《N专题增硝营养》PPT课件.ppt

不同氮效率水稻增硝营养的生 理与分子生物学机制 传统水稻田中NH4是 主要存在形态，对 NO3营养的研究较少 。 越来越多的研究表明，水稻根系能分 泌O2，这些O2能满足好氧微生物的生活 需要，好氧微生物可把NH4+氧化成NO3 。 水稻节水栽培技术使水稻根系的通气 条件有了较大的改善。在较好的通气条 件下，NH4+易被氧化成NO3 。 稻田中存在硝态氮 研究背景 Kirk研究表明水稻对硝态 氮的吸收量可达到吸氮总量的 30 (Kirk, 2005)。 增硝营养可使水稻产量提高 3050 (Qian et al., 2004)。 水稻能够吸收利用硝态氮 增硝营养如何促进水稻生长？ 研究目的 n研究水稻增硝营养的生理与分子生物学 机制 n 阐明水稻对增硝营养的响应与氮素高效 利用的关系 技术路线 水培条件下筛选对增硝营养响应差异 显著的不同氮效率水稻品种 研究增硝营养对不同氮效率水稻品种整个 生育期生长及氮素吸收同化的影响 增硝营养对水稻生育前期氮素吸收的贡献（15N） 水稻铵吸收系统动力学参 数的响应（15N） 水稻根系生长及形态 学参数的响应 增硝营养条件下 铵转运蛋白mRNA的转录水 平(半定量、定量)的响应 不同氮效率水稻增硝营养响应度的差异及其机理 试验内容 n铵硝比对不同氮素利用效率水稻的生理效应 n增硝营养全生育期内对不同氮效率水稻生长和氮素吸 收同化的影响 n增硝营养对不同氮效率水稻根系生长的影响 n利用15N标记法研究不同氮效率水稻生育前期氮素吸收 动态 n不同氮效率水稻苗期对15 NH4+ 的吸收动力学研究 n实时荧光定量PCR研究增硝营养对不同氮效率水稻铵 转运蛋白（OsAMT1;1-1;3）的表达的影响 第一部分 铵硝比对不同氮素 利用效率水稻的生理效应 材料与方法 表1-1 供试粳稻品种的主要特性(施氮水平为180 kg ha-1) 试验处理 n总氮浓度相同，NH4/ NO3比例分别为 100/ 0、75/ 25、50/ 50和25/ 75。 研究结果 研究结果 结论 u南光对增硝营养的响应程度最高，ELIO对增 硝营养的响应最低。 u 水稻最适铵硝配比为75/25 既然这两个不同氮效率水稻在苗期对增 硝营养的响应差异如此大，那么全生育 期内的表现及对产量的影响如何？ 试验内容 n铵硝比对不同氮素利用效率水稻的生理效应 n增硝营养全生育期内对不同氮效率水稻生长和氮素吸 收同化的影响 n增硝营养对不同氮效率水稻根系生长的影响 n利用15N标记法研究不同氮效率水稻生育前期氮素吸收 动态 n不同氮效率水稻苗期对15 NH4+ 的吸收动力学研究 n实时荧光定量PCR研究增硝营养对不同氮效率水稻铵 转运蛋白（OsAMT1;1-1;3）的表达的影响 第二部分 增硝营养全生育期内 对不同氮效率水稻生长和氮素 吸收同化的影响 材料与方法 n品种：对增硝营养响应强的氮高效品种南 光；对增硝营养响应弱的氮低效品种ELIO 。 n处理： NH4/ NO3比例分别为100/ 0和 75/ 25 增硝营养对不同氮效率水稻产量的影响 表1不同营养条件下水稻的产量构成性状 品种 NH4+/ NO3产量（g/pot）穗数/株实粒数/穗结实 率%千粒重(g) 南光 100/014.71.07 a6.040.47 a53.63.11 a76.14.41 a22.71.25 a 75/2517.80.82 b6.010.33 a67.24.09 b88.24.80 b23.11.17 a ELIO 100/09.800.76 a3.970.25 a40.53.15 a41.93.06 a30.51.62 a 75/2510.50.88 a4.020.31 a41.12.99 a45.52.72 a31.81.33 a 各生育时期水稻的生物量 图2-1. 增硝营养对不同水稻品种在不同生育时期干物重的影响 S：苗期; T: 分蘖盛期; H: 齐穗期; M: 成熟期 各生育时期水稻的氮素吸收量 图2-2. 增硝营养对不同水稻品种在不同生育时期氮积累量的影响 S：苗期; T: 分蘖盛期; H: 齐穗期; M: 成熟期 水稻叶片硝酸还原酶活性（NRA）在不同生育 时期对增硝营养的的响应 图2-3. 增硝营养对水稻叶片硝酸还原酶活性的影响 S：苗期; T: 分蘖盛期; H: 齐穗期; 水稻根系谷氨酰胺合成酶活性（GSA）在不同 生育时期对增硝营养的响应 图2-4. 增硝营养对水稻根系谷氨酰胺合成酶活力的影响 S：苗期; T: 分蘖盛期; H: 齐穗期; 水稻叶片谷氨酰胺合成酶活性（GSA）在不同 生育时期对增硝营养的响应 图2-5. 增硝营养对水稻根系谷氨酰胺合成酶活力的影响 S：苗期; T: 分蘖盛期; H: 齐穗期; 结论 u增硝营养可以使南光的籽粒产量提高21。 u增硝营养可以促进南光在苗期、分蘖盛期、 齐穗期和成熟期对氮素的吸收，从而促进其生 长。 u增硝营养促进了南光对NH4和NO3的同化 利用。 既然增硝营养能够促进南光的生长，那 么是从哪些方面影响其生长的？对根系 生长的影响如何？ 试验内容 n铵硝比对不同氮素利用效率水稻的生理效应 n增硝营养全生育期内对不同氮效率水稻生长和氮素吸 收同化的影响 n增硝营养对不同氮效率水稻根系生长的影响 n利用15N标记法研究不同氮效率水稻生育前期氮素吸收 动态 n不同氮效率水稻苗期对15 NH4+ 的吸收动力学研究 n实时荧光定量PCR研究增硝营养对不同氮效率水稻铵 转运蛋白（OsAMT1;1-1;3）的表达的影响 第三部分 增硝营养对不同氮 效率水稻根系生长的影响 材料与方法 n品种：氮高效水稻品种南光；氮低效品种 ELIO。 n处理： NH4/ NO3比例分别为100/ 0和75/ 25。 n生理指标：不同生育时期水稻根系的生长； 苗期水稻的根系形态特征 各生育时期水稻根系的生物量 图3-1. 增硝营养对不同水稻品种根系生长的影响 S：苗期; T: 分蘖盛期; H: 齐穗期; M: 成熟期 各生育时期水稻根系的氮素吸收量 图3-2. 增硝营养对不同水稻品种在不同生育时期氮积累量的影响 S：苗期; T: 分蘖盛期; H: 齐穗期; M: 成熟期 水稻苗期根系生长和氮素吸收对增硝营养的 响应 表3-1 增硝营养对不同N效率水稻根系生长和氮素吸收的影响 水稻苗期根系形态对增硝营养的响应 结论 u增硝营养可以显著促进氮高效水稻品种南光 在苗期、分蘖盛期、齐穗期和成熟期根系的生 长，从而促进了其氮素吸收。 既然增硝营养能够促进南光的总氮素吸 收和根系生长，那么对铵态氮和硝态氮 吸收的情况分别是怎样的？ 试验内容 n铵硝比对不同氮素利用效率水稻的生理效应 n增硝营养全生育期内对不同氮效率水稻生长和氮素吸 收同化的影响 n增硝营养对不同氮效率水稻根系生长的影响 n利用15N标记法研究不同氮效率水稻生育前期氮素吸收 动态 n不同氮效率水稻苗期对15 NH4+ 的吸收动力学研究 n实时荧光定量PCR研究增硝营养对不同氮效率水稻铵 转运蛋白（OsAMT1;1-1;3）的表达的影响 第四部分 利用15N标记法研究不同 氮效率水稻生育前期氮素吸收动态 材料与方法 n品种：氮高效水稻品种南光；氮低效品种ELIO。 n处理： NH4/ NO3比例分别为100/ 0和75/ 25，其 中NH4用15N标记。 n培养：从营养液培养开始即用15N标记NH4，分别在 苗期（30d）、分蘖初期（45d）和分蘖盛期（60d） 采样，测定植株体15NH4内含量。 计算方法 n测定普通氮素处理的水稻植株体内的15N丰度作为 背景值。15N标记的植株体内的15N原子百分超按如 下方法计算： 15N 吸收量 = (15N(L+S)% W(L+S) TN(L+S)%) + (15NR% WR TNR%) 15N-NH4+ 吸收效率 (%) = 15N 吸收量 (mg) / 15N 供 给量 (mg) *100 不同氮效率水稻生长对增硝营养的响应 图4-1. 增硝营养对不同水稻品种干物重的影响 S：苗期; E-T: 分蘖初期; M-T: 分蘖盛期 不同氮效率水稻氮素吸收对增硝营养 的响应 图4-2. 增硝营养对不同水稻品种氮积累量的影响 S：苗期; E-T: 分蘖初期; M-T: 分蘖盛期 增硝营养对水稻15NH4+吸收量的影响 表4-1 生育前期南光和ELIO的 15NH4+ 吸收量（mg pot-1 ） 增硝营养对水稻15NH4+吸收效率的影响 表4-2 生育前期南光和ELIO的 15NH4+ 吸收效率（） 品种 NH4+-N /NO3-N苗期分蘖初期 分蘖盛期 叶片 南光100/03.610.09 a5.810.29 a10.00.74 a 75/255.450.26 b8.100.20 b14.70.36 b ELIO 100/06.640.07 a9.360.50 a16.60.44 a 75/256.930.25 a10.70.45 a17.50.14 a 根系 南光100/00.540.01 a0.830.01 a1.380.08 a 75/250.880.02 b1.160.01 b2.340.06 b ELIO100/00.900.05 a1.160.01 a1.880.12 a 75/250.930.03 a1.180.05 a1.920.05 a 15N-NH4+ 吸收效率 (%) = 15N 吸收量(mg) / 15N 供给量 (mg) *100 增硝营养对水稻NO3-吸收量的影响 表4-3 生育前期南光和ELIO吸收的 NO3- （ mg pot-1 ） 结论 u增硝营养不仅能够促进南光根系的氮素吸收和生长 ，也能够促进其地上部的氮素吸收和生长。 u增硝营养能够促进南光对15NH4的吸收效率，但对 ELIO的吸15NH4效率没有显著影响。 u两个不同氮效率水稻品种均能够吸收大量的NO3， 且其吸NO3量在分蘖盛期最高，苗期次之，分蘖盛期 最少。 既然增硝营养能够促进南光的铵态氮吸 收数量，那么对其吸收速度是如何影响 的？以及如何影响其吸收？ 试验内容 n铵硝比对不同氮素利用效率水稻的生理效应 n增硝营养全生育期内对不同氮效率水稻生长和氮素吸 收同化的影响 n增硝营养对不同氮效率水稻根系生长的影响 n利用15N标记法研究不同氮效率水稻生育前期氮素吸收 动态 n不同氮效率水稻苗期对15 NH4+ 的吸收动力学研究 n实时荧光定量PCR研究增硝营养对不同氮效率水稻铵 转运蛋白（OsAMT1;1-1;3）的表达的影响 第五部分 不同氮效率水稻苗期对15 NH4+ 的吸收动力学研究 材料与方法 n品种：氮高效水稻品种南光；氮低效品种ELIO。 n培养： 在国际水稻所营养液中培养30d n吸收试验：在进行吸收实验的前2天，将营养液更换为无N的国际 水稻所常规营养液。吸收液中NH4浓度系列为0.025、0.05、0.1 、0.15、0.2、0.3、0.4、0.8、1.2 mmol L-1 ，重复3次。其中NH4 均用15N标记(NH4)2SO4, 15N丰度为 40.2 %。测定时取生长均匀 的健壮秧苗3株为一个测量单位，将其根系全部浸入20ml的NH4 系列吸收液中吸收2h。2h结束后立即将水稻取出并称重，然后烘 干至恒重，称其干重。 n与此同时，在上述NH4浓度系列中分别加入0.5 mmol L-1 NO3- ， 以研究NO3-对水稻吸收NH4的特征的影响。 生物量（干重，g/株） Dry weight（g/plant） NH4+吸收速率 (gg-1 plant DWh- 1 ) 南光ELIO 图5-1 NO3对不同氮效率水稻在苗期（30d龄） 吸收NH4的影响 表5-1 NO3对不同氮效率水稻苗期（30d龄）NH4 吸收动力学参数的影响 品种 NH4吸收动力学参数 Vmax (gg-1 plant DWh-1)b Km (M) Without NO3-With NO3-Without NO3-With NO3- 南光51.1 0.21 a58.3 0.27 b30.2 2.07 a31.1 1.54 a ELIO58.6 0.26 a58.4 0.37 a29.7 2.26 a31.6 2.77 a 结论 u增硝营养可以促进南光对15NH4的吸收速 率，但对ELIO的15NH4的吸收速率没有影响 。 uNO3-对15NH4吸收的影响主要在于影响NH4 载体的运转速率而非吸收位点与NH4之间 的亲和性。 既然增硝营养能够提高NH4载体的运转 速率，那么是不是影响水稻铵转运蛋白 的表达？ 试验内容 n铵硝比对不同氮素利用效率水稻的生理效应 n增硝营养全生育期内对不同氮效率水稻生长和氮素吸 收同化的影响 n增硝营养对不同氮效率水稻根系生长的影响 n利用15N标记法研究不同氮效率水稻生育前期氮素吸收 动态 n不同氮效率水稻苗期对15 NH4+ 的吸收动力学研究 n实时荧光定量PCR研究增硝营养对不同氮效率水稻铵 转运蛋白（OsAMT1;1-1;3）的表达的影响 第六部分 实时荧光定量PCR研究增硝 营养对不同氮效率水稻铵转运蛋白（ OsAMT1;1-1;3）的表达的影响 水稻高亲和转运蛋白 OsAMT1家族的三个基 因同源性很高，而和其 他家族的同源性比较低 Loque and von Wiren, 2004 材料与方法 n品种：氮高效水稻品种南光；氮低效品种ELIO n培养： 在国际水稻所营养液中培养30d, N为2.0 mmolL-1的(NH4)2SO4 n处理：在生长至30d时，将营养液更换为无N的国际水 稻所常规营养液培养水稻7天。氮饥饿结束后将一半的 水稻放入纯铵营养液中培养，另一半水稻放入增硝营 养液中培养(NH4+/NO3- 为 75/25)。2h后将植株取出， 迅速剪根尖(1-2 cm)和倒二叶中间部分(4cm)浸入液氮 中冷冻，放入-80冰箱中冷冻保存以制备RNA。 材料与方法 nRNA提取：Trizol提取法 n引物设计及合成：在NCBI（/）上查 得OsAMT1;1-1;3 的基因序列，然后用Primer Premier 5 软件设计 三个基因的特异引物，引物合成及产物测序由上海博亚生物技术 有限公司完成。 Actin (OsRac1) 为本试验中应用的看家基因 n定量PCR: SYBR Green 实时荧光定量PCR技术 n数据计算：根据OsAMT1;1-1;3及Actin 标准曲线，计算出各自的 起始模板数，后以基因/Actin计算出相对表达量。 图6-1. OsAMT1 (OsAMT1; 1-1; 3) 在南光和ELIO根系和叶片的相对表达数量 1; 1: OsAMT1; 1; 1; 2: OsAMT1; 2; 1;3: OsAMT1; 3 增硝营养对水稻铵转运蛋白OsAMT(1;1-1;3) 表达量的影响 图