实验四离心技术及物质代谢实验.ppt

实验四 离心技术及物质代谢实验 离心技术 概念： 根据物质沉降系数、质量、浮力因素等的不同， 应用离心力使物质分离、浓缩、提纯的方法。 应用： 分离、提纯、鉴别生物高分子；分离线粒体、染 色体、微粒体、溶酶体等亚细胞物质。 基本原理 F：粒子在离心场中所受的离心力 a：粒子旋转的加速度 m：沉降粒子的有效质量 ：粒子旋转的角速度 r：粒子的旋转半径(cm) ， l l离心力离心力 F= RCF(relative centrifugal force) ：相对离心力 rpm( revolutions per minute ) ：每分钟转速 低速离心时常以转速“rpm”来表示 高速离心时则以“g”表示 l相对离心力 离心力相对于重力的倍数，单位是g l沉降系数（S）: 超速离心时，颗粒在离心场 中的沉降速度用沉降系数来表示，即物质在 单位离心力场下的沉降速度。 单位：Svedberg，1S=10-13s 是是物质特有的物理常数，可间接反应分子 量的大小。 离心分离技术的基本理论数据，与物质的大 小、形状、密度及介质的密度、粘度都有关 ，通过对离心力和离心介质的选择，即可分 离纯化出不同质量大小和物理形状的物质。 另外，对某些生物高分子或亚细胞器组分的化学 结构、分子量尚不了解时，可用沉降系数对其物 理特性进行初步描述，将其区别开来，如原核生 物的核蛋白体RNA（rRNA）分为5S、16S、23S， 即是根据其在离心场中的行为来进行分类。 离心机的类型和主要构造 l 类型 工业用离心机 离心机 制备性离心机 实验用离心机 分析性离心机 普通离心机： 6000rpm 高速离心机： 600020000rpm 超速离心机：20000rpm 制备性离心机 l主要构造 转头，离心管和管帽，制冷系统，真空系 统，制动装置，指示表盘 转头 1角式转头 2荡平式转头： 这种转头是由吊着的4或6个自由活动的吊桶(离心套管)构成。 3区带转头： 区带转头无离心管，主要由一个转子桶和可旋开的顶盖组成。 4垂直转头： 其离心管是垂直放置的。 5连续流动转头： 转头与区带转头类似，由转子桶和有入口和出口的转头盖及附 属装置组成。 最大额定转速 一定的使用限度，使用一定次数或一 定时间后递减10%。 离心管 不锈钢和塑料离心管，管帽防止样品溢出 。 l离心操作的注意事项 使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡 离心管和其内容物，转头中绝对不能装载单数的管 子，当转头只是部分装载时，管子必须互相对称地 放在转头中，以便使负载均匀地分布在转头的周围 。 每个转头各有其最高允许转速和使用累计期限，使 用转头时要查阅说明书，不得过速使用。 装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行 ，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管， 有的离心管无盖，液体不得装得过多，以防离心时甩 出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀;而制备性超速离 心机的离心管，则常常要求必须将液体装满，以免离 心时塑料离心管的上部凹陷变形。 若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放 置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。 离心过程中不得随意离开 物质代谢实验 v实验二十一、糖酵解中间产物的鉴定 v血清胆固醇测定 v血清甘油三酯测定 v实验二十、邻甲苯胺法测血糖含量 实验二十一、糖酵解中间产物的鉴定 【实验目的】 检测糖酵解中间产物磷酸丙糖的生成。 【实验原理】 糖酵解的反应过程见下图： 将酵母液（含有葡萄糖及糖酵解的全部酶）在一定的 介质中（适宜的pH，必要的金属离子等）进行保温 ，在酵母液中酶体系的作用下，酵母液中原来含有的 糖就进行酵解反应，当反应进行到生成二分子磷酸丙 糖，进一步变化是在3磷酸甘油醛脱氢酶催化下进 行的，SH为3磷酸甘油醛脱氢酶的必需基团，加 入一碘醋酸可与此酶的SH起反应，从而使酶失去 活性，酵解反应就停留在磷酸丙糖阶段。 酶-SH+ICH2COOH酶S-CH2COOH+HI 然后以硫酸肼为稳定剂，保护磷酸丙糖不致自 发分解，使其不能向其他方向变化，结果磷酸 丙糖在反应体系中堆积，从而与2，4二硝基 苯肼反应生成相应的苯腙，后者在碱性溶液中 溶解呈紫红色，可借此鉴定丙糖之生成。 v【实验方法】 取试管3支，编号，按下表进行操作 记录三管所发生的情况，并加以简要的分析 CCL3COOH的作用：强酸，使糖酵解的全部酶失活。 一碘醋酸的作用：使3磷酸甘油醛脱氢酶失活。 硫酸肼的作用：稳定磷酸丙糖，使其不向其它方向转变。 试 剂（ml） 123 pH7.4磷酸盐缓冲液 一碘醋酸 硫酸肼 10CCL3COOH 酵母液 水 2.0 0.5 0.5 1.0 4.0 2.0 0.5 0.5 4.0 1.0 2.0 4.0 2.0 混匀，在3738恒温水浴中保温30分钟 一碘醋酸 硫酸肼 10CCL3COOH 水 2.0 1.0 1.0 0.5 0.5 1.0 混匀，静置10分钟，离心,3000转/min,10分钟，再取三支试管， 对号按下表操作 上清液 1mol/LNaOH 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 混匀，在室温放置10分钟 2，4二硝基苯肼 1mol/L NaOH 0.5 3.5 0.5 3.5 0.5 3.5 v实验注意事项： 成腙反应前，溶液必须先碱化并在室温放置 10min，目的是使磷酸丙糖中的磷酸基水解脱 去，生成的颜色比较稳定； 一碘醋酸和三氯乙酸是酶的抑制剂 ，使用移液 管后必须彻底清洗移液管，否则易导致实验失 败。 血清胆固醇测定（酶法） v【实验目的】 1. 了解胆固醇氧化酶法测定血清胆固醇的原理。 2. 掌握血清胆固醇测定的临床意义。 血清中总胆固醇包括胆固醇酯(CE, 70%)和游离型胆固醇 (FC, 30%)。胆固醇酯酶（CEH）先将胆固醇酯水解为胆固 醇和游离脂肪酸（FFA），胆固醇在胆固醇氧化酶（COD ）的作用下氧化生成4- 胆甾烯酮和过氧化氢。后者经过氧 化物酶（POD）催化与4-氨基安替比林（4-AAP）和酚反 应，生成红色的醌亚胺，其颜色深浅与胆固醇的含量呈正 比，在500nm波长处测定吸光度，与标准管比较可计算出 血清胆固醇的含量。反应式如下： 【实验原理】 1. 标本：不溶血的血清或血浆标本。血浆 用肝素钠、EDTA抗凝，不可用草酸盐 、氟化物。 2.取试管3支，编号，按下表操作。 【实验方法】 加入物（ul ） 测定管标准管空白管 血清10- 胆固醇标准 液 -10- 蒸馏水-10 酶应用液100010001000 【计算】 A标本 CHO（mmol/L）= 标准液浓度 A标准 【标准液】 胆固醇 5.17mmol/L（200mg/dL） 【正常参考范围】 3.105.70mmol/L 混匀后，37水浴保温15分钟，在500nm波长处 比色，以空白管调零，读取各管吸光度。 血清甘油三酯的测定（ 酶法） 【实验目的】 1、了解酶法定量测定血清甘油三酯的基本原理。 2、掌握酶法定量测定血清甘油三酯的实验方法。 血清中甘油三酯经脂肪酶水解为甘油和脂肪酸，甘油在 甘油激酶（GK）及ATP存在下，生成3-磷酸甘油，尔后， 在磷酸甘油氧化酶（GPO）作用氧化成磷酸二羟丙酮并生 成过氧化氢，过氧化氢与底物4-氨基安替比林和ESPAS在 过氧化物酶（POD）作用下，生成红色亚醌化合物，其颜 色深浅与甘油三酯含量成正比。在500nm波长处测定吸光 度，与标准管比较可计算出血清甘油三酯的含量。反应式 如下： 甘油三酯 + 4H2O 脂蛋白脂酶 甘油 + 脂肪酸 甘油 + ATP 甘油激酶/Mg2+ 甘油-3-磷酸 + ADP 甘油-3-磷酸 + O2 甘油-3-磷酸氧化酶 磷酸二羟丙酮 + H2O2 2H2O2 + ESPAS + 4-氨基安替比林 过氧化物酶 红色醌亚胺 色素+ 4H2O 【实验原理】 1. 标本：不溶血的血清或血浆标本。血浆 用肝素钠、EDTA抗凝，不可用草酸盐 、氟化物。 2.取试管3支，编号，按下表操作。 【实验方法】 加入物（ul ） 测定管标准管空白管 血清10- 甘油三酯标 准液 -10- 蒸馏水-10 酶应用液100010001000 【计算】 A标本 甘油三酯（mmol/L）= 标准液浓度 A标准 【标准液】 甘油三酯 2.26 mmol/L 【正常参考范围】 0.561.71mmol/L 混匀后，37水浴保温15分钟，在500nm波长处 比色，以空白管调零，读取各管吸光度。 葡萄糖在浓酸溶液中（加在含有硼酸的冰醋溶液中），水 浴 加热至100左右，脱水生成羟甲基呋喃甲醛（或称羟甲基糠醛 ），后者能与邻甲苯胺缩合生成蓝绿色的化合物，根据颜色深 浅并进行630nm波长比色测定其含量。 实验二十、邻甲苯胺法测血糖含量 【实验目的】 掌握邻甲苯胺法测定血糖的原理及方法 【实验原理】 1）取试