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第十一章 吸光光 度法 11.1 吸光光度法概述 n吸光光度法是光学分析法的一种，也称为吸 收光谱法。它是基于物质对光的选择性吸收 而建立起来的分析方法。 n吸光光度法分类: 比色法、可见光分光光度法、紫外分光光 度法、红外光谱法和原子吸收分光光度法。 n吸光光度法意义:定性、定量分析 吸光光度法的 特点 n（）灵敏者度高 可用于测定微量组分的 含量，测定下限可达10-5-10-6molL-1。 n（）准确度较高 比色法的相对误差为5%- 20%，分光光度法的相对误差为2%-5%。 n（）简便快速 吸光光度法所使用的仪器 设备简单，价格便宜，一般实验室都能具备 。 n（）应用范围广 几乎所有的无机离子和 有机化合物都可直接或间接的用分光光度法 进行测定。 第二节 基本原理 n一、光的本质与溶液的颜色 n二、光的吸收定律 n三、吸收光谱曲线 一、光的本质与溶液的颜色 区域 波长长范围围跃跃迁类类型光谱类谱类 型 射线线10-310（nm ） 内层电层电 子跃跃迁射线线吸收、发发射、衍射，荧荧光光谱谱、 光电电子能谱谱 远远紫外10200（nm ） 价电电子和非键电键电 子 跃跃迁 远远紫外吸收光谱谱，光电电子能谱谱 紫外200400（nm ） 紫外-可见见吸收和发发射光谱谱 可见见光400750（nm ） 近红红外0.752.5（m ） 分子振动动近红红外吸收光谱谱 红红外2.51000（m ） 分子振动动红红外吸收光谱谱 微波0.1100（cm ） 分子转动转动 、电电子自 旋 微波光谱谱，电电子顺顺磁共振 表111 电磁波谱 各种色光的近似波长长范围围 光的颜色 波长范围（ nm） 光的颜 色 波长范围（ nm） 红色610780青色480500 橙色595610蓝色435480 黄色560595紫色400435 绿色500560 n可见色光的互补性 n不同物质对各种波长光的吸收具有选择性 n 该溶液对该波长范围的光都不吸收，则溶 液无色透明。 n 如果溶液选择性的吸收了某种颜色的光， 则溶液将呈现出它的互补色 。 如： 高锰酸钾溶液因吸收了绿色光而呈现紫色 ，氯化钠溶液让日光全部透过而呈无色透明。 n1透光率T 和吸光度A I0Ia+It （11-1） I0为入射光的强度，Ia为吸收光的强度，It为透过光 的强度。 nT%= 100 nA1g =1gT =1g 二、光的吸收定 律 2光的吸收定律朗伯比尔定律 n朗伯定律 Ak1b （11-4） n比尔定律 Ak2c （11-5） n朗伯比尔定律 Abc （11-6） n可表述为：当一束平行的单色光通过均匀、 无散射的溶液时，在单色光强度和溶液温度 等条件不变的情况下，溶液的吸光度正比于 溶液浓度与液层厚度的乘积。 n上述的k1、k2、均为比例常数，又称为吸光 系数，它表示物质对光的吸收能力。 3吸光系数与摩尔吸光系 数 n (1)当溶液浓度c的量纲为gL-1时，则吸光系 数的量纲为Lg-1cm-1。 n (2)当溶液浓度c的量纲为molL-1时，比例常 数改用符号表示，称为摩尔吸光系数，量 纲为Lmol-1cm-1，朗伯比尔定律表示为： n Abc (11-7) n和可以通过下式换算： n M (11-8) n 式中：M为吸光物质的摩尔质量。 三、吸收光谱曲线 n吸收光谱曲线又称吸收曲线，它是溶液吸光度随入 射光波长变化的曲线。 图112 不同浓度KMnO4溶液的吸收曲线 （1）溶液对不同波长光的吸收有选择性。 （2）同一溶液不同浓度的吸收曲线形状相似， （3）在最大吸收波长附近（不一定在max处） ， 即使浓度较低时，吸光度A也有较大的数值。 物质对光的吸收程度可用最大吸收波长下 的摩尔吸光系数max表示。 max 10 属超高灵敏度。 第三节 分析 方法 n一 目视比色法 n 1 目视比色法原理 n 目视比色法的理论依据是朗伯比尔定律 。当日光透过组成相同的两个有色溶液时，如 果液层的厚度相等，则颜色深浅相同（吸光度 相等）的溶液浓度相等。 2目视比色法的测定方法 n 测定时将标准溶液按照由少至多的顺序依次加入 到一套（610个）比色管中，加入等量的显色剂， 加水稀释至刻度，摇匀可得一系列颜色由浅至深的 标准色阶。另取一比色管，加入一定量的试液，在 相同条件下显色并稀释至刻度。将该比色管与标准 色阶进行比较，根据颜色相同，浓度相同的原理， 可求得试液的浓度。 操作简便； n缺点是标准色阶不易保存，常需临时配制。 主观误差较大。 二、可见分光光 度法 n 可见分光光度法是以钨丝灯发出的光作光源，灯光 经单色器色散，取所需波长的单色光通过被测溶液， 测得溶液的吸光度，然后进行分析的方法。 图114 721型分光光度计结构示意图 1.光源 2.透镜 3.反光镜 4.狭缝 5.准光镜 6.棱镜 7.吸收池 8.光门 9.保护玻璃 10.光电管 分光光度计主要由光源、单色器、吸 收池、检测器、显示器等五个部件构 成。 n（1）光源 以12V的钨丝灯作光源，单色光的波长范围为360 800nm。 n（2）单色器 单色器的作用是将钨丝灯发出的复合光分解为单色 光。单色器由入射狭缝、色散元件（棱镜或光栅）、准光镜和出光 狭缝组成。 n（3）吸收池 吸收池又称比色杯或比色皿，它是由无色透明的耐 腐蚀玻璃制成，用来盛放被测溶液和参比溶液。每台仪器通常配有 厚度为0.5cm、1.0cm、2.0cm、3.0cm、5.0cm等规格的吸收池供选 用。 n（4）检测器 分光光度计常用的检测器是光电管或光电倍增管， 光电管是一个二极管，管内装有一个阳极和一个光敏阴极 n（5）显示器 显示器的作用是把放大的讯号以适当的方法显示或 记录下来，721型分光光度计的显示器是指针式的微安电表，在微 安电表的标尺上刻有透光率和吸光度两种刻度， 第四节 溶液浓度的测定方法 n一、标准曲线法 n二、比较法 一、标准曲线 法 n用标准溶液配成由稀到 浓的一系列已知浓度的 标准溶液，测定各溶液 的吸光度，以浓度c为横 坐标，吸光度A为纵坐标 ，绘制A-c曲线。如果符 合比尔定律，该曲线为 通过原点的一条直线， 称为标准曲线（或工作 曲线）， 图117 标准曲线 二、比较法 n 在max处分别测出标准溶液和试样溶液的 吸光度，根据朗伯比尔定律： nA标bc标 nA样bc样 n得 n c样c标 （11-9） 第五节 显色反应及影响因素 n一、对显色反应的要求 n1、选择性要好 n 较好的显色反应是显色剂仅与被测成分反应，这种试剂称为专属显色 剂。 n2 、灵敏度要高 n 要求有色化合物的摩尔吸光系数要足够大，为104105时属于高灵 敏度的显色反应。但应注意，灵敏度高的显色反应选择性不一定高。对 高含量组分，测定时不一定要选择灵敏度高的显色反应。 n3、有色化合物的组成要恒定，化学性质要稳定 n 这样可以保证在测定过程中吸光度基本不变，否则将影响吸光度测定 的准确度及重现性。 n4、显色剂在测定波长附近应无明显吸收 n 一般要求有色化合物的最大吸收波长与显色剂的最大吸收波长之差大 于60nm。 二、影响显色反应的 因素 n1、显色剂的用量 n 显色剂的适宜用量常通过实验来确定，其方法 是：其它条件固定，改变显色剂的用量，测定吸光 度，绘制A-c关系曲线，找出吸光度不再增大的显色 剂用量范围，如图11-9所示的a-b部分，则可在a-b 间选择合适的显色剂用量。 图118 显色剂用量的选择 2 溶液的酸度 n 显色剂大多是有机弱酸，因此酸度对显色反应的影 响是多方面的。显色反应的最宜酸度由实验方法确定 。 n3 显色时间 n 每个显色反应所需时间和颜色能稳定地保持多久，可 通过实验确定。测定时试样与标准系列显色时间应尽 可能保持一致。 n4 温度 n 升高温度可加快反应速率。但升高温度也会加快副 反应的反应速率，所以应根据具体的反应选择适当的 温度。 n5 干扰离子的分离或掩蔽 n 在样品中的其它组分，本身具有颜色，或与显色剂 反应生成有色物质，会干扰测定，必须加以分离或掩 蔽。 第六节 测量误差和测量条件的 选择 n一、测量误差的来源 n1偏离比尔定律 n2 仪器误差 1偏离比尔定律 （1）朗伯比尔定律只适用于稀溶液 当浓度超过一定数值时，吸光度与浓度不成正比 ，A-c曲线顶端发生向上弯曲的现象，偏离比尔定律 。 (2) 溶液中吸光物质不稳定 在测定过程中逐渐发生离解或缔合，使被测物质 的组成改变，因而产生偏离。 （3）单色光不纯 朗伯比尔定律的基本假设条件是入射光为单色 光，但分光光度计通过单色器获得波长范围狭小的 光带组成的复合光，由于被测物质对光带中不同波 长光的吸光度不同，因而引起对比尔定律的偏离。 2 仪器误差 n 仪器不够精密，如读数盘标尺刻 度不够准确、吸收池的厚度不完全 相同及池壁厚薄不均匀、光源不稳 定、光电管灵敏性差等。 二、测量条件的选择 n1、波长的选择 n 根据吸收曲线选取，选择的原则是吸收最大， 干扰最小。 n2、吸光度读数范围的选择 n 吸光度A的读数范围应控制在0.20.7，或透光 率应控制在2065，在此范围内仪器读数的相 对误差较小。 n3、参比溶液的选择 n 参比溶液用来调节仪器的工作零点（A=0或 T=100%）。当有干扰成分存在或试剂有色时，吸光 度A就不为零，该吸光度值称为空白值。 n在这种情况下把仪器的工作零点调为零，就等于扣 除了空白值，消除了上述干扰。 选择参比溶液的总原则 (1）用纯溶剂作参比 当试液、试剂、显色剂均无色，可直接用纯溶剂（如蒸馏水 或去离子水）作参比溶液。 （2）用空白溶液作参比 当试液无色，试剂或显色剂有色时，应用空白溶液作参比溶 液，即在同一显色反应条件，加入相同量的显色剂和试剂，但不 加待测组分，稀释至刻度即得。 （3）用试样溶液作参比 如试样中其他组分有色，试剂和显色剂无色，可用试样溶液作 参比溶液。 第七节 吸光光度法的 应用 n一、多组分的同时测定 n（1）吸收峰不重叠 n 如图1111(a)所示，x、y两组分的吸收峰不 重叠，因此，选取1附近波长的入射光测定x组分的 吸光度，y组分不干扰；选取2附近波长的入射光测 定y组分的吸光度，x不干扰。 n（2）吸收曲线相重叠 n 如图1111（b）所示，x、y两组分的吸收峰重叠。 这时可在波长1和2处分别测出溶液的总吸光度A1和A2，然 后根据吸光度的加和性，列出下列方程组： A1=1（x）bc（x）+ 1（y）bc（y） A2=2（x）bc（x）+ 2（y）bc（y） n 式中1（x）、 1（y）分别为x、y组分在波长1处的摩尔吸 光系数，2（x）、2（y）分别为x、y组分在波长2处的摩尔 吸光系数，它们可用纯组分x和纯组分y测得。解上述方程组， 即可求出x、y组分各自的含量。 二、高含量组分的测定差示 法 n适用条件：当待测组分含量高时，A-c曲线不 为线性，偏离朗伯-比尔定律。差示法是采用稍 低于试液浓度c（x）的标准溶液c（S）作参比 溶液来测定试液吸光度的方法。 n原理：用浓度为c（S）的标准溶液作参比，调 节透光率读数T为100%，测定浓度为c（x）的试 液的吸光度，该吸光度应为试液与参比溶液吸 光度之差A。由于吸光度具有加和性，因此得 n AA（x）一A（S）bc（x）-c（S）bc （11-10 ） n 上式表明，当液层厚度b一定时，两溶液吸 光度之差（A）正比于两溶液浓度之差（ c）。这就是差示法的原理。 n用A对c作图，可得一工作曲线。差示法 相当于把仪器的读数标尺扩展了，其扩展原 理见图1112。 n1将下列的吸光度值换算成透光率： n(1) 0.050 (2) 0.10 (3) 0.30 (4) 0.70 (5) 1.00 n2将0.1mgFe3+离子在酸性溶液中用KSCN显色后，稀释至500ml，取部分溶 液于1cm的吸收池中，在波长=480nm处，测得吸光度A=0.240，计算摩尔吸 光系数。 n3有一每升含双硫腙2.0mg的氯仿溶液，取部分于2cm的吸收池中，在波长 =610nm处，测得透光率T=14，求此溶液的摩尔吸光系数。（已知双硫腙 的相对分子质量为256） n4某钢样含镍约0.12，用丁二酮肟法（