血清尿素测定.doc

【目的】学习血清尿素(Urea)测定方法，了解其意义。【原理】血清尿素（Urea）是蛋白质的正常代谢产物。它的测定是常用的衡量肾小球功能的指标之一。肾性血清尿素含量增加，提示肾小球损伤。是研究药物肾毒性的重要指标之一。【器材】兔固定架、注射器、烧杯、可见分光光度计、试管、水浴【药品】0.5%氯化高汞溶液、生理盐水【动物】家兔2只【方法】取家兔2只，1只注射氯化高汞5ml/kg（0.5%氯化高汞溶液1.0ml/kg)，另1只注射等量的生理盐水。48小时后，从家兔耳静脉取血1ml，制取血清，按血清尿素测定方法测定血清尿素含量。【结果】记录2只家兔血清尿素含量，比较并分析其差别。附 血清尿素(Urea)测定方法【原理】尿素与二乙酰在酸性反应环境中加热，缩合生成色素原二嗪化合物。因二乙酰不稳定，不宜直接加入，可由化学反应生成。通常由反应系统中二乙酰一肟与强酸作用，产生乙二酰。二乙酰和尿素反应，缩合生成红色的二嗪。根据颜色深浅确定尿素含量的多少。【试剂】(1)酸性试剂：在三角烧瓶中加蒸馏水约100ml，然后加入浓硫酸44ml及85%磷酸66ml。冷至室温，加入硫氨脲50mg及硫酸镉(CdSO48H2O)2g。溶解后用蒸馏水稀释至1L，置棕色瓶中冰箱保存，可稳定6个月。(2)二乙酰-肟溶液：称取二乙酰-肟20g，加蒸馏水约900ml，溶解后，再用蒸馏水稀释至1L，置棕色瓶中，贮放冰箱内可保存半年。(3)尿素标准贮存液（100mmol/L）:称取干燥纯尿素(MW=60.06)0.6g，溶解于蒸馏水中，并稀释至100ml，加0.1g叠氮钠防腐，置冰箱内可稳定半年。(4)尿素标准液应用液(5mmol/L)：取5.0ml贮存液用无氨蒸馏水稀释至100ml.【操作】按表T4-1进行混匀后，置沸水中加热12分钟，置冷水中冷却5分钟后，用分光光度计在波长540nm，以空白管调至零点。比色读取标准管及测定管的吸光度。【计算】【正常参考值】2.868.20mmol/L 尿素【注意事项】1本法线性范围达14 mmol/L 尿素，如遇高于此浓度的标本必须用生理盐水作适当的稀释后重测，然后乘以稀释倍数报告之。2试剂中加入硫氨脲和镉离子，增进显色强度和色泽稳定性，但仍有轻度退色现象(每小时小于5%)。加热显色冷却后应及时比色。3吸管必须校正，使用时务必注意清洁干净，加量务必准确。4世界卫生组织推荐用mmol/L尿素表示浓度，不再使用尿素氮一词。5血清尿素增高的病理因素常见于肾脏原因，肾脏原因又可分为肾性、肾前或肾后：肾性：急性肾小球肾炎、肾病晚期、肾功能衰竭、慢性肾盂肾炎及中毒性肾炎都可见血液中尿素含量增高。肾前或肾后：引起尿量显著减少或尿闭，如脱水、水肿、腹水、循环功能衰竭、尿路结石或前列腺肿大引起的尿路梗阻等均可引起血清尿素含量升高。此外，生理因素也可导致血清尿素增高。如体内蛋白质分解过多：急性传染病、上消化道出血、大面积烧伤、大手术后和甲状腺功能抗进等。虽然血清尿素增高，此时其它肾功能试验结果一般均正常。（注：本法引自中华人民共和国卫生部医政司编著的全国临床检验操作规程）尿素的测定方法可分为两大类：一类直接法，尿素直接和某试剂作用，测定其产物，最常见的为二乙酰一肟法；另一类是尿素酶法，用尿 素酶将尿素变成氨，然后用不同的方法测定氨。 1)尿素酶法（直接法）：尿素酶法利用尿素酶催化尿素水解生成铵盐，铵盐可用纳氏试剂直接显色、酚-次氯酸盐显色或酶偶联反 应显色。尿素测定目前多采用尿素酶偶联法：用尿素酶分解尿素产生氨，氨在谷氨酸脱氢酶的作用下使NADH氧化为NAD+时，通过34 0nm吸光度的降低值可计算出尿素含量。此反应是目前自动生化分析仪上常用的测定原理。此外，尿素酶水解尿素产生氨的速率，也可用电导的方法进行测定，其电导的增加 与氨离子浓度有关，反应只需要很短的时间，适用于自动分析仪。2）酚-次氯酸盐显色法：尿素酶水解尿素生成氨和酚及次氯酸盐，在碱性环境中作用形成对-醌氯亚胺，亚硝基铁氰化钠催化此反 应：对-醌氯亚胺同另一分子的酚作用，形成吲哚酚，它在碱性溶液中产生蓝色的解离型吲哚酚：此反应敏感，血清用量少（10l），无需蛋白沉淀，一般用于手工操作测定中。3)纳氏试剂显色法：尿素经尿素酶作用后生成氨，氨可与纳氏试剂（HgI2.2KI的强碱溶液）作用，生成棕黄色的碘化双汞铵。尿素酶法的优点是反应专一，特异性强，不受尿素类似物的影响，缺点是操作费时，且受体液中氨的影响。二乙酰一肟法（直接法）：尿素可与二乙酰作用，在强酸加热的条件下，生成粉红色的二嗪化合物（Fearom反应），在54 0nm比色，其颜色强度与尿素含量成正比。二乙酰不稳定，用二乙酰一肟代替，后者遇酸水解成二乙酰。 试剂中加入Fe3+或Cd2+及硫氨脲，可提高灵敏度，增加显色稳定性，其中Fe3+和Cd2+有氧化作用，还能消除羟胺的 干扰作用。提高酸的浓度可增加灵敏度。二乙酰一肟与尿素的反应不是专一的，与瓜氨酸也有显色。本法灵敏、简单，产生的颜色稳定， 缺点是加热时有异味释放，一般临床已很少使用此方法。尿素测定用血清或血浆，体液中尿素的浓度常用尿素中含有的氮来表示，称