HPLC高效液相色谱技巧.ppt

SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 如何用好HPLC 得到好结果的技巧! SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 流动相 缓冲液 / 溶剂选择, 梯度优化, 流速选择 脱气，流速稳定, 流动相制备 柱 高柱效, 二级作用力, 柱间变异, 温度控制 检测 灵敏度, 选择性, 温度波动影响 样品 提取方法选择, 样品溶剂选择, 氧气影响 仪器 性能, 稳定性, 耐用性, 易操作性 综合评估 分析技术的稳定性,可靠性, 定量准确性 HPLC如何得到好的结果 SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 流动相 溶剂混和率及其制备 (1) 下面的两种配制一样吗? 水 / 乙醇= 1/1 (v/v) 50%(v/v) 乙醇水溶液 * 混和有机溶剂时注意体积变化 混和液的密度不是两种溶剂密度的简单相加. 25C 时，50mL 水和50ml乙醇混和, 最终体积为 96ml. SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 水/乙醇=1/1 (v/v) 分别量取500ml水和乙醇 , 然后混和 混和体积不是 1L. 50%(v/v) 乙醇水溶液. 加500ml乙醇于1L的容量瓶中, 加水至刻度. 水的比例更高. 1L WaterEthanol Ethanol Water 流动相 溶剂混和率及其制备 (2) SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 流动相 A: 20mM 磷酸 (Na) 缓冲液 / 乙腈= 9 / 1 (v/v) 流动相 B: 10%(v/v) 乙腈/ 20mM 磷酸缓冲液 1 2 3 31 A B 2 Peaks 1: acetaminophen 2: dihydrocodeine 3: caffeine 0246810 min Column:Shim-Pack VP-ODS (150mmL. x 4.6mmI.D.) Flow rate :1mL/min Temp. :40C Detection :UV-VIS (210nm) 流动相 溶剂混和率及其制备 (3) SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 配制: 20mM 磷酸缓冲液 (pH2.5) 流动相 缓冲液比例及其制备 (1) A : “20mM” 表示 磷酸浓度 加10mmol 磷酸和 10mmol 磷酸二氢钠, 溶解于 1L水中 B : “20mM” 表示 钠浓度 溶解 20mmol 磷酸二氢钠于1L 水中, 加磷酸调 pH 至 2.5 C : “20mM” 表示 磷酸和钠的浓度, 用高氯酸调节pH 溶解20mmol 磷酸二氢钠于 1L 水中,用高氯酸调节pH 至 2.5 SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 Column:Shim-Pack VP-ODS (150mmL. x 4.6mmI.D.) Flow rate :1mL/min Temp. :40C Detection :UV-VIS (210nm) 流动相 A: 磷酸浓度为 20mM 流动相 B: 钠浓度为 20mM 流动相 C: 磷酸，钠浓度均为 20mM, 用高氯酸调节pH 流动相 缓冲液比例及其制备 (2) min 1 2 3 31 A B 2 Peaks 1: acetaminophen 2: dihydrocodeine 3: caffeine 02468 10 C 3 1, 2 不一样的解释 Dihyrocodeine 出峰位置不一 样 SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 流动相缓冲能力弱 pKa 与流动相pH相近的酸和碱的峰形 变差. Column : STR ODS-II (150mmL. x 4.6mm I.D.) Mobile : 20mM buffer solution (pH 4.5) phase / acetonitrile (3/1, v/v) Flow rate: 1mL/min Temp.: 40C Detection: UV-VIS (240nm) 左图: 柠檬酸缓冲液pH( 4.5) 作流动相 右图: 磷酸缓冲液 (pH 4.5) 作流动相 流动相 pH 缓冲能力和 峰形 SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 吸光度 HPLC 级的乙腈在 UV低波长有很低的吸收 HPLC级的乙腈适用于 UV低波长下高灵敏度的分析! 柱压 乙腈更低. 相同流速下, 引起的柱压更低. 洗脱能力 乙腈更强. 一些化合物甲醇容易洗脱. ( 胡萝卜素,胆固醇) 选择性 不同. 峰形 不同. 聚合物基底的柱子, 乙腈更好. 流动相脱气效率 与水混和时要注意 甲醇 发热 气体溢出 乙腈 吸热 气体溶解 流动相 甲醇和乙腈的不同 SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 保留时间改变 峰面积改变 定量错误! 对绝对量响应的检测器 流速不影响峰面积. 对浓度响应的检测器 流速影响峰面积. *几乎所有的 LC 检测器均为浓度型检测器 流动相 流速变化的影响 (1) SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 1.009729145912886547n-butylparaben 1.009826520872626362n-propylparaben 1.009627710872744605ethylparaben 1.009539382133901107methylparaben B/AB (0.99mL/min)A (1.00mL/min) 面积比峰面积 Column : Shim-Pack VP-ODS (150mm L. x 4.6mm I.D.) Mobile phase : methanol / water = 6/4 (v/v) Flow rate: A ; 1.00mL/min B ; 0.99mL/min Temperature : 40C Detection: UV-VIS (260nm) 流动相 流速变化的影响 (2) SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 两台泵进行混和时 A B A : 一台泵输送预先混和好溶剂 B : 两台泵分别输送两种溶剂并混和 Peaks 1: methylparaben 2: ethylparaben 3: propylparaben 1 2 3 流动相 高压梯度时流速变化的影响 (1) 保留时间和预先混和好的溶剂不同 SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 1.01330752593035538n-butylparaben 1.01327971802761054n-propylparaben 1.01329225562885602ethylparaben 1.01341518764100127methylparaben B/ABA 面积比峰面积 Column : Shim-Pack VP-ODS (150mmL. x 4.6mm I.D.) Mobile phase : methanol / water (6/4, vol/vol) Flow rate: 1.00mL/min Temperature: 40C Detection: UV-VIS (260nm) 流动相 高压梯度时流速变化的影响 (1) A : 一台泵输送预先混和好溶剂 B : 两台泵分别输送两种溶剂并混和 SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 气泡出现的原因 当溶解的空气超过空气的溶解度时. 原因: 溶剂温度升高, 压力降低, 溶剂混和等. 气泡可能引起的问题 流动相, 泵 保留时间波动, 流动相流量不稳定 柱 峰变形, 柱效降低 检测器 产生噪声 解决方法: 离线和在线脱气 然而, 问题不仅由于气泡引起, 而且由于溶解的空气引起. 流动相 流动相中的气泡引起的问题 SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 荧光检测器 氧气引起荧光猝灭 改变峰面积 吸光型检测器 改变背景吸收 基线波动 (特别是在梯度洗脱时) 氧气吸收峰出现 示差折光检测器 基线波动 流动相 流动相中的空气对检测器的影响 SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 Degassed Not degassed * 荧光检测器分析bisphenol A 脱气 : 氦脱气 流动相 荧光检测中脱气的影响 (1) 流动相脱气可能影响荧光检测的灵敏度. SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 脱气时间对气液半透膜 脱气效果的影响. 0 1 2 3 4 5 0102030405060 脱气开始时间 (min) Peak Area Value (106) Degasser OFF Degasser ON Column : Shim-Pack VP-ODS (150mm L x 4.6mm I.D.) Mobile Phase: acetonitrile/H2O = 4/1 (v/v) Flow rate : 1mL/min Temperature : 40C Analyte : Pyrene Detection : Fluorescence (Ex 310nm, Em 390nm) Degassing:Gas-liq. separation membrane 流动相 荧光检测中脱气的影响 (2) SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 甲醇吸收光谱图 如果溶解的氧气浓度高， 有机溶剂的吸光度液也高. 在短波长区影响更为明显. 流动相 UV 检测器的背景变化 饱和空气 脱气 SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 进流动相引起出峰!? 流动相 溶解的空气引起UV检测器的出峰 Detection: UV- 210nm 流动相和样品溶剂中溶解气体量不同引起出峰 流动相脱气 流动相没脱气 Oxygen bubbling Air saturation He bubbling Oxygen bubbling Air saturation He bubbling SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 放大 流动相 溶解空气引起的RID检测器出峰 Column : SCR-101C Mobile phase : Water Flow rate : 0.5mL/min Temperature : 85C Detection : RID detector Degasser : Gas-liq. Membrane Separ. (DGU-14A) Sample : 0.5% mannitol 流动相和样品溶剂中溶解气体量 不同引起出峰. SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 一般, 环境温度影响光谱图的形状. 波长 高温下的光谱图 由于温度变化引起的吸光度差异 低温下的光谱图 吸光度 检测 UV 检测器池温度的影响 (1) SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 不控制温度时峰面积比较 (34C) 0.9680.985p-toluic acid 0.9860.991Benzoic acid 0.9910.994Phenol 50C40C 与 34C时的峰面积比 Column : Shim-Pack VP-ODS (150mm L. x 4.6mm I.D.) Mobile phase : 10mM acetic acid (sodium) buffer solution (pH 4.5) / Methanol = 7/3, (v/v) Flow rate : 1mL/min Temperature : 40C Detection : UV-VIS (260nm) 检测 UV 检测器池温度的影响 (2) SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 无温度控制 (RF-10AXLsuper) 2025C 面积降低了13.5% 2025C 面积降低了2.2% 检测 池温度对荧光检测器的影响 (1) 正常情况下, 温度越高, 荧光灵敏度越低. 氮蒽分析结果(温度对荧光灵敏度的影响) 无温度控制 (RF-10AXL) SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 0.779110171185514LEU 0.7711266831457340ILE 0.777900131026839MET 0.7812260421565440VAL 0.78138426177078CYS 0.7712035291558560ALA 0.7919249002440772GLY 0.86436522505373PRO 0.7710177681315462GLU 0.7712042731570743SER 0.7711439251478447THR 0.7811657571500427ASP 40C20C 面积比 A40/A20 峰面积 面积比 A40/A20 峰面积 40C20C 0.768391831105530ARG 0.69336837487433LYS 0.7914316651819675HIS 0.769958321315479PHE 0.748509761156850TYR 仪器:Shimadzu 氨基酸分析系统 (用OPA作柱后衍生) 检测:RF-10AXL Super (Ex 350nm, Em 450nm) (池温度 ; 20C, 40C) 检测 池温度对荧光检测器的影响 (2) SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 Bisphenol A 在各种溶剂中的荧光光谱 (激发波长 270nm, 使用背景校正) 检测 溶剂对荧光灵敏度的影响 甲醇 乙腈 波长 SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 不冷却时, 抗坏血酸逐渐降解. 柱 :SCR-101N (250mmL. x 7.9mm I.D.) 流动相 :10mM 草酸钠缓冲液 (pH 3.8) ，含有 1mM EDTA2Na 流速: 1mL/min 温度 : 40C 检测: UV-VIS (245nm) 抗坏血酸峰面积的变化 样品 冷却可以防止样品降解 冷却 未冷却 SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 样品 样品溶剂对峰形的影响 (1) 流路方向 甲醇溶剂 被分析物 流路方向 水溶剂 被分析物 *水 /甲醇作流动相的反相色谱 不同样品溶剂对理论塔板数的 影响. 水溶剂 甲醇/ H2O 甲醇溶剂 样品: 10ul 咖啡因 柱: Shim-pack CLC-ODS (150mmL. x 6mm I.D.) 流动相: 甲醇 / H2O =3/7 流速: 1mL/min 温度 : 室温. 检测: 270nm 理 论 塔 板 数 进样体积 SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 左图. : 样品溶剂 水 / 乙腈 = 3/1 (v/v) 右图.: 样品溶剂 - 乙腈 Column : STR ODS-II (150mm L. x 4.6mm I.D.) Mobile : 20mM citric acid (sodium) buffer Phase : solution (pH 4.5) / acetonitile = 3/1 ( v/v) Flow rate : 1mL/min Temp. : 40C Detection : UV-VIS (240nm) 样品 样品溶剂对峰形的影响 (2) 如果样品溶剂比流动相强 , 峰形恶化. SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 提高分析的准确度 离线前处理很难保证完全一致, 可能降低准确度 简化操作 离线处理需要很强的技能 提高处理效率 晚上也能进行自动前处理, 可以极大的提高处理效率 样品 自动样品前处理的优点 SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 样品 HPLC柱切换系统 血样直接进样 (Co-Sense for BA) 泵 分析柱 自动进样 反相内表面预处理柱 Shim-Pack MAYI-ODS 泵 检测器 流动相 流动相 稀释流路 多聚体，例如蛋白 药物 膜 药物和内表面示意图 SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 08.517 Time (min) 蛋白蛋白 异丙基异丙基肾肾肾肾上腺素上腺素 进样体积 : 100L 流动相 (进样路) : 0.1% 磷酸 /乙腈 = 95/5 (v/v) 检测 : 异丙基肾上腺素；275nm 血浆基质；280nm 样品 用 Co-Sense对生物样品分析进行自动样品前处理 添加了异丙基肾肾上腺素的血浆分析 SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 血浆中分别添加 2mg/mL ketoprofen 和naproxen 的回收率比较(50mL进样.) 手动预处理 (添加乙腈) 用Co-Sense进行自动预处理 样品 不同预处理方法的回收率比较 SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 原因: 由于离子作用力或 配位异构力引起的对 金属离子的 吸附(离子或者碱性化合物) 清除吸附的化合物 （洗针） 控制吸附产生 （使针惰性化） 原因: 由于树脂氢键力引起的吸附 (脂溶性化合物) 使用有机溶剂清洗转子密封槽 改变转子密封材料来降低吸附 样品 过载的原因及控制 使用自动进样器时交叉污染的原因及控制手段 SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 清洗此表面是重要的 针 清洗状态进样状态 样品环 泵 柱 洗针口 针 针密封 样品 洗针机理 (全量进样) SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 若控制由于离子作用力或 配位异构力引起的对 金属 离子的吸附(离子或者碱性化合物) 酸化. 大浓度的配位离子作离子对试剂. (例如) 100mM 高氯酸水溶液 / 甲醇(或乙腈) 由于疏水作用力引起的化合物吸附 ( 树脂型 化合物) 有机溶剂清洗. * (例如) 100% 甲醇, 乙腈, THF等. 样品 洗针溶剂的选择 SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 被分析物 : 氯乙醇 (碱基化合物) 进 2L 的标准溶液 (含有 1.2mg/ml 溶解化合物的流动相), 连续注射 2L 的流动相, 比较面积. 柱 ：Shim-pack VP-ODS (150mmL.x 2.0mm I.D.) 流动相 ：含有100mMNaClO4的 10mM 磷酸缓冲液 (pH 2.6) / 乙腈 = 55 / 45 (v/v) 流速 ：0.2mL/min 温度 ：40C 检测 ：UV (260nm，using semi micro cell) 样品 降低由于碱性物质引起的交叉污染 (1) 0.04250.0004251W/O Wash 0.07300.0007301W/ Wash 空白标准溶液 交叉污染% 相对峰面积针密封: SUS 清洗液: 流动相 洗针程序 : 1.在洗针口浸洗 3 sec. 2.吸样品液. 3.在洗针口浸洗 3 sec. 4.进样. SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 不同惰性化SUS针密封方法的比较 0.00230.0000231特富龙涂层 0.04250.0004251SUS 0.00090.0000091特殊的金属涂层 0.00210.0000211PEEK 涂层 Blank Standard Solution 交叉污染 % 相对面积 浸入洗液 3 sec. 其他条件同上页相同. 样品 降低由于碱性物质引起的交叉污染 (2) SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 进 2L 流动相的色谱图 样品 降低由于碱性物质引