RNA的生物合成 转录.ppt

第 十 一 章 RNA的生物合成 RNA Biosynthesis 1 l转录 (transcription)：以DNA为模板指导合 成RNA的过程。是RNA合成的主要方式。 lRNA复制(RNA replication):以RNA为模板指 导合成RNA的过程。主要见于除逆转录病 毒以外的RNA病毒。 RNA生物合成有两种方式 2 转录 (transcription) 生物体以DNA为模板指导合成RNA的过程。 转 录 RNADNA 3 lmRNA(messenger RNA) 把遗传信息从DNA中转录出来，作为蛋 白质合成的直接模板。 ltRNA(transfer RNA ) 各种氨基酸的载体并以其反密码子识 别mRNA上的密码子。 lrRNA（ribosomal RNA） 与蛋白质共同构成核糖体，做为蛋白 质合成场所。 转录主要产物 4 参与转录的物质 l原料: NTP (ATP, GTP, CTP ,UTP) l模板: 基因区的DNA单链 l酶: DNA依赖的RNA聚合酶 (DNA-dependent RNA polymerase, RNA-pol) l其他蛋白质因子 5 一、转录模板 RNA的转录为不对称转录(asymmetric transcription)，有两方面含义： l在DNA双链分子上，对于某基因，一股 链可转录（模板链），另一股链不转录 （编码链）。 l模板链并非永远在同一单链上。 第一节 原核生物转录的模板和酶 6 5 3 3 5 模板链编码链 编码链模板链 结构基因 转录方向 转录方向 转录中RNA生成的方向是53方向延长， 模板链为35方向。 7 l模板链(template strand) 按照碱基配对原则指导转录生成RNA的 DNA单链。又称有意义链、Watson链。 l编码链（coding strand) 模板链的互补链。又称反意义链、Crick链 。其碱基序列与mRNA一致，若以U代替T 。文献中刊出的基因序列为编码链。 8 5GCAGTACATGTC 3 3 c g t g a t g t a c a g 5 5GCAGUACAUGUC 3 NAla Val His Val C 编码链 模板链 mRNA 蛋白质 转录 翻译 9 亚基（因子） 核心酶2 全酶 2 大肠杆菌(E.coli)的RNA聚合酶： 二、原核生物的RNA聚合酶 10 核心酶 (core enzyme)全酶 (holoenzyme) 11 l亚基：功能是辨认转录起始点。 l2称核心酶(core enzyme)：催 化NTP按模板的指引合成RNA。转录延 长阶段仅需核心酶。 l全酶(holoenzyme)：转录起始时需全酶 。 12 启动子（启动序列） 操纵序列 结构基因（几个） 操纵子 其他调节序列 调控序列 原核生物基因转录模式：操纵子模式 三、模板与酶的辨认结合 操纵子：每一转录区段可视为一个转录 单位，称为操纵子。 13 结构基因 （编码序列） 启动子启动子 操纵序列操纵序列 其他调节序列其他调节序列 ( (promoterpromoter) ) ( (operatoroperator) ) 原核生物操纵子（operon） 启动子(promoter)是转录起始时RNA聚合 酶结合模板DNA的部位。 14 原核生物启动子（RNA聚合酶保护区） l约4060bp大小。以结构基因第一个碱基 为1，以负数表示基因上游，在启动子 的35区和10区存在保守序列或一致性 序列。 l35区的一致性序列是TTGACA，是转录 起始的辨认位点，由因子辨认结合。 l10区是TATAAT，也称Pribnow盒，与 RNApol有较牢固的结合。 15 开始转录 T T G A C A A A C T G T -35 区 (Pribnow box) T A T A A T Pu A T A T T A Py -10 区 1-30-5010-10-40-20 5 3 3 5 原核生物启动子保守序列 RNA-pol辨认位点 5 5 RNA聚合酶保护区 结构基因 3 3 16 原核生物启动子结构原核生物启动子结构 RNA转录起始 -35区-10区 TTGACATTAACT TTTACATATGAT TTTACATATGTT TTGATATATAAT CTGACGTACTGT N17 N16 N17 N16 N16 N7 N7 N6 N7 N6 A A A A A trp tRNAtrp lac recA Ara TTGACATTGACA TATAATTATAAT 共有序列 X/45 38 36 29 37 37 28 40 25 30 41 29 44 17 转录过程 转录起始 转录延长 转录终止 第二节 原核生物的转录过程 18 1.因子辨认转录起始点,全酶与之结合。 因子辨认结合启动子35区的 TTGACA序列。 2.全酶随即移向10区的TATAAT序列并 跨入转录起始区。 一、转录起始 19 3.解开局部双链，在RNA-pol催化下，生成RNA 第一个3,5磷酸二酯键，形成转录起始复合 物。 RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH3 转录生成的RNA的第一位，即 5端总是GTP 或ATP，以GTP更为常见。 4.因子即从转录复合物上脱落，转录起始结 束。 20 (NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi 二、转录延长 1.因子脱落后，在核心酶作用下，以 NTP为底物，按照碱基配对原则（与 DNA单链模板：C-G, A-U, T-A)，逐 个生成3,5磷酸二酯键，延长RNA 链。 21 2.酶是沿着模板链的35方向，转 录产物是从53延长。 3.转录空泡(transcription bubble)亦 称转录复合物，包括：核心酶、 DNA模板和转录产物。 4.在DNA模板上多个转录同时进行， 转录的mRNA上多聚核糖体翻译。 22 转录空泡(transcription bubble)： RNA-pol （核心酶） DNA RNA 23 5 3 DNA 原核生物转录过程中的羽毛状现象 核糖体 RNA RNA聚合酶 24 三、 转录终止 有依赖因子（Rho）与非依赖因子转 录终止两类 1.依赖因子的转录终止 因子由相同的6个亚基组成的六聚体 蛋白质。 因子可与RNA 3端polyC结合 ，有ATP酶活性和解螺旋酶的活性。 25 作用机制： RNA转录接近终点时，3末端出现 polyC ，因子与polyC结合，因子和 RNA聚合酶发生构象变化，RNA聚合 酶停顿。 因子ATP酶活性和解螺旋酶的活性 使DNA:RNA杂化双链拆离，RNA从 转录复合物中释放。 26 A T P 依赖因子的转录终止 27 2、非依赖因子的转录终止 结构：接近终止转录区，RNA转录产物 3-末端有若干个连续的U,在此之前的部 分碱基可形成鼓槌状的茎环结构(stem- loop)或发夹结构(hairpin)。 28 5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3 5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3 RNA UUUU. UUUU. 5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGCCUUUUUAGGCACCAGCCUUUUU. 3 茎环(stem-loop)/发夹(hairpin)结构 29 机理：茎环结构在RNA末端形成， 改变RNA聚合酶的构象，使转录停顿 。通过茎环结构与RNA聚合酶及DNA 的相互作用，使RNA解离出来，转录 终止。 30 茎环结构使转录终止的机理 5pppG 5 3 3 5 RNA-pol 31 一、真核生物的RNA聚合酶 RNA-pol RNA-pol RNA-pol RNA 聚合酶 真核生物RNA聚合酶比原核生物复杂，其 都有两个不同的大亚基和十几个小亚基。 第三节 真核生物RNA的生物合成 32 真核生物RNA聚合酶特性与催化产物 种类 转录产物45S-rRNAhnRNA5S-rRNA, tRNA, snRNA 加工产物18S-rRNA 28S-rRNA 5.8S-rRNA mRNA同上 鹅膏蕈碱 反应 耐受极敏感中度敏感 33 lhnRNA(杂化核RNA，hetero-nuclear RNA)： 经加工生成mRNA lsnRNA(核内小RNA, small nuclear RNA) ： 有多种，由100-300核苷酸组成，参与 RNA的剪接过程。 34 启动子 增强子 沉默子 TATA盒（Hogness盒） CAAT盒 GC盒 顺式作用元件 二、真核生物转录起始 真核生物转录模式：顺式作用元件+结构基因 35 转录起始点 TATA盒 CAAT盒 GC盒 增强子或 沉默子 真核生物转录模式 AATAAA 切离加尾 转录终止点 修饰点 外显子 翻译起始点 内 含 子 36 （一）顺式作用元件（Cis-acting element） l概念：是指可影响自身基因表达活性的 DNA序列。可位于结构基因两侧，多 见于上游，包括启动子、增强子和沉默 子。 37 53 调控序列TATA盒Inr YYAN YY T A -30+1 TATAAA l启动子：保守序列常见有: TATA盒（Hogness盒，TATAAAA） CAAT盒 (GCCAAT) GC盒(GGGCGG) 某些启动子具有位于转录起始点附近 的 保守序列，称为起始子(initiator, Inr)。 38 l启动子保守序列可结合不同的转录因 子，参与转录起始。 TATA盒常是启动 子的核心序列，可结合TBP(TATA binding protein，TATA结合蛋白)。 l转录起始时，多种转录因子结合于启 动子，真核RNA-pol通过转录因子间接 与启动子结合，与原核RNA-pol不同。 39 l增强子(enhancer)：是远离转录起始点， 具有增强启动子转录活性的DNA序列。其 可与增强子结合蛋白EBP(enhance binding protein)结合，促进转录。 l沉默子(silencer)：是远离转录起始点， 可抑制基因转录的DNA序列。其可与转录 抑制因子（transcription inhibitor）结合， 抑制转录。 40 （二）转录因子(transcriptional factor) l反式作用因子(trans-acting factor) 某一基因表达的蛋白质间接或直接 作用于另一基因的顺式作用元件， 此类蛋白质称为反式作用因子。 41 （二）转录因子(transcriptional factor) l转录因子(transcriptional factors, TF) 反式作用因子中，直接或间接结合 RNA聚合酶者称为转录因子。 转录因子 基本转录因子 转录激活因子 特异转录因子 转录抑制因子 42 l TFIID由两类亚基组成 TBP(TATA binding protein，TATA结合蛋白) TAF(TBP associated factors，TBP辅助因子) l基本转录因子 是RNA聚合酶结合启动子所必需的一组蛋 白质因子，决定RNA的类别。 相应于RNA-pol、，分别称为TFI、 TFII、TFIII。 TFII又分为TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、 TFIIF、TFIIH等。 43 参与RNA-pol转录的TF 44 (三)转录起始前复合物 l真核生物转录起始首先形成转录起始前 复合物（pre-initiation complex, PIC） 。 l TFII-D通过TBP结合TATA盒为核心，其 他TFII逐步加入，与RNA-pol、启动 子共同形成PIC。 45 pol TFHTFE TFF TAFTAF TFA TFB TBP DNATATA 转录起始前复合物 （pre-initiation complex, PIC） 46 （四）转录起始复合物 转录起始前复合物PIC形成后，在迂 回折叠DNA构象中，增强子结合蛋白 EBP（enhance binding protein）结合增强 子,同时与TFD中的TAF结合，最后形 成转录起始复合物，启动转录。 47 pol TFHTFE TFF TAFTAF TFA TFB TBP DNATATA EBP 真核生物转录起始复合物 48 三、转录延长 l真核生物转录延长过程与原核生物大致 相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻 译同步的现象。 l RNA-pol前移处处都遇上核小体。 l转录延长过程中可以观察到核小体移位 和解聚现象。 49 RNA-Pol RNA-Pol RNA-Pol 核小体 转 录 延 长 中 的 核 小 体 移 位 转录方向 50 四、转录终止 l基因读码框架下游，常有共同序列 AATAAA（编码链），再下游有多个GT 序列，两者之间为转录终止的修饰点。 l转录越过修饰点，mRNA在修饰点处被切 断，随即加入polyA尾及5-帽子结构。 l RNA酶将余下的RNA降解，解螺旋酶和 释放酶帮助终止转录。 51 5-AAUAAA- 5 -AAUAAA- 核酸酶 -GUGUGUG RNA-pol AATAAA GTGTGTG 转录终止的修饰点 5 5 3 3 3切断并加尾 AAAAAAA 3 mRNA 转录中 mRNA 解螺旋酶和释放酶 转录终止过程 52 原核生物转录生成的RNA一般不需 加工即可使用，真核生物转录生成的 RNA必须经加工后才能使用。 第四节 真核生物RNA加工 53 真核生物结构基因转录初产物为hnRNA ，需加工才能成为成熟的mRNA。 l 5-端形成帽子结构 l 3-端加polyA尾巴 l 内部剪接 lmRNA的编辑 一、真核生物mRNA转录后加工 54 （一） 5端形成帽子结构 l形成过程：转录生成的hnRNA经与GTP反 应，生成三磷酸双鸟苷(GpppG-)，再将第 1或第2个G碱基7位N甲基化，形成帽子结 构(7-甲基鸟嘌呤三磷酸核苷,mGpppG- 或 GpppmG-)。 l帽子结构功能：使mRNA免遭核酸酶的攻 击；与翻译起始有关。 55 5 pppGp 5 GpppGp pppG ppi 鸟苷酸 转移酶 5 mGpppGp 甲基化酶 SAM 帽 子 结 构 的 生 成 5 ppGp 磷酸酶 Pi （5 GpppmGp） 56 帽子结构 5 mGpppGp 57 （二） 3端加polyA尾巴 l形成过程：转录越过修饰点后， mRNA 在修饰点处被切断，加入polyA尾巴。此 过程有多种因子和酶参加。 l功能：维持mRNA 作为翻译模板的活性 以及增加mRNA 本身稳定性。 58 1. hnRNA和断裂基因 lhnRNA：结构基因的初级转录产物，加工 修饰后形成mRNA。hnRNA较成熟mRNA大 几倍甚至数十倍。 l断裂基因(split gene) ：真核结构基因，由 若干个编码区（外显子）和非编码区（内含 子）互相间隔但又连续而成，转录后去除内 含子再连接，故称断裂基因。 (三) 内部剪接 59 2、外显子和内含子 l外显子(exon):在断裂基因及其初级转 录产物上出现，并表达为成熟RNA的核 酸序列（编码区）。 l内含子(intron) ：隔断基因线形表达而 在剪接过程中被除去的核酸序列（非编 码区）。 60 鸡卵清蛋白 断裂基因 hnRNA 首、尾修饰 hnRNA剪接 成熟的mRNA 61 3、mRNA的剪接（splicing) lsnRNA：分子中U碱基最丰富，故以U分 类命名，有5种：U1、U2、U4、U5、U6。 lsnRNP：5种snRNA和蛋白质组成5种小分 子核糖核蛋白snRNP，参与mRNA剪接。 l剪接：去除初级转录产物中的内含子，把 外显子连接为成熟的RNA。采用套索剪接 ，发生在核内。 62 l剪接体： mRNA的剪接在剪接体上进行。 剪接体由5种snRNP（U1U6 snRNP）组成 。 l剪接体形成：大多数内含子结构为5- GUAG-3。首先是U1 、U2 snRNP的U1 、 U2 与内含子边界序列结合， U4 、U5 、U6 snRNP加入，形成剪接体。 63 snRNP的U1 、U2 snRNA与内含子结合 64 UACUACA - AG UG U4 U5 U6 E1 E2 U1U2 剪接体的形成 65 l剪接体催化中心：剪接体释放U1 、U4 、U5 后，U2 和U6 形成剪接体 催化中心。此时，内含子弯曲成套 索状，上下游外显子靠近。 66 UACUACA - AG UGU6 E1 E2 U1、U4、U5 UACUACA - AG UG U4 U5 U6 E1 E2 U1U2 催化中心的形成 U2 67 l剪接过程：在剪接体催化中心，发生两次 转酯反应。 第一次转酯反应：含鸟苷酸pG、ppG或pppG 的辅酶，以3-OH对E1/I之间的磷酸二酯键作 亲电子攻击，使共价键断开。 第二次转酯反应： 由E1的3-OH对I/E2之间 的磷酸二酯键作亲电子攻击，使其断开，2 个外显子相连而内含子被切除。 68 pG-OH (ppG-OH, pppG-OH) GU-OH AGpUpGpA 第一次转酯反应 第二次转酯反应 GUpAAGpU 外显子1 内含子 外显子2 AG-OH GUpU pGpA 69 lmRNA的剪切（cleavage) 是mRNA前体剪去 某些内含子，在上游的外显子3-端直接加 polyA。剪切是某些mRNA的加工方式。 l剪切和剪接两种加工方式有时共用于某些 mRNA的转录后加工。 （参见书图11-23/24） 4、mRNA的剪切（cleavage) 70 肠粘膜细胞有特异的胞嘧啶核苷脱氨酶，可与apoB 基因转录的mRNA上第2153密码子CAA结合,将其C转 变为U,使CAA变为终止密码子UAA,终止翻译。 （四） mRNA的编辑(mRNA editing) 人类apo B基因 mRNA（14500个核苷酸） 肝脏a