实验八酵母RNA的提取及成分鉴定浓盐法.ppt

生物化学与分子生物学实验 实验八 酵母RNA的提取及 成分鉴定（浓盐法） 生物化学与分子生物学实验 实验目的实验目的 n 掌握浓盐法提纯RNA的基本原理和方法 n 了解RNA成分鉴定的原理及其方法 生物化学与分子生物学实验 实验原理 u 核酸的分类与分布 DNA：主要存在于细胞核的染色体中, 线粒体、叶绿体、质粒有少量 RNA：存在于细胞质中 生物化学与分子生物学实验 u 样本的选择： 酵母RNA（RNA占干重的3%-10%） 制备方法： 稀碱法、浓盐法 生物化学与分子生物学实验 破碎细胞 提取 纯化 I.材料准备 II.破碎细胞或包膜内容物释放 III.核酸分离、纯化 IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V.核酸溶解在适量缓冲液或水中 制备过程： 生物化学与分子生物学实验 RNA以可溶性 钠盐的形式 游离析出 离心去除菌体, 收集上清液,调 至RNA的等电点 （pH22.5） 使RNA沉淀 析出，离心 收集沉淀 乙醚洗涤沉 淀、去除杂 质、提纯RNA 浓盐加热使酵母 细胞壁破裂，蛋 白质变性沉淀 n RNA提取方法(浓盐法) 生物化学与分子生物学实验 n n RNA成分鉴定 RNA在强酸性条件下沸水浴加热可以水解： 生物化学与分子生物学实验 1. 磷酸鉴定 通过鉴定RNA的三种水解产物来鉴定RNA: 钼酸铵钼酸铵 磷钼酸磷钼酸+FeSO+FeSO 4 4 钼蓝钼蓝 （蓝色）（蓝色） 生物化学与分子生物学实验 2. 碱基(嘌呤)鉴定 生物化学与分子生物学实验 3. 核糖鉴定 5-甲基间苯二酚 （蓝绿色） 糠醛 生物化学与分子生物学实验 仪器试剂 n 仪器 精密pH试纸（pH0.55.0）、广泛pH试纸（pH1 14）、冰块、锥形瓶、离心机、天平、电炉 干酵母、10NaCl、6M HCl、冰块、5氨水、 (NH4)2MoO4 n n 试剂 生物化学与分子生物学实验 实验操作 酵母RNA提取（4人一组） 1. 酵母破壁： 10NaCl(40mL) 100mL锥形瓶 煮沸 加入干酵母（一勺） 沸水浴40min 取出冷却 玻棒搅匀 生物化学与分子生物学实验 取出锥形瓶 自来水冷却后转 入50mL离心管 3500rpm 离心 5min 取上清 2.离心分离RNA 两两平衡后 对称放入离 心机中 生物化学与分子生物学实验 3.沉淀提纯RNA 将上清液转入 小烧杯中（不 可带入沉淀） 冰浴中冷却 用6M HCL调 pH值至 2.02.5(RNA等电点) 冰浴中静置5 -10min（可 见烧杯底部 有大量沉淀 ） 轻轻摇匀后转 入离心管，两 两平衡后对称 放入离心机 3500rpm离 心5min， 并收集沉淀 精密试纸 如何调如何调pHpH值？值？ 2.0 生物化学与分子生物学实验 RNA成分鉴定 1.溶解RNA 2. 水解RNA（此处开始2人一组） 加22d 1.5M H2SO4 沸水浴10min 取5ml RNA至大试管 溶液澄清 加1d蒸馏水 搅成糊状 加10ml蒸馏水搅匀 加5%氨水至pH6-7，继续滴加至沉淀完全溶解 广泛试纸 生物化学与分子生物学实验 核糖鉴定： 20d水解液+20d Fe3+HCL+2d 5%的5-甲基间苯二酚 3. RNA成分鉴定 嘌呤鉴定： 20d水解液+20d 0.1mol AgNO3 磷酸鉴定： 20d水解液+20d钼酸铵 +FeSO4结晶粉 加浓氨水至 沉淀消失 +10d 浓氨水 沸水浴 15min 摇匀沸水浴 2min 沸水浴 2-3min？ ？ ？ ？ （绿豆大小） 生物化学与分子生物学实验 离心机的使用方法 1.选择合适的离心管 2.使用天平对所离心样本（包括离心套筒）称量配平 3.打开离心机电源，设定离心速度和离心时间 4.按“停止”键打开离心机盖子，将样本按中心对称放置 5.盖紧盖子，按“离心”键启动离 心 6.离心结束后，待仪器完全停止 转动后方可打开盖子取出离心管 生物化学与分子生物学实验 实验结果 1 2 31 2 3 1号：磷酸鉴定（蓝色） 2号：碱基鉴定（红棕色） 3号：核糖鉴定（蓝绿色） 生物化学与分子生物学实验 思考题 u