实验六碱法提取质粒.ppt

实验六 碱法提取质粒 转到目录 目 录 返回标题 n一目的 n二原理 n附：原理示意图 n三试剂 n四器材 n五注意事项 n六操作步骤 1 n六操作步骤 2 n六操作步骤 3 nGFPuv质粒的信息图片 nGFPuv vectors Description nLocation of features 1 nLocation of features 2 nLocation of features 3 nLocation of features 4 nVectors Primer Location nPropagation in E. coli 一目的 n了解提取质粒的原理。 n学习和掌握质粒提取的方法和技术。 三个基本步骤： n细菌的生长和质粒的扩增 n菌体的收集裂解及质粒DNA的分离 n质粒DNA的纯化 n返回目录 n返回目录 二原理 n 质粒是细菌内的共生型遗传因子，它能在细菌中垂直遗传并 且赋予宿主细胞一些表型。质粒是携带外源基因进入细菌中扩增 或表达的重要媒介，这种基因的运载工具在基因工程中具有极广 泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基体的实验 技术。 n 质粒的提取是利用质粒DNA与染色体DNA分子大小不同和性 质的差异性进行的。染色体DNA比质粒DNA大得多，且是线状分 子易断，经加热或碱处理后容易变性并产生沉淀，即使冷却或碱 性被中和后也不可能复性，与变性蛋白质及细胞碎片一起沉淀析 出。质粒DNA是共价结合的环状分子，不会因加热或碱处理等被 折开，加热冷却或恢复中性PH后又呈天然构型，溶解在溶液中。 这样通过加热或碱处理后又中和PH，再用离心的方法就可把质粒 DNA提取出来。 n原理示意图 n返回目录 原理示意图 返回目录 返回原理 三试剂 n1. LB培养基 detail n2. STE detail n3. 溶液 I detail n4. 溶液 detail n5. 溶液III detail n6. 3M乙酸钠(pH5.2) detail n7. TE(pH8.0) detail n返回目录 LB培养基 back n配制1升培养基，应在950ml去离子水中加入： n细菌培养基用胰化蛋白胨(bacto-tryptone) 10g n细菌培养基用酵母提取物(bacto-yeast extract) 5g nNaCl 10g n摇动容器直至溶质完全溶解，5mol/L NaOH(约0.2ml) 调节pH值至7.0,加入去离子水至总体积为1L，15 lbf/in2(1.034105Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。 STE back n0.1mol/L NaCl 10mmol/L TrisCl (pH8.0) 1mmol/L EDTA(pH8.0) 在15 lbf/in2(1.034105Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。 溶液 I back n50 mmol/L 葡萄糖 n25 mmol/L TrisCl (pH8.0) n10 mmol/L EDTA (pH8.0) n在10 lbf/in2(6.895104Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟，保 存于4。 溶液 II back n0.2 mol/ L NaOH(从5mol/L贮存液中现用稀释) n1% SDS 溶液 III back n5mol/L 乙酸钾60ml n冰乙酸11.5ml n水28.5ml n所配成的溶液重钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为 5mol/L。 3M乙酸钠(pH5.2） back n在800ml水中溶解408.1g三水乙酸钠，用冰乙酸调节 pH值至5.2，加水定容到1L，分装后高压灭菌。 0.5 mol/L EDTA (pH8.0) n在800ml 水中加入 186.1g EDTA-Na2H2O，在磁力搅 拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值至8.0 (约 20g NaOH颗粒)，然后定容至1 L，分装后高压灭菌。 1 mol/L TrisCl (pH8.0) n在800ml 水中加入 121.1g Tris-base，溶解后加浓盐 酸调节溶液的pH值至8.0 ，定容至1 L，分装后高压灭 菌。 TE(pH8.0) back n10 mmol/L TrisCl (pH8.0) 1 mmol/L EDTA (pH8.0) 50TAE n242g Tris 碱 n57.1 冰乙酸 n100ml 0.5mol/L EDTA (pH 8.0) 1TAE n0.04 mol/L Tris-乙酸 n0.001 mol/L EDTA (pH 8.0) 四器材 n1. 恒温摇床 n2. 超净工作台 n3. 离心机 n4. 电泳仪和电泳槽 n5. 玻璃器皿与耗材 n量筒、三角瓶、平皿; nEP管(1.5ml, 0.5ml); n枪头(1ml, 0.2ml, 10l); n牛皮纸、纱布、牙签等 n返回目录 五操作步骤 1 挑选一个单菌落，接种到含适当抗生素的3ml LB培养液中，37 振荡培养1416小时。 取1.2 ml菌液，12,000rpm离心1分钟，收集菌体。 加入500l1ml STE buffer，涡旋打匀，12,000rpm离心1分钟， 收集菌体。 加入预冷的溶液I 100l，涡旋振荡充分悬浮，分散，混匀，冰浴 5分钟 (重悬细胞)。 加入200l溶液(现配)，快速轻柔颠倒几次，直至溶液澄清，保 持冰浴 (碱变性染色体DNA、蛋白质)。 在5分钟内，加入溶液III 150l，轻柔颠倒510次，冰浴10分钟 （利用pH差异，复性质粒DNA） 返回目录 五操作步骤 2 12,000rpm离心10分钟，沉淀染色体DNA，及不溶的变性蛋白， 取上清。 上清液用Tris-HCl饱和苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提1- 2次，每次剧烈振荡20秒，12,000rpm 离心5分钟，可见溶液分三 层，上层为质粒DNA溶液，中层为蛋白层，下层为酚层。 上清液用氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次，12,000rpm离心10 分钟。 上清液加入1/10体积 3M NaAc，2倍体积无水乙醇，混匀后，室 温放置10-15分钟。 在12,000rpm离心10分钟得到质粒DNA沉淀。返回目录 五操作步骤 3 去上清，加入1ml 75%乙醇，洗涤沉淀。 12,000rpm 离心10分钟。 去上清，吸出痕量剩余乙醇，风干。 加入3050l ddH2O或TE（pH 8.0），溶解质粒。 加入RNaseA使终浓度为20g/ml，室温放置30分钟1小时。 1%琼脂糖凝胶电泳检测所提质粒DNA纯度及浓度。 取1-5l DNA样品，加水稀释至1ml，混匀后转入 分光光度计的石 英比色杯中，测定 OD260及OD280，并计算OD260/ OD280比值和 DNA浓度： DNA浓度= OD260稀释释倍数50/1000 （ g / l ） 返回目录 分次收集4ml菌液 离心，留沉淀 五操作步骤 4 n琼脂糖（1%）凝胶电泳 n称取一定量琼脂糖凝胶，按1g中100ml的量加入1TAE，微波炉中加热约 2min，使琼脂糖溶解； n溶液冷至60 ，加入 EB至终浓度为0.5g/ml，混匀，注意戴手套操作； n将琼脂糖倒入电泳板中，使凝胶厚度约为0.3-0.5cm，迅速插上梳子，检 查有无气泡； n待凝胶完全凝固后（约30min），小心取出梳子，将凝胶板置于电泳槽中 ，加入1TAE电泳buffer，让液面高出胶面1mm； n在DNA样品中加入1/6 loading buffer，混匀后用移液枪将样品加入样品孔 中电泳，电压降选择为1-5V/cm （长度以两个电极之间的距离计算）； n根据指示剂的位置，判断是否终止电泳。 n返回目录 pGFP pBSK M 六注意事项 n为提高质粒产量，要注意下面两个步骤： n加入溶液I 后，涡旋振荡应充分打散菌体使之均匀悬浮； n加溶液II裂解要完全(快速轻柔颠倒510次) ，使蛋白质和核酸变 性； n加溶液III后PH要达到中性(轻柔振荡510次 )，使质粒DNA复性 ，这样才能使质粒DNA与染色体DNA完全分开，否则，难分开， 所以裂解和复性这两步要从严掌握。 n返回目录 周四： 熟悉实验原理及步骤，清洗三角瓶、量筒等器皿，装枪头，1.5 / 0.5 ml离心管，装牙签及配溶液等 50TAE :500 ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0):500 ml 1mol/L Tris.Cl (pH8.0):500 ml 0.1mol/L CaCl2:500 ml ddH2O: 每组100 ml 5 mol/L NaOH: 100 ml 配LB培养基 液体：全班1000 ml 150 ml4 瓶（Amp+）( 终浓度为60g/ml )，用于两 个质粒的接种 100 ml 4瓶(Amp-)，留做感受态细胞 固体（含1.5%琼脂粉）： 每组100 ml，共1500ml，可一起配再分装 每组倒5个平板（ Amp+），用于次周转化 灭菌。 七实验安排 周五： n用Kit 提取质粒DNA，倒琼脂糖凝胶板（1%），进行琼脂糖凝胶 电泳和浓度测定 n每人分别提取pGFPuv、pBSK质粒 各一管，每管60l n取1-2l电泳， 1-5l用dd H2O稀释后 在紫外分光光度计 下测 OD260及OD280，并计算浓度 n对质粒酶切过夜 周六： n酶切样品琼脂糖凝胶（1%）电泳 n用Kit对酶切后的DNA（ pBSK 大片段和GFP基因片段）片段进行 胶回收 n每组用一个柱子回收 n电泳检测胶回收情况，用紫外检测回收 DNA的浓度后，存放于- 20冰箱中 七实验安排-续 GFPuv质粒的信息图片 n返回目录 GFPuv vectors Description npGFPuv carries the “cycle 3” variant of GFP described by Crameri et al. (1). This gene was cloned between the two MCSs of the pUC19 derivative pPD16.43 (2). The GFPuv gene can be easily excised from pGFPuv. Alternatively, the GFPuv coding sequence can be amplified by PCR. The GFPuv gene was inserted in frame with the lacZ initiation codon from pUC19 so that a b-galactosidase-GFPuv fusion protein is expressed from the lac promoter in E. coli . Note, however, that if you excise the GFPuv coding sequence using a restriction site in the 5 MCS, the resulting fragment will encode the native (i.e., non-fusion) GFPuv protein. The pUC backbone of pGFPuv provides a high copy number origin of replication and ampicillin resistance gene for propagation in E. coli. n返回目录 GFPuv vectors Location of features 1 lac promoter: 95178 CAP binding site: 111124 35 region: 143148; 10 region: 167172 Transcription start point: 179 lac operator: 179199 lacZ-GFPuv fusion protein expressed in E. coli Ribosome binding site: 206209 Start codon (ATG): 217219; Stop codon: 1003 1005 5 MCS: 234281 返回目录 GFPuv vectors Location of features 2 GFPuv gene Start codon (ATG): 289291; Stop codon: 1003 1005 GFP chromophore: 481489 wt GFP cDNA sequences (3): 289454 Synthetic GFP gene with “cycle 3“ mutations from pBAD-GFPuv (1): 4551007 Cycle 3 mutation F99S (TC): 584 Cycle 3 mutation M153T (TC): 7Cycle 3 Cycle 3 mutation V163A (TC): 776 Cycle 3 silent mutation in L137 (TC): 699 Cycle 3 silent mutation in T225 (AT): 963 Q80R mutation (AG) (4): 527 返回目录 GFPuv vectors Location of features 3 GFPuv gene Arg codons optimized for E. coli: R73 (AgACgT): 505507, R96(AgACgC): 574576, R12(AgACgT): 652654, R168 (AgACgC): 790792, R1215 (AgACgT): 931933 Silent mutations (CccATccG) creating BspE I site: 510 10 region: 1490 1495 Transcriptio