食品营养与检测职业学院毕业论文-饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定.docxVIP

浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计）毕 业 论 文（设计）题 目 饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定 指导老师 张波 专业班级 食品营养与检测122 姓 名 薛雨霖 学 号 20127100213 2015年 5月 28日 摘要：蛋白酶在一定的温度和pH条件下，水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比。通过在660nm测定其吸光度，计算出蛋白酶活力。本实验确定了样品的提取液为蒸馏水、底物酪蛋白用量为1mL、样品的稀释倍数（酸性蛋白酶为1500-2500，中性蛋白酶为500-2000），并对样品中酸性和中性蛋白酶活力的稳定性进行测定，测得的稳定性较高。本方法测得的两种样品的标准偏差均小于10%，因此该方法具有良好的精密度。关键词：饲料添加剂；酸性和中性蛋白酶；酶活力目 录引言11 材料和仪器11.1 原料11.2 仪器设备11.3 主要试剂12 实验方法22.1 主要试剂的配制22.1.1 1mol/L及0.1mol/L的盐酸溶液的配制22.1.2 0.4mol/L的碳酸钠溶液的配制22.1.3 福林试剂的配制22.1.4 pH3.5乳酸缓冲液的配制22.1.5 pH7.0的磷酸缓冲液的配制22.1.6 1.0%酪蛋白溶液的配制22.1.7 0.4mol/L的三氯乙酸溶液的配制32.1.8 L-酪氨酸标准溶液的配制32.2 样品酶液的制备32.3 酸性和中性蛋白酶活力的测定方法32.4 计算43 结果与分析43.1 标准曲线绘制43.2 实验条件对饲料蛋白酶活力的影响53.2.1样品提取液对酸性蛋白酶活力的影响53.2.2底物酪蛋白用量对酸性和中性蛋白酶活力的影响63.2.3不同稀释倍数的样品酶液对酸性和中性蛋白酶活力的影响63.2.4对酸性和中性蛋白酶活力稳定性的测定7结论7参考文献8III 引言蛋白酶是饲料工业中比较常见的一种饲用酶，蛋白酶是可以使蛋白质水解成-氨基酸的酶，蛋白酶分为酸性酶、碱性酶、中性酶，酸性酶适宜pH值为2-5，产生该酶的微生物主要有黑曲霉、根霉、米曲霉；中性蛋白酶的最适宜pH值为7左右，活力值最高时约在4-50，主要由霉菌和细菌产生，其测定分析方法主要有福林显色法、紫外光谱法。因其紫外分光光度测定法的检出限和定量限都显著低于福林酚法测定法，本文使用福林显色法测定两种酶的活性，其原理是蛋白酶在一定的温度和pH条件下，水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比。通过在660nm测定其吸光度，计算出蛋白酶活力。本实验采用福林显色法对饲料蛋白酶活力进行测定，摸索福林酚法测定蛋白酶的条件。并对反应条件进行优化，以提高测定的准确性。1 材料和仪器1.1 原料 含酸性蛋白酶的饲料,含中性蛋白酶的饲料。1.2 仪器设备Lambda-20型紫外可见分光光度计(美国Pekin-Elmer公司)、Sartorious BS 223S型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)、HHS-4型电热恒温水浴锅、精密pH计、秒表等。1.3 主要试剂 1mol/L及0.1mol/L的盐酸溶液、0.4mol/L的碳酸钠溶液、福林试剂、pH3.5的乳酸缓冲液、pH7.0的磷酸缓冲液、1.0的酪素溶液（干酪素由杭州微生物试剂有限公司生产）、0.4mol/L的三氯乙酸溶液 、100g/mL L-酪氨酸标准溶液。2 实验方法 2.1 主要试剂的配制 2.1.1 1mol/L及0.1mol/L的盐酸溶液的配制取浓盐酸85mL,加水稀释并定容至1000mL，即为1mol/L盐酸溶液；取100mL1mol/L盐酸溶液，定容至1000mL，即为0.1mol/L盐酸溶液。2.1.2 0.4mol/L的碳酸钠溶液的配制称取无水碳酸钠42.4g，用水溶解并定容至1000mL。2.1.3 福林试剂的配制于1000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（NaWO4.2H2O）100g、钼酸钠(Na2MoO4.2H2O)25g、水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL。小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风厨中加入硫酸锂（Li2SO4）50g，加水50mL和数滴浓溴水（99%），再微沸15min，以除去多余的溴（冷却后仍有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却后加水定容至1000mL。混匀过滤。试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。使用时，以1份福林试剂与2份水混匀，制成稀福林试剂。2.1.4 pH3.5乳酸缓冲液的配制甲液：称取80%-90%乳酸10.6g,加水稀释并定容至1000mL。乙液：称取70%乳酸钠16g，加水稀释并定容至1000mL。使用溶液：取甲液2份，加乙液1份，再准确稀释1倍。用pH计调整pH至3.5,备用。2.1.5 pH7.0的磷酸缓冲液的配制甲液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）71.64g，用水溶解，并定容至100mL。乙液：称取磷酸二氢钠（NaH2PO4.2H2O）31.21g，用水溶解，并定容至1000mL。使用溶液：取甲液610mL，加乙液390mL混匀，用pH计调整pH至（7.00.05），备用。2.1.6 1.0%酪蛋白溶液的配制精确称取酪蛋白1.0000g，先用少量浓乳酸湿润后，再加入乳酸缓冲液使用溶液约80mL（若测定中性蛋白酶，则先用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液湿润后，再加磷酸缓冲液使用溶液约80mL）。在沸水浴中边加热边搅拌直至完全溶解。冷却后转入100mL容量瓶中，用相应缓冲溶液定容至刻度。此容液在4冰箱贮存，有效期为3天。2.1.7 0.4mol/L的三氯乙酸溶液的配制称取三氯乙酸65.4g,用水溶解，并定容至1000mL。2.1.8 L-酪氨酸标准溶液的配制精确称取预先于105干燥至恒重的L-酪氨酸标准物质0.1000g，用20mL mol/L盐酸溶解后，再用蒸馏水定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸标准储备溶液。吸取1mg/mL酪氨酸标准储备溶液10.0mL用0.1mol/L盐酸定容至100mL，即得到100ug/mL L酪氨酸标准溶液。2.2 样品酶液的制备含酸性蛋白酶的添加剂饲料：称取2g样品，精致0.01g，于100mL容量瓶中，加入90mL蒸馏水或乳酸缓冲液，摇匀后置40水浴浸提30min，取出冷却后定容至100mL，过滤。滤液根据酶活性大小，用乳酸缓冲液使用溶液稀释至适宜浓度。含中性蛋白酶的添加剂饲料：称取2g样品，精致0.01g，于100mL容量瓶中，加入90mL蒸馏水或磷酸缓冲液，摇匀后置40水浴浸提30min，取出冷却后定容至100mL，过滤。滤液根据酶活性大小，用乳酸缓冲液使用溶液稀释至适宜浓度。2.3 酸性和中性蛋白酶活力的测定方法取三支15150mm试管（一支空白管，二支样品管），分别向三支试管中准确加入稀释好的待测酶液1.0mL，将试管放入（400.2）水浴中预热5min，向二支样品管中再加入一定量的经同样预热的1%酪素溶液，准确计时，反应10min，取出。迅速、准确向三支试管中加入0.4mol/L三氯乙酸溶液2mL，于空白管中加入与样品管一样量的1%酪素溶液，摇匀。将三支试管继续置（400.2）水浴中放置10min，取出迅速冷却至室温。将三支试管中的反应液离心或过滤。另取三支18180mm的试管（一支空白管，二支样品管）分别吸取上述相应的滤出液1.0mL，0.4mol/L碳酸钠溶液5.0mL，稀福林试剂1.0mL,摇匀，置（400.2）水浴中放置20min，取出，迅速冷却至室温。以空白管（对照）调仪器零点，在风光光度计波长660nm下，用10mm比色杯，分别测二支样品管中样液的吸光度，取平均值。2.4 计算按照下式计算样品中酸性和中性蛋白酶的活力：X1 =.公式（2.1）X1蛋白酶活力，U/g（U/mL）A样品与空白的吸光度差K比色常数V样品提取时加入水的量（mL）Z酶反应体系总体积（mL）N样品二次稀释时的稀释倍数1参与反应的酶量(mL)W样品重量（g或mL）10反应时间3 结果与分析3.1 标准曲线绘制分别吸取100g/mL L酪氨酸标准溶液0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL于10mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。分别吸取L-酪氨酸标准使用溶液1.0mL，加碳酸钠溶液5.0mL和稀福林试剂1.0mL，于标准管中，混匀，见表3.1。将标准管同时置于40水浴，反应20min，取出，迅速冷却至室温，以空白管调仪器零点，在分光光度计波长660nm处测吸光度。以吸光度为横坐标，以酪氨酸量为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程,见图3.1。当吸光度为1时得酪氨酸量（g）即为比色常数K值，K97.5539。新配制的福林试剂制作新的标准曲线。表3.1 标准曲线数据L酪氨酸标准溶液体积（mL）0.01.02.03.04.05.06.0L酪氨酸标准溶液浓度（ug/mL）0.010.020.030.040.050.060.0吸光度值0.0000.0960.2000.3150.4150.5070.612图3.1 标准曲线图3.2 实验条件对饲料蛋白酶活力的影响3.2.1样品提取液对酸性蛋白酶活力的影响称取2g含酸性蛋白酶的饲料2份（每份做三个平行样），一份加蒸馏水提取，另一份加pH3.5的乳酸缓冲液提取，两种不同的提取液对酸性蛋白酶活力的影响见表3.2。表3.2 两种不同提取液对酸性蛋白酶活力的影响项 目 蒸馏水 pH3.5的乳酸缓冲液 7418 7486 7223 7626 7325 7511 酸性蛋白酶活力（U/mL） 7322 7541注：此结果为三次测得的平均值。从表3.2可知，用蒸馏水与乳酸缓冲液提取样品测得的酸性蛋白酶活力无明显差别，故下面实验均采用蒸馏水作样品的提取液。3.2.2底物酪蛋白用量对酸性和中性蛋白酶活力的影响将1mL的样品稀释液与1mL、2mL底物酪蛋白分别反应，实验结果见表3.3。表3.3 底物酪蛋白用量对酸性和中性蛋白酶活力的影响项目底物酪蛋白（mL）12酸性蛋白酶活力（U/mL）76717894中性蛋白酶活力（U/mL）79077550由表3.3可知，酪蛋白用量从1mL增加到2mL，酸性蛋白酶活力和中性蛋白酶活力都没有明显的变化，说明底物用量为1mL时酶与底物酪蛋白的结合已经饱和，因此底物酪蛋白用量都仍然采用1mL。3.2.3不同稀释倍数的样品酶液对酸性和中性蛋白酶活力的影响不同稀释倍数的样品酶液对酸性和中性蛋白酶活力的影响，见表3.4和表3.5.表3.4 不同稀释倍数对酸性蛋白酶活力的影响稀释倍数样品吸光度A1空白吸光度A2吸光度差（A1-A2）酸性蛋白酶活力（U/mL）10000.4090.0760.353649415000.3290.0610.268783920000.2650.0590.206803425000.2110.0430.1688190由表3.4可知吸光度差在0.15-0.3之间酸性蛋白酶活力较稳定，本样品可选择稀释倍数在1500-2500范围之内。本实验选择稀释倍数为2000，对酸性蛋白酶活力进行测定。表3.5 不同稀释倍数对中性蛋白酶活力的影响稀释倍数样品吸光度A1空白吸光度A2吸光度差（A1-A2）中性蛋白酶活力（U/mL）5000.4520.0720.380738510000.2340.0350.199773415000.1510.0230.128746220000.1200.0190.1017851由表3.5可知样品吸光度差在0.1-0.4之间中性蛋白酶活力较稳定，本样品可选择稀释倍数在500-2000范围之内。本实验选择稀释倍数为1000，对中性蛋白酶活力进行测定。3.2.4对酸性和中性蛋白酶活力稳定性的测定称取样品酸性蛋白酶饲料2g稀释2000倍，中性蛋白酶饲料1g稀释1000倍，分别吸取稀释液与1mL1%的酪蛋白反应，分别做6个平行样，对酸性和中性蛋白酶活力进行稳定性测定,见表3.6。由表3.6可知，酸性蛋白酶活力和中性蛋白酶活力都具有较高的稳定性。表3.6 酸性和中性蛋白酶活力稳定性样品123456平均值RSD(%)酸性蛋白酶活力（U/mL）78017625810080457945806579302.3中性蛋白酶活力（U/mL）66336653646564586594640765351.6结论本文采用福林显色法对饲料添加剂酸性和中性蛋白酶活力进行测定，实验中进一步确定了样品的提取液为蒸馏水、底物酪蛋白用量为1mL和样品的稀释倍数（酸性蛋白酶为1500-2500，中性蛋白酶为500-2000），并对样品中酸性和中性蛋白酶