血清碱性磷酸酶活性测定ppt课件.ppt

血清血清碱性磷酸酶碱性磷酸酶活性测定活性测定 磷酸苯二磷酸苯二钠钠法法 1 主要内容：主要内容： n n 实验实验 目的目的 n n 实验实验 原理原理 n n 实验实验 器材与器材与试剂试剂 n n 实验实验 操作操作 n n 计计算算 n n 临临床意床意义义 n n 注意事注意事项项 2 酶活力酶活力：也称酶活性，是表示催化某一特定反应：也称酶活性，是表示催化某一特定反应 的能的能 力。可以用在一定条件下所催化的某一特力。可以用在一定条件下所催化的某一特 定化学速度表示。定化学速度表示。 酶催化反应速度越快，酶活力升高，反之活力愈酶催化反应速度越快，酶活力升高，反之活力愈 低。低。 底物减少量或生成物增加量底物减少量或生成物增加量 酶促反应速度酶促反应速度= = 单位时间单位时间 基本概念基本概念 3 实验目的实验目的 掌握酶活力测定的一般方法掌握酶活力测定的一般方法 掌握血清中掌握血清中ALPALP活力测定方法活力测定方法 与临床意义与临床意义 4 思考思考 n n 如何测定酶活力的大小如何测定酶活力的大小？ 酶酶活力活力：酶催化某一化学反应 酶催化某一化学反应 的能力，其衡量的标的能力，其衡量的标 准是准是 酶促反应速度的大小酶促反应速度的大小 。 酶促反应的速度：酶促反应的速度： 常用常用单单位位时间时间 内底物的减少量或内底物的减少量或产产物的物的 生成量生成量来表示。来表示。 5 酶活力测定方法酶活力测定方法 n n 终止测定法（或定时法）：终止测定法（或定时法）： * *本次实验的方法本次实验的方法 通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应， 测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应的平均速度。测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应的平均速度。 n n 连续监测法：连续监测法： 连续监测法是指每隔一定时间（连续监测法是指每隔一定时间（2 260s60s） ，连续多次测定酶反应过程中某一反应产物，连续多次测定酶反应过程中某一反应产物 或底物量随时间变化的数据，求出酶反应初或底物量随时间变化的数据，求出酶反应初 速度，间接计算酶活性浓度的方法。速度，间接计算酶活性浓度的方法。 n n 适用于自动生化分析仪适用于自动生化分析仪 n n 目前已取代固定时间法而成为临床实验室测目前已取代固定时间法而成为临床实验室测 6 n n 碱性磷酸酶碱性磷酸酶（ALPALP）是一组在是一组在碱性环境碱性环境中中水解磷酸酯水解磷酸酯 的酶类。的酶类。 n n 来源：广泛分布于人体的骨、肾、肝、肠、血清、胆来源：广泛分布于人体的骨、肾、肝、肠、血清、胆 汁等部位，但骨骼、牙齿、肾和肝脏中含量较多。正常汁等部位，但骨骼、牙齿、肾和肝脏中含量较多。正常 人血清中人血清中ALPALP主要来源于主要来源于肝脏肝脏。 n n 是一种能够将对应底物是一种能够将对应底物去磷酸化去磷酸化的酶，即通过水解磷的酶，即通过水解磷 酸单酯将底物分子上的酸单酯将底物分子上的磷酸基团磷酸基团除去，并生成除去，并生成磷酸根离磷酸根离 子子和和自由的羟基自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等 。而该脱去磷酸基团的过程称为去磷酸化或脱磷酸化。而该脱去磷酸基团的过程称为去磷酸化或脱磷酸化。 n n 碱性磷酸酶在碱性环境中有最大活力。碱性磷酸酶在碱性环境中有最大活力。 什么是什么是ALPALP？ 7 n n 实验原理实验原理 碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使之碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使之 水解生成酚和磷酸。酚在碱性溶液中与水解生成酚和磷酸。酚在碱性溶液中与4-4-氨基安替氨基安替 比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌类化合物，比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌类化合物， 其颜色深浅与其颜色深浅与ALPALP活性成正比。活性成正比。 磷酸苯二钠磷酸苯二钠+H+H 2 2 OO 苯酚苯酚+ +磷酸氢二钠磷酸氢二钠 苯酚苯酚+4-+4-氨基安替比林氨基安替比林 红色醌亚胺衍生物红色醌亚胺衍生物 ALPALP pH=10pH=10 铁氰铁氰铁氰铁氰 化化钾钾钾钾 8 试剂与仪器试剂与仪器 器材：器材： 5ml5ml移液管，移液管，1ml1ml移液管，移液管，100100或或200ul200ul微量可调式移液微量可调式移液 器，器，721E721E分光光度计，分光光度计，1cm1cm比色皿，比色皿，3737 恒温水浴恒温水浴 试剂：试剂： n n 1 10.1mol/L0.1mol/L碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液(pH10.0) (pH10.0) 无水碳酸钠无水碳酸钠 6.36g6.36g，碳酸氢钠，碳酸氢钠3.36g3.36g，4-4-氨基安替比林氨基安替比林1.5g1.5g，溶于，溶于 800mL800mL蒸馏水中，定容蒸馏水中，定容至至1 1L L。置棕色瓶中保存。置棕色瓶中保存。 n n 2 220mmol/L20mmol/L磷酸苯二钠溶液磷酸苯二钠溶液 先将先将5 500ml00ml蒸馏水煮蒸馏水煮 沸，迅速加入沸，迅速加入磷酸苯二钠磷酸苯二钠2.18g(2.18g(磷酸苯二钠如含磷酸苯二钠如含2 2分子分子 结晶水，则应称取结晶水，则应称取2.54g) 2.54g) ，冷却后加氯仿，冷却后加氯仿2ml2ml防腐，在防腐，在 4 4冰箱保存。（用剩的溶液不应再倒回瓶中）冰箱保存。（用剩的溶液不应再倒回瓶中） n n 3 3显色液（铁氰化钾的硼酸溶液）显色液（铁氰化钾的硼酸溶液） 称取铁氰化钾称取铁氰化钾 2.5g2.5g，硼酸，硼酸17g17g，各自溶于蒸馏水，各自溶于蒸馏水400ml400ml中，两液混合中，两液混合 后，加蒸馏水至后，加蒸馏水至1 1L L，置棕色瓶中避光保存，置棕色瓶中避光保存( (如出现蓝如出现蓝 绿色即弃去绿色即弃去) )。 n n 4 4酚标准工作液（酚标准工作液（0.05mg/ml0.05mg/ml） 购买合格的二级标购买合格的二级标 准品。准品。 9 实验操作实验操作 取取4 4支试管，如下操作：支试管，如下操作： 立即混匀。用立即混匀。用510nm510nm波波长长（红红色色醌醌物物质质的最大吸收波的最大吸收波长长）比色，以蒸）比色，以蒸馏馏水水 调调零点，零点，读读取各管吸光度。取各管吸光度。 * *保持反应时温度是均衡的，保持反应时温度是均衡的，37C 37C 测定管测定管标准管标准管空白管空白管对照管对照管 血清（血清（mlml）0.1000.100 酚标准液酚标准液0.1000.100 蒸馏水蒸馏水0.1000.100 pH10pH10碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液1.001.001.001.001.001.001.001.00 混匀，混匀，3737水浴保温水浴保温5min5min，同时将底物预热，同时将底物预热 底物液底物液1.001.001.001.001.001.001.001.00 混匀，混匀，3737水浴保护水浴保护15min15min 铁氰化钾溶液铁氰化钾溶液3.003.003.003.003.003.003.003.00 血清血清0.1000.100 10 计算公式计算公式: : 参考值参考值: : 成人：成人：313313 KingsKings单位，单位， 儿童：儿童：528Kings528Kings 单位。单位。 ALP ALP 活力活力= （AA测测测测定定AA对对对对照照） （AA标标标标准准AA空白空白） XX 0 0.05.05XX 100100（kingskings单单单单位）位） 11 临床意义临床意义 n n 在在临临床上，血清床上，血清ALPALP测测定常作定常作为为肝胆疾病和骨骼疾病的肝胆疾病和骨骼疾病的临临 床床辅辅助助诊诊断指断指标标。 n n 1. 1. 血清血清ALPALP活性升高活性升高 肝胆疾病肝胆疾病： 阻塞性黄疸、急性或慢性黄疸性肝炎、肝癌等；骨阻塞性黄疸、急性或慢性黄疸性肝炎、肝癌等；骨 骼疾病：由于骨的骼疾病：由于骨的损伤损伤 或疾病使成骨或疾病使成骨细细胞内所含高胞内所含高浓浓度的度的 ALPALP释释放放进进入血液中，引起血清入血液中，引起血清ALPALP活性增高，如活性增高，如纤维纤维 性骨性骨 炎、成骨不全症、佝炎、成骨不全症、佝偻偻病、骨病、骨软软化病、骨化病、骨转转移癌和骨折修复移癌和骨折修复 愈合期等愈合期等。 n n 2. 2. 血清血清ALPALP活性降低活性降低 : : 比比较较少少见见，主要，主要见见于呆小症，重症慢性于呆小症，重症慢性肾肾炎、乳炎、乳 糜泻、糜泻、 贫贫血、血、恶恶病病质质等。等。 12 注意事项注意事项 酚标准液开后不能久置。酚标准液开后不能久置。 底物液不能含有酚，若含酚则显底物液不能含有酚，若含酚则显红色红色，说明磷酸，说明磷酸 苯二钠已分解，不宜使用。苯二钠已分解，不宜使用。 加入铁氰化钾后必须加入铁氰化钾后必须迅速混匀迅速混匀( (为了改变为了改变PHPH来终来终 止酶促反应），否则有影响，偏大。止酶促反应），否则有影响，偏大。 铁氰化钾溶液中加入硼酸有稳定最后所显色的作铁氰化钾溶液中加入硼酸有稳定最后所显色的作 用。此液应避光保存，如出现用。此液应避光保存，如出现蓝绿色蓝绿色即作废即作废。 13 思考题思考题 1. 1. 本次实验是用的什么方法？终止剂是什么？为什么加入铁氰化钾本次实验是用的什么方法？终止剂是什么？为什么加入铁氰化钾 硼酸液后必须迅速混匀？有何影响？硼酸液后必须迅速混匀？有何影响？ 答：终止法；终止剂是答：终止法；终止剂是 铁氰化钾硼酸液；硼酸改变了铁氰化钾硼酸液；硼酸改变了PHPH，使其，使其 不再处于最适不再处于最适PHPH。 2. 2. B B