调 黄色 不变 绿色 下调 基因表达谱芯片的应用最为广泛， 技术上也最成熟。这种芯片可以检测 整个基因组范围的众多基因在mRNA 表达水平的变化。它能对来源于不同 个体、不同组织、不同细胞周期、不 同发育阶段、不同分化阶段、不同生 理病理、不同刺激条件下的组织细胞 内基因表达情况进行对比分析。从而 对基因群在个体特异性、组织特异性 、发育特异性、分化特异性、疾病特 异性、刺激特异性的变化特征和规律 进行描述， 进一步阐明基因的相互协同、抑制、 互为因果等关系。有助于理解