chap4-微生物的营养和培养基.ppt

第四章 微生物的营养与培养基 营养(nutrition)：生物体从外部环境中摄取对其生命活 动必须的能量和物质，以满足正常生长和繁殖需要的一 种最基本的生理功能。 营养物(nutrient)：具有营养功能的物质。 营养物提供生命活动的结构物质、能量、代谢调节物质 和良好的生理环境。 一些微生物可利用非物质形式的能源光能。 一、细胞化学组成 整个生物界大体相同，主要是C、H、O、N（占干重90 97%），C占约50%，此外为各种无机元素，由这些元素再 组成化合物。其中C/N一般是5:1。 第一节 微生物的六种营养要素 元素 大量元素：碳、氢、氧、氮、磷、硫 其他元素：钾、钠、钙、镁、铁、锰、铜、 钴、锌、钼等 存在方式 有机物：蛋白质、糖、类脂、核酸、维生素、降 解产物、代谢中间产物 无机盐灰分 水 细胞湿重的70%90% 元素细菌酵母菌霉菌 碳5049.847.0 氮157.55.2 氢85.76.7 氧2031.140.2 磷31.51.2 硫10.30.2 微生物细胞中几种主要元素的相对含量（%干重 ） 一般生物能利用的，微生物能利用； 一般生物不能利用的，微生物也能利用； 对一般生物有害的，微生物还能利用。 微生物是杂食性的： 二、主要营养物及其功能 碳源（Carbon source） 氮源（Nitrogen source) 能源（Energy source) 生长长因子（Growth factor ) 无机盐盐(Inorganic salt) 水(Water) 六种营养要素 v 参与微生物细细胞的组组成 v 提供微生物机体进进行各种生理活动动所需的能量 v 形成微生物代谢产谢产 物的来源 功能: 营营养物质质是微生物新陈陈代谢谢和一切生命活动动的物质质基础础，失 去这这个基础础，生命也就停止。 异养微生物：必须利用有机碳源 自养微生物：能利用无机碳源 （一）碳源(carbon source) 一切能满足微生物生长繁殖所需碳元素的营养物。 碳源是需要量最大的营养物，又称大量营养物（macronutrients） q 有机碳源：蛋白质质，核酸，淀粉，葡萄糖等 q 无机碳源： CO2 , Na2CO3 , CaCO3等 异养微生物的碳源同时也是能源 糖类类： 葡萄糖，果糖，麦芽糖，蔗糖，淀粉，半乳糖，乳糖，甘 露糖，纤维纤维 二糖，纤维纤维 素，半纤维纤维 素，甲壳素，木质质素，等 有机酸： 乳酸，柠柠檬酸，延胡索酸，低级级脂肪酸，高级级脂肪酸， 氨基酸，等 醇类类： 乙醇，等 脂类类： 脂肪，磷脂，等 烃类烃类 ： 天然气，石油，石油馏馏分，石蜡油 ，等 CO2 碳酸盐盐： NaHCO3, CaCO3, 白垩，等 其他： 芳香族化合物，氰氰化物，蛋白质质，肽肽，核酸 微生物可利用的碳源(化合物分类类) 能为微生物的生命活动提供最初能量来源的化学物质或 辐射能。 （三）能源(energy source) 异养微生物的碳源同时也是能源 无机物：化能自养微生物的能源 能源谱 化学物质 辐射能：光能自养和光能异养微生物的能源 有机物：化能异养微生物的能源 （化能营养型 ） （光能营养型 ） 单功能： 辐射能 双功能： 还原态无机养料，如NH4+既是硝酸盐细菌的能 源，又是氮源 三功能： N C H O类营养物质常是异养微生物的 能 源，碳源兼氮源 一种营养物具有一种以上营养要素的功能 培养基中生长因子来源： 酵母膏、玉米浆、麦芽汁等。 作用：辅酶或酶活化所需。 维生素微生物的种 硫胺素(B1)Bacillus anthracis (炭疽芽孢杆菌) 核黄素Clostridium tetani (破伤风梭菌) 烟酸Brucella abortus (流产布鲁氏杆菌) 吡哆酸(B6)Lactobacillus spp. (各种乳酸杆菌) 生物素Leuconostoc mesenteroides (肠膜状明串珠菌) 泛酸Proteus morganii (摩氏变形杆菌) 叶酸Leuconostoc dextranicum (葡聚糖明串珠菌) 钴胺酸(B12)Lactobacillus spp. 维生素KBacteroides melaninogenicus (产黑素拟杆菌) 若干细菌所需要的维生素 维生素转移的对象代谢功能 硫胺素(B1) 乙醛基焦磷酸硫胺素是脱羧酶、转醛酶 、转酮酶的辅基，与a酮酸的 氧化脱羧和酮基转移有关 吡哆醇(B6) 氨基磷酸吡哆醛是氨基酸消旋酶、转 氨酶与脱羧酶的辅基，参与氨基 酸的消旋、脱羧和转氨 叶酸甲基即辅酶F(四氢叶酸)，参与一碳基 的转移，与合成嘌呤、嘧啶、核 甘酸、丝氨酸和甲硫氨酸有关 维生素B12 羧基，甲基钴酰胺辅酶，参与一碳基的转移 ，与甲硫氨酸和胸苷酸有关 维生素的生理功能 （五）无机盐 (inorganic salts) 所需浓度在10-3-10-4M 的元素为大量元素 所需浓度在10-6-10-8M 的元素为微量元素 无机盐的生理功能 无机盐 大量元素 微量元素 一般功能 特殊功能 细胞内一般分子成分 (P、S、Ca、Mg、Fe等) 生理调节物质 渗透压的维持 (Na+等) 酶的激活剂 (Mg等) pH的稳定 化能自养菌的能源 (S、Fe2+、NH4+、MO2-等) 无氧呼吸时的氢受体(NO3-、SO42-等) 酶的激活剂 (Cu2+、Mn2+、Zn2+等) 特殊分子结构成分 (Co、Mo等) MnSO4过（超）氧化物歧化酶（SOD）的辅因子 Co Vit B12复合成分，肽酶的辅因子 Mo固氮酶及同化型、异化型硝酸盐还原酶的成分 生理作用： 细胞组成成分 生化反应溶剂 维持各种生物大分子的稳定性，参与某些重要的 生化反应 物质运输媒体 调节细胞温度 维持细胞的渗透压 （六）水 存在状态：游离态（溶剂）和结合态（结构组成） 依碳源不同： q 异养型(heterotrophs): 不能以CO2为主要或唯一碳源 q 自养型(autotrophs): 能以CO2为主要或唯一碳源 第二节 微生物营养类型 依能源不同： q 光能营养型(phototrophs): 光反应产能 q 化能营养型(chemotrophs):物质氧化产能 依氢供体不同： q有机营养型 (heterotrophs):以有机物为供氢体 q无机营养型 (autotrophs):以无机物为供氢体 微生物的营养类型 营养类型能 源碳源实 例 光能无机营养型 （光能自养型） 光能CO2 蓝细菌 紫硫细菌 绿硫细菌 藻类 光能有机营养型 （光能异养型） 光能 CO2 及 简单有机物 红螺细菌 化能无机营养型 （化能自养型） 无机物CO2 硝化细菌 硫化细菌 铁细菌 氢细菌 化能有机营养型 （化能异养型） 有机物有机物 绝大多数微 生物， 原生动物 氢供体 无机物 有机物 无机物 有机物 v 寄生型(parasitism) 寄生于活的生物体 v 腐生型(saprophytism) 寄生于死亡的生物有机体 化能异养型微生物（根据它们利用有机物的特性 ） 营养类型划分不是绝对的，不同生活条件下，可相互转变。 在营养物质运送方面，细胞壁仅简单地排阻分子量过大 (600Da)的溶质进入, 而具有磷脂双分子层和嵌合蛋白分子 的细胞膜则是控制营养物质进入和排除的主要屏障。 依靠胞内外溶液浓度差，顺浓度梯度运输； 不消耗代谢能，无特异性； 运输氧、二氧化碳、甘油、乙醇、某些氨基酸等小分子； 利用膜内、膜外被运输物质和载体蛋白的亲和力的不同 。 特点： v 需要特异性的载体蛋白顺浓度梯度运输 v 不消耗能量 v 运输硫酸根、磷酸根、糖（真核）等 载体蛋白(carrier protein)，即透性酶（大多为诱导酶）， 有底物特异性，每种载体蛋白运输相应的物质。载体蛋白 可加快运输速度，但不能逆浓度运输。 促进扩散示意图 胞外 细胞膜 胞内 单纯扩散 促进扩散 浓度梯度 运输速率 单纯扩散和促进扩散的比较 单纯扩散随浓度增加而线性增加，而促进扩散在一定浓度后出现平台 单纯扩散、促进扩散、主动运输 ：被运输的溶质分子不发 生改变。 特点： 是微生物吸收营养的主要方式 可逆浓度梯度运输，耗能 需载体蛋白，有特异性 运输有机离子、无机离子、氨基酸、乳糖等糖类 特异性载体蛋白需要能量来改变载体蛋白的构象（亲和力 改变蛋白构象改变耗能 ） 特点： v 属主动运输类型 v 溶质分子发生化学修饰 定向磷酸化 v 需复杂的运输酶系参与 v 运输葡萄糖、果糖、甘露糖、嘌呤、核苷、脂肪酸等 基团移位 (group translocation) 每输入一个葡萄糖分子，就要消耗一个ATP 的能量。 v主要依赖磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和磷酸转移酶系统(PTS) 。 PEP+ HPr EI 丙酮酸 + P-HPr P-HPr +糖 EII 糖-P+HPr 1. 热稳定性载体蛋白(heat stable carrier protein ,HPr) 的激活 2. 糖磷酸化后运入膜内 培养基(medium，culture medium)：是一种人工配制的 、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合养料。 第四节 培养基 （一）四个原则 1、目的明确（根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基 ） 培养什么微生物、获得什么产物、用途 二、选择和配制培养基的原则和方法 2、营养协调 营养协调(注意营养物的浓度和配比，特别是碳氮比C/N比) C/N比: 微生物培养基中所含的碳源中的碳原子与氮源中氮 原子的摩尔数之比。不是简单的某碳源的重量与氮源的重量 之比。因为，不同种类的碳源和氮源，其中含碳量和含氮量 差别很大。 一般培养基的C/N比为100/0.52 。 以含氮量来看： NH3(82%)CO(NH2)2(46%)NH4NO3(35%)(NH4)2CO3(29.2%)(NH4)2SO4(21%) 适宜营养物质的选择 种类 举例说明 单糖葡萄糖，麦芽糖， 果糖，麦芽糖，半 乳糖，木糖 用作速效碳源，但会加速菌体呼吸，溶氧下降中间代 谢物积累 二糖蔗糖，乳糖用作速效碳源，但会加速菌体呼吸，溶氧下降中间代 谢物积累 多糖淀粉，玉米粉，纤 维素 迟效碳源。纤维素只有少数微生物能够作为碳源。 糖蜜甜菜糖蜜，甘蔗糖 蜜 是非常好的碳源，成分复杂，在发酵工业中常用酵母 发酵、抗生素和丙酮丁醇生产常用它为碳源。一般包 括蔗糖35%，葡萄糖9%，果糖7%，8种其它糖类4%， 其它还原物质3%，24种氨基酸占4.5%，有机酸5%， 蜡质、甾醇和磷脂占0.4%，灰分12%，水20%。 麦芽发芽的大麦主要培养酵母用，工业上用麦芽汁发酵，制作啤酒。 油脂棉籽油，玉米油， 豆油，葵花籽油等 。 热值高，液体培养时消耗氧气多。在工业上常常少量 添加作为消泡剂使用。 醇类甲醇，甘油甲醇被用来培养酵母。 烃类CH4，C2H6，C4H10 ，C12C20烷烃 热值高，液体培养时消耗氧气多。溶解性不好，液体 培养对搅拌要求高。 有机酸乙酸，乳酸，柠檬 酸等 利用会导致pH上升 表 常见见微生物氮源 种类 可以利用的微生物特点 有机氮源：牛肉浸膏、 酵母浸膏、花生饼粉、 黄豆饼粉、棉子饼粉、 玉米浆、玉米蛋白粉、 蛋白胨、酵母粉、鱼粉 、蚕蛹粉、麦麸、尿素 等 大部分微生物，如青霉 ，酵母，大肠杆菌。 含有丰富的氨基酸，是 微生物的优良氮源。 无机氮源：铵盐 、硝酸 盐、氨水等 部分微生物（氨基酸异 养型不能利用） 硝酸盐要还原后才能用 ，可以同时调节 pH。 N2少数细菌（约50多个属 ，100多种） 生物固氮是地球上仅次 于光合作用的第二个重 要的生物化学反应。 表 常用的培养基中的无机盐盐及参考浓浓度（g/L） 无机盐盐 提供的元素参考浓浓度培养基名称 MgSO4Mg0.5察氏培养基 KH2PO4/K2HPO4K，P0.12/1.0克氏培养基 KClK0.5察氏培养基 NaClNa5牛肉膏蛋白胨胨培 养基 CuSO45H2OCu0.016氧化硫酸杆菌培 养液 ZnSO47H2OZn0.22氧化硫酸杆菌培 养液 FeSO4Fe0.01察氏培养基 CaCl22H2OCa0.25氧化硫酸杆菌培 养液 NaHCO3Na0.1蓝细蓝细 菌培养基 MnCl24H2OMn0.05氧化硫酸杆菌培 养液 （NH4） 6Mo7O244H2O Mo0.01氧化硫酸杆菌培 养液 pH 渗透压和水活度 氧化还原电位 3、物理化学条件适宜: v 细菌: pH7.08.0 v 放线菌：pH7.0 8.5 v 酵母菌: pH3.86.0 v 霉菌： pH4.06.0 pH：微生物有最佳生长pH 微生物在生长过程中培养基pH值可能发生的变化 ： v 在含糖基质上生长,会产酸而使pH下降， v 在分解蛋白质和氨基酸时, 会产NH3而使pH上升， v 以 (NH4)2SO4 作N 源 , 会过剩 SO4 2-, 而使pH下降， v 分解利用阳离子化合物如：NaNO3, 会过剩 Na+ 而使 pH 上升。 维持培养基pH的方法 使用磷酸缓冲剂： K2HPO4 /KH2PO4 采用“备用碱” ：CaCO3 、CaHCO3 采用弱酸盐：柠檬酸盐、乳酸盐等 采用液氨或盐酸 渗透压(osmotic pressure): 高浓度溶液向低浓度溶液渗透时， 其溶质分子所产生的压力。 高渗溶液会导致微生物细胞发生质壁分离 低渗溶液会导致微生物细胞吸水膨胀甚至破裂 水的可利用性 用水活度(water activity, aw)表示 aw：在天然环境中，微生物可实际利用的自由水或游离水含量 。 aw =P/Po P: 溶液的蒸汽压压 Po:纯纯水的蒸汽 压压 水活度需等渗适宜。 微生物适宜生长的aw为0.60.998之间。 在常温常压压下，纯纯水的aw为为1.00 在同温同压压，某溶液的饱饱和蒸汽压压与纯纯水的饱饱和蒸汽压压之比。 溶 液aw 30%葡萄糖溶液0.964 1%葡萄糖+20%甘油0.955 1%葡萄糖+40%蔗糖0.964 饱和氯化钠溶液0.78 饱和氯化钙溶液0.30 饱和氯化镁溶液0.30 饱和氨化锂溶液0.11 几种溶液的水活度值 4、原料来源的选择（经济节约） v 经济节约原则:以粗代精、以废代好、以简代繁 v 原料来源要广泛 v 原料要易处理，处理成本要低 v 原料处理后，废物、废液、废气要少 灭菌处理 高压蒸汽灭菌：1.05kg/cm，1210C，1530min 高温灭菌对营养物质的破坏及pH变化 （二）四种方法 生态模拟 查阅文献 精心设计 实验比较 培养基类型 （一） 依对培养基成分的了解： 天然培养基(complex medium, undefined medium)， 指一些利用动、植物或微生物体或其提取物制成的培 养基，成分未知。如培养细菌所用的肉汤蛋白胨培养 基，培养酵母菌的麦芽汁培养基等。 优点： 取材方便、营养丰富、种类多样、配制方便 组合培养基(defined medium) ，或称合成培养基 (synthetic medium) 是一类按微生物的营养要求精确设计后用多种高纯化 学试剂配制的、各成分（包含微量元素）的量都确切 知道的培养基。如培养细菌所用的葡萄糖铵盐 培养基 ，培养放线菌的淀粉硝酸盐培养基（高氏一号）。 较昂贵，一般用于研究工作（代谢、遗传分析） 。 优点：组份精确、重复性好。 半组合培养基，又称半合成培养基(Semi-defined medium) 是一类主要以化学试剂配制，同时又加有某种或某些天然成 分的培养基。 固体培养基(solid medium)，一般加有凝固剂， 凝固剂含量一般为 12。 作为凝固剂的条件：不被微生物分解利用，生长温度范围内保持固体 状态，凝固点温度对微生物无害，不因灭菌而破坏，透明度好、配制 方便、价格低。常用的为琼琼脂与明胶。 由于固体培养基能提供表面，形成单菌落，因此可用于：菌种分离、 鉴定、保藏等。 液体培养基(liquid medium)，培养基中没有凝固剂。 用途：大量培养微生物，研究生理代谢等。 半固体培养基(semi-solid medium)，凝固剂含量一般约为0.5% , 用途：观察细菌的运动，测定噬菌体效价等。 培养基固化物琼琼脂与明胶的比较较 化学 成分 营养 价值 分解 性 融化 温度 凝固 温度 常用 浓度 透明 度 粘 着 力 耐加 压灭 菌 琼 脂 聚半乳糖 的硫酸酯 无罕见 960C 400C 1.5 2% 高强强 明 胶 蛋白质作氮 源 极易 250C 200C 5 12% 高强弱 EMB(Eosin Methylene Blue)培养基中培养大肠杆菌，因 其强烈分解乳糖而产生大量的混合酸，菌体带H+,故可染 上酸性染料伊红，又因伊红与美蓝结合，使菌落呈深紫色 。从菌落表面反光还可看到绿色金属闪光。而产酸弱的菌 株的菌落呈棕色。不发酵乳酸的菌落无色透明。 鉴别肠道细菌的伊红美蓝乳糖培养基 是为了观察某种糖被分解后是否产生酸的一种培养基 伊红美蓝(EMB,Eosin Methylene Blue)培养基 实验室常用的培养基举例说明 参考书：微生物培养基的制造与应用， 陈天寿主编，中国农业出版社，1995