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第七章第七章 酶分析法酶分析法 第一节第一节 酶分析法的基本知识酶分析法的基本知识 第二节第二节 酶活力的测定酶活力的测定 第三节第三节 酶法分析酶法分析 第四节第四节 酶循环分析法酶循环分析法 第五节第五节 固定化酶在酶分析中的应用固定化酶在酶分析中的应用 第一节第一节 酶分析法的基本知识酶分析法的基本知识 1.1 1.1 酶分析法的两种类型酶分析法的两种类型 1.2 1.2 酶分析法的特征酶分析法的特征 1.3 1.3 酶分析法的意义酶分析法的意义 蛋白质属性的酶是高效、高度专一的生物蛋白质属性的酶是高效、高度专一的生物 催化剂，它和生命活动密切相关。因此，催化剂，它和生命活动密切相关。因此， 酶学在生产实践基础理论研究方面，都起酶学在生产实践基础理论研究方面，都起 着非常重要的作用。着非常重要的作用。 酶分析法则是其中的重要内容，也是目前酶分析法则是其中的重要内容，也是目前 发展较为迅速的一个领域。发展较为迅速的一个领域。 酶的选择性及其在低浓度下能催化底物反酶的选择性及其在低浓度下能催化底物反 应的能力，对化学分析有很大的用处。酶应的能力，对化学分析有很大的用处。酶 的催化反应早已用于底物、激活剂、抑制的催化反应早已用于底物、激活剂、抑制 剂以及酶本身的测定。剂以及酶本身的测定。 在在1919世纪中叶已采用酶法来测定糖类。世纪中叶已采用酶法来测定糖类。 2020世纪世纪4040年代初，年代初，WarburgWarburg提出基于使辅提出基于使辅 酶还原而用光度法来测量酶还原而用光度法来测量NADNAD和和NADPNADP的方的方 法。法。 最新的发展是电化学法与荧光法的应用。最新的发展是电化学法与荧光法的应用。 酶分析法已成为一项公认的分析技术。酶分析法已成为一项公认的分析技术。 1.1 1.1 酶分析法的两种类型酶分析法的两种类型 一种是以酶作为分析对象，根据需要对样品进行一种是以酶作为分析对象，根据需要对样品进行 酶含量或活力的测定，通常称为酶含量或活力的测定，通常称为“ “酶活力测定酶活力测定” ”。 另一种是以酶作为分析试剂，用以测定样品中用另一种是以酶作为分析试剂，用以测定样品中用 一般化学方法难于检测的物质，如酶的底物、抑一般化学方法难于检测的物质，如酶的底物、抑 制剂、活化剂和辅因子等，一般称为制剂、活化剂和辅因子等，一般称为“ “酶法分析酶法分析” ” 。 两者检测的对象虽有所不同，但原理和方法都是两者检测的对象虽有所不同，但原理和方法都是 以酶能专一而高效地催化化学反应为基础，通过以酶能专一而高效地催化化学反应为基础，通过 酶反应速度的测定来检测相应物质的含量。并且酶反应速度的测定来检测相应物质的含量。并且 都需要选择适宜的反应条件和测定方法。都需要选择适宜的反应条件和测定方法。 1.2 1.2 酶分析法的特征酶分析法的特征 选择性高。原则上讲，一种酶只催化一种反应，选择性高。原则上讲，一种酶只催化一种反应， 或者说只能催化某种特定的化合物或对特定的化或者说只能催化某种特定的化合物或对特定的化 学键起作用。这是由酶本身的高度专一性作用的学键起作用。这是由酶本身的高度专一性作用的 特点所决定的。特点所决定的。 灵敏度高。一般可测到灵敏度高。一般可测到1010-7 -7mol/L mol/L。如果与荧光法。如果与荧光法 联用，可高达联用，可高达1010-9 -9mol/L mol/L左右。左右。 反应速度快，条件温和。大多数酶促反应在反应速度快，条件温和。大多数酶促反应在3030分分 钟以内可以完成。反应条件很温和，如在常温、钟以内可以完成。反应条件很温和，如在常温、 常压和常压和pHpH近中性的条件下，反应速度很快。近中性的条件下，反应速度很快。 酶用量甚微，所以比较经济。酶用量甚微，所以比较经济。 精确度一般。主要源于微量吸管误差，如精确度一般。主要源于微量吸管误差，如1ul1ul以下以下 的量，取样误差较大。同时也与组合方式有关。的量，取样误差较大。同时也与组合方式有关。 适用范围有一定局限性。适用范围有一定局限性。 只限于酶、底物、辅酶只限于酶、底物、辅酶 、活化剂或抑制剂的测定。、活化剂或抑制剂的测定。 简便程度较差。必须具有酶学知识的操作训练，简便程度较差。必须具有酶学知识的操作训练， 通常要求尽量减少人为误差，尽可能使所有反应体通常要求尽量减少人为误差，尽可能使所有反应体 系条件一致。系条件一致。如加样量、温度、反应时间等都要求比较如加样量、温度、反应时间等都要求比较 准确。最适反应条件准确。最适反应条件( (如温度、如温度、pHpH等等) )的确定很重要，一个的确定很重要，一个 熟练的酶学工作者，会考虑各种因素，设计的实验比较合熟练的酶学工作者，会考虑各种因素，设计的实验比较合 理，而且重现性好；未经过专门训练的人，往往容易出错理，而且重现性好；未经过专门训练的人，往往容易出错 。 1.3 1.3 酶分析法的意义酶分析法的意义 酶的应用大致可分为四个方面：酶的应用大致可分为四个方面： (1)(1)用以制造某些产品；用以制造某些产品； (2)(2)用以去除某些物质；用以去除某些物质； (3)(3)用以识别某种化合物；用以识别某种化合物； (4)(4)用以测定某种物质。用以测定某种物质。 (1)(1)和和(2)(2)应用最为广泛。例如用酶法生产可的松，用应用最为广泛。例如用酶法生产可的松，用 凝乳酶制造乳酪，用果胶酶澄清果汁等。凝乳酶制造乳酪，用果胶酶澄清果汁等。 (3)(3)和和(4)(4)属于酶分析法的范畴。属于酶分析法的范畴。 酶分析法迅速扩展酶分析法迅速扩展 一个原因是由于酶工业的发展，可以方便获一个原因是由于酶工业的发展，可以方便获 得各种酶制剂。得各种酶制剂。 第二个原因提由于酶应用形式的发展。由于第二个原因提由于酶应用形式的发展。由于 近十年来酶的固定化技术有了很快的发展，近十年来酶的固定化技术有了很快的发展， 使酶的反复使用和连续使用成为可能。使酶的反复使用和连续使用成为可能。 固定化酶的品种已有不少，它们一方面和自动化测固定化酶的品种已有不少，它们一方面和自动化测 定技术相结合，促使酶自动化分析法的迅速普及。定技术相结合，促使酶自动化分析法的迅速普及。 另一方面也正在进一步简便化，或制成含酶的试纸另一方面也正在进一步简便化，或制成含酶的试纸 ，或制成酶试剂包出售，一般只需要加一定量的水，或制成酶试剂包出售，一般只需要加一定量的水 就可以直接使用。就可以直接使用。 酶分析法正在临床诊断、食品加工和发酵等酶分析法正在临床诊断、食品加工和发酵等 方面广泛应用。方面广泛应用。 如用葡萄糖氧化酶如用葡萄糖氧化酶(EC(EC1 11 13 34)4)测定血测定血 液葡萄糖是临床检验中常用的方法，而测定液葡萄糖是临床检验中常用的方法，而测定 某些酶含量也是临床诊断的重要指标。某些酶含量也是临床诊断的重要指标。 第二节第二节 酶活力的测定酶活力的测定 2.1 2.1 酶活力单位和反应初速度酶活力单位和反应初速度 2.2 2.2 反应条件的确定反应条件的确定 2.3 2.3 光学法光学法 2.1 2.1 酶活力单位和反应初速度酶活力单位和反应初速度 2.1.1 2.1.1 酶量常用酶活力单位表示。酶量常用酶活力单位表示。 酶活力单位是指在某一特定条件下，使酶酶活力单位是指在某一特定条件下，使酶 反应达到某一速度所需要的酶量。反应达到某一速度所需要的酶量。 酶含量则可用每克酶制剂或每毫升酶制剂酶含量则可用每克酶制剂或每毫升酶制剂 含有多少酶单位来表示含有多少酶单位来表示(U/g(U/g或或U/U/mLmL) )。 19591959年国际生物化学协会酶委会接受了年国际生物化学协会酶委会接受了 RackerRacker等人的建议，采用了等人的建议，采用了“ “国际单位国际单位” ”表表 示酶活力。示酶活力。 国际单位国际单位 IUIU：2525，最适，最适pHpH，最适底物浓，最适底物浓 度下，每分钟催化度下，每分钟催化1 1 L L底物反应的酶量。底物反应的酶量。 当底物为蛋白质、多糖等包括多个能被酶当底物为蛋白质、多糖等包括多个能被酶 作用的键或基团时，可用催化一个微摩尔作用的键或基团时，可用催化一个微摩尔 被作用的基团或键变化表示酶单位；被作用的基团或键变化表示酶单位； 对于反应：对于反应：A+BA+BC+DC+D，可用两微摩尔，可用两微摩尔A A的的 变化计算酶单位。变化计算酶单位。 19721972年酶委员会又提出一种新单位年酶委员会又提出一种新单位KatalKatal。 在确定的最适反应条件下每秒钟催化在确定的最适反应条件下每秒钟催化 1 1摩尔摩尔 底物变化所需要的酶量为底物变化所需要的酶量为1Kat1Kat。 1Kat=60101Kat=6010 6 6 IUIU。 在实际工作中在实际工作中, ,为了简便，人们往往采用各为了简便，人们往往采用各 自习惯沿用的单位。有时甚至可直接用测得自习惯沿用的单位。有时甚至可直接用测得 的物理量表示。如以光吸收的变化值的物理量表示。如以光吸收的变化值 ( (A/A/t) t)表示酶单位。表示酶单位。 在估计酶制剂纯度时则用比活力，即以单在估计酶制剂纯度时则用比活力，即以单 位重量的酶蛋白中酶的单位数位重量的酶蛋白中酶的单位数 在酶高度纯净，且酶的分子量和每个酶分在酶高度纯净，且酶的分子量和每个酶分 子上的活性中心数目已知时，可采用分子子上的活性中心数目已知时，可采用分子 活力或转换率活力或转换率(TN)(TN)表示。表示。 TNTN表示在最适条件下每个酶分子或每个活表示在最适条件下每个酶分子或每个活 性中心每分钟催化底物分子性中心每分钟催化底物分子( (或相关基团或相关基团) )转转 化的数目，这种单位的意义是它可用以进化的数目，这种单位的意义是它可用以进 行酶催化效率的估计和比较。行酶催化效率的估计和比较。 酶活性测定方法酶活性测定方法 固定时间法固定时间法 优点：简单优点：简单 缺点：难以确定反应时间段是否处于线性区缺点：难以确定反应时间段是否处于线性区 连续监测法连续监测法 优点：可以明显地找到反应的线性期，结果优点：可以明显地找到反应的线性期，结果 准确可靠。准确可靠。 缺点：要求底物或产物能够直接测量。缺点：要求底物或产物能够直接测量。 2.1.2 2.1.2 反应初速度反应初速度 酶促反应速度可用单位时间内底物的减少酶促反应速度可用单位时间内底物的减少 或产物的增加来表示。或产物的增加来表示。 以产物或底物变化量对时间作图，可获得以产物或底物变化量对时间作图，可获得“ “ 酶反应进程曲线酶反应进程曲线” ”，这条曲线的斜率就代表，这条曲线的斜率就代表 酶反应速度。酶反应速度。 酶活力测定的目的就是要通过酶反应速度酶活力测定的目的就是要通过酶反应速度 的测定求得酶的浓度或含量。的测定求得酶的浓度或含量。 测得的反应速度必须和酶浓度间有线性的测得的反应速度必须和酶浓度间有线性的 比例关系，这是检验酶反应和测定系统是比例关系，这是检验酶反应和测定系统是 否适宜、正确的标准。否适宜、正确的标准。 2.2 2.2 反应条件的确定反应条件的确定 选择反应条件的基本要求是，所有待测定选择反应条件的基本要求是，所有待测定 的酶分子都应能正常地发挥作用。的酶分子都应能正常地发挥作用。 也就是说，反应系统中除了待测定的酶浓也就是说，反应系统中除了待测定的酶浓 度是影响反应速度的唯一因素外，其它因度是影响反应速度的唯一因素外，其它因 素都应处于最适条件。素都应处于最适条件。 2.2.1 2.2.1 底物底物 底物底物( (包括人工合成底物包括人工合成底物) )最好在物理化学性最好在物理化学性 质上和产物不同。质上和产物不同。 有些酶作用的底物和产物本身就有这种特有些酶作用的底物和产物本身就有这种特 点，如脱氢酶用的点，如脱氢酶用的NAD(P)+NAD(P)+和和NAD(P)HNAD(P)H； 有的则需加工成色源或荧光源底物，在酶有的则需加工成色源或荧光源底物，在酶 作用后产物产生颜色或荧光。如磷酸酯酶作用后产物产生颜色或荧光。如磷酸酯酶 测定可用对硝基苯磷酸。测定可用对硝基苯磷酸。 底物浓度底物浓度 为了使酶反应速度不受它的限制，反应系为了使酶反应速度不受它的限制，反应系 统应该使用足够高的底物浓度。判别标准统应该使用足够高的底物浓度。判别标准 是是KmKm 例如选用例如选用s=100Kms=100Km，因为这种情况下反应，因为这种情况下反应 速度可达最大速度的速度可达最大速度的9999。 大多数酶具有相对的专一性。在可被它作大多数酶具有相对的专一性。在可被它作 用的各种底物中一般选择用的各种底物中一般选择KmKm小的作测定用小的作测定用 的底物。的底物。 底物表现高底物浓度抑制，或者溶解度小底物表现高底物浓度抑制，或者溶解度小 ，或者具有毒性，或者较为昂贵而不能使，或者具有毒性，或者较为昂贵而不能使 用高浓度，同时又没有其它适宜的底物可用高浓度，同时又没有其它适宜的底物可 以替用时，就只能根据具体的条件，选择以替用时，就只能根据具体的条件，选择 一个恰当的底物浓度。并确定在该浓度条一个恰当的底物浓度。并确定在该浓度条 件下酶反应的动力学级别。件下酶反应的动力学级别。 如：酵母的蔗糖酶受高浓度蔗糖抑制，故如：酵母的蔗糖酶受高浓度蔗糖抑制，故 一般测定时选用一般测定时选用5 5左右的蔗糖浓度，此时左右的蔗糖浓度，此时 反应为零级。反应为零级。 2.2.2 pH2.2.2 pH值值 HH + + 能对酶反应产生多种影响：能对酶反应产生多种影响：可能改变可能改变 酶活性中心的解离状况，升高或降低酶的酶活性中心的解离状况，升高或降低酶的 活性；活性；可能破坏酶的结构与构象导致失可能破坏酶的结构与构象导致失 效；效；可能作用反应系统的其它组成成分可能作用反应系统的其它组成成分 影响酶反应，甚至改变可逆反应进行的方影响酶反应，甚至改变可逆反应进行的方 向。如：乳酸脱氢酶反应在向。如：乳酸脱氢酶反应在pH 7pH 7时向乳酸时向乳酸 生成方向进行，而生成方向进行，而pH l0pH l0时则倾向于丙酮酸时则倾向于丙酮酸 的形成。的形成。 在进行酶活力测定时要注意选择适宜的反在进行酶活力测定时要注意选择适宜的反 应应pHpH，并将反应维持在这一范围内。，并将反应维持在这一范围内。 有些酶反应的最适有些酶反应的最适pHpH可能因反应的温度与可能因反应的温度与 底物浓度而不同。例如，碱性磷酸酯酶的底物浓度而不同。例如，碱性磷酸酯酶的 最适最适pHpH在在2525、3030和和3737分别为分别为10.310.3、 10.110.1和和9.99.9。 酶反应缓冲系统的离子的酶反应缓冲系统的离子的pKpK值应接近要调整的值应接近要调整的 pHpH。磷酸缓冲液适用于磷酸缓冲液适用于pHpH低于低于7.57.5的反应系统的反应系统 ，TrisTris( (三羟甲基氨基甲烷三羟甲基氨基甲烷) )缓冲液适用于高于缓冲液适用于高于 pH7.5pH7.5的反应体系。的反应体系。Gly-GlyGly-Gly( (甘氨酸二肽甘氨酸二肽) )在在pHpH 大于大于8 8时是出色的缓冲系统。时是出色的缓冲系统。 缓冲离子不同，可能影响酶的活性水平，甚至最缓冲离子不同，可能影响酶的活性水平，甚至最 适适pHpH。 缓冲离子也可能与酶活性的必需成份形成配合物缓冲离子也可能与酶活性的必需成份形成配合物 而导致酶活性的抑制。如，磷酸能与多价阳离子而导致酶活性的抑制。如，磷酸能与多价阳离子 如如CaCa2+ 2+ 等结合，硼酸能与多种有机化合物如呼吸 等结合，硼酸能与多种有机化合物如呼吸 链中间递体结合，从而抑制相应的酶活性。链中间递体结合，从而抑制相应的酶活性。 2.2.3 2.2.3 温度温度 直接影响化学反应速度本身，也能影响酶直接影响化学反应速度本身，也能影响酶 的稳定性，还可能影响酶的构象和酶的催的稳定性，还可能影响酶的构象和酶的催 化机制。化机制。 温度变化温度变化1 1，速度可能相差，速度可能相差1010以上。以上。 要得到可以高度重复的结果，温度变动应要得到可以高度重复的结果，温度变动应 控制在控制在0.10.1以内。以内。 生化联合会在生化联合会在19611961年建议以年建议以2525为酶的反应测定为酶的反应测定 温度，到温度，到19641964年则建议改为年则建议改为3030；国际临床化学；国际临床化学 联合会也建议采用联合会也建议采用3030。但是许多临床化学工作。但是许多临床化学工作 者常采用者常采用3737为酶反应温度。为酶反应温度。 2.2.4 2.2.4 辅助因子辅助因子 有些酶需要金属离子有些酶则需要相应的辅酶物有些酶需要金属离子有些酶则需要相应的辅酶物 质，在反应系统中应该满足酶对这些辅助因子的质，在反应系统中应该满足酶对这些辅助因子的 需要，而且在添加这些物质时还应注意到它们的需要，而且在添加这些物质时还应注意到它们的 专一性，以及某些活化剂在高浓度时可能产生抑专一性，以及某些活化剂在高浓度时可能产生抑 制作用。制作用。 为了提高酶在反应系统中的稳定性，有时也需要为了提高酶在反应系统中的稳定性，有时也需要 某些相应的物质。例如，对巯基酶可加入巯基乙某些相应的物质。例如，对巯基酶可加入巯基乙 醇、二硫苏糖醇醇、二硫苏糖醇(DTT)(DTT)等。在制备样品和反应过等。在制备样品和反应过 程中为了避免待测酶遭受蛋白酶的降解，往往要程中为了避免待测酶遭受蛋白酶的降解，往往要 加入蛋白酶的抑制剂。加入蛋白酶的抑制剂。 2.2.5 2.2.5 样品样品 许多待测样品常常包含各种干扰因素，如许多待测样品常常包含各种干扰因素，如 可能存在着作用同一底物或产物的其它酶可能存在着作用同一底物或产物的其它酶 。因此测定前应检测系统中是否杂有这些。因此测定前应检测系统中是否杂有这些 干扰因素。干扰因素。 同时采用不同的测定方法和同时检测底物同时采用不同的测定方法和同时检测底物 和产物的变化量，然后观察测得的结果是和产物的变化量，然后观察测得的结果是 否一致。通过这些比较分析，确定是否存否一致。通过这些比较分析，确定是否存 在干扰。在干扰。 例：谷丙转氨酶例：谷丙转氨酶(GPT)(GPT)或谷草转氨酶或谷草转氨酶(GOT)(GOT)可可 催化氨基的转移。催化氨基的转移。 测定方法是偶联一个脱氢酶反应。前者可偶联乳测定方法是偶联一个脱氢酶反应。前者可偶联乳 酸脱氢酶酸脱氢酶(LDH)(LDH)，后者可偶联苹果酸脱氢酶，后者可偶联苹果酸脱氢酶 (MDH)(MDH)，然后测定反应过程中，然后测定反应过程中NADHNADH在在340nm340nm光光 吸收的降低。吸收的降低。 在这些测定样品中，如果包含有谷氨酸脱在这些测定样品中，如果包含有谷氨酸脱 氢酶氢酶( (GluDHGluDH) )，那么就可能产生干扰。，那么就可能产生干扰。 反应平衡倾向于形成反应平衡倾向于形成L-L-GluGlu，它同样导致，它同样导致 340nm340nm光吸收下降。光吸收下降。 GluDHGluDH在正常血清中极少，在脑、肝等组织中极为丰富。在正常血清中极少，在脑、肝等组织中极为丰富。 在某些病理条件下血清中这种酶活性可能显著升高。在某些病理条件下血清中这种酶活性可能显著升高。 该酶反应需要该酶反应需要NHNH4+ 4+而且其 而且其KKm m很大，如果反应系统能够避 很大，如果反应系统能够避 免免NHNH4+ 4+，那么这种干扰就可消除。同时进行空白试验。 ，那么这种干扰就可消除。同时进行空白试验。 2.2.6 2.2.6 空白和对照空白和对照 空白是指杂反应和自发反应引起的变化量空白是指杂反应和自发反应引起的变化量 ，它提供的是未知因素的影响。，它提供的是未知因素的影响。 空白值可通过不加酶，或不加底物，或二空白值可通过不加酶，或不加底物，或二 者都加，但酶预先经过失效处理的反应系者都加，但酶预先经过失效处理的反应系 统获得。统获得。 对照是指用纯酶或标准酶制剂测得的结果对照是指用纯酶或标准酶制剂测得的结果 ，主要作为比较或标定的标准。，主要作为比较或标定的标准。 2.3 2.3 光学法光学法 测定方法有取样法和连续法。测定方法有取样法和连续法。 取样法：在酶反应开始后不同的时间，从取样法：在酶反应开始后不同的时间，从 反应系统中取出一定量的反应液，并用适反应系统中取出一定量的反应液，并用适 当的方法停止其反应后，再根据产物和底当的方法停止其反应后，再根据产物和底 物在化学性质上的差别进行分析，求得单物在化学性质上的差别进行分析，求得单 位时间内酶促反应变化量的方法。位时间内酶促反应变化量的方法。 连续法：基于底物和产物在物理化学性质连续法：基于底物和产物在物理化学性质 上的不同，在反应过程中对反应系统进行上的不同，在反应过程中对反应系统进行 直接、连续观察的方法。直接、连续观察的方法。 2.3.1 2.3.1 光吸收测定法光吸收测定法 根据产物和底物在某一波长或某一波段上，有明根据产物和底物在某一波长或某一波段上，有明 显的特征吸收差别而建立起来的连续观测方法。显的特征吸收差别而建立起来的连续观测方法。 光吸收测定法应用的范围很广。几乎所有氧化还光吸收测定法应用的范围很广。几乎所有氧化还 原酶都可用此法测定。原酶都可用此法测定。 例例1 1：脱氢酶的辅酶：脱氢酶的辅酶NAD(P)HNAD(P)H在在340nm340nm有吸收高峰，有吸收高峰， 而氧化型则没有。而氧化型则没有。 例例2 2：细胞色素氧化酶的底物为细胞色素：细胞色素氧化酶的底物为细胞色素c c，该物质，该物质 在还原态时，其在还原态时，其550nm550nm的吸光系数的吸光系数2.81102.8110 4 4 厘米厘米/ / 摩尔，而氧化型的摩尔，而氧化型的0.80100.8010 4 4 厘米厘米/ /摩尔。这种光吸摩尔。这种光吸 收差别也可用来进行测定。收差别也可用来进行测定。 某些氧化还原酶难以获得天然的供受体，可采用某些氧化还原酶难以获得天然的供受体，可采用 简单的人工供受体简单的人工供受体( (见下表见下表) )。 可以利用光吸收测定的可以利用光吸收测定的- -还有那些催化双键还有那些催化双键 饱和化或双键形成的酶反应，以及那些催饱和化或双键形成的酶反应，以及那些催 化环状结构变化的酶反应。化环状结构变化的酶反应。 例例1 1：延胡索酸酶催化的反应，延胡索酸在：延胡索酸酶催化的反应，延胡索酸在 300nm300nm有强的光吸收，而苹果酸没有。有强的光吸收，而苹果酸没有。 例例2 2：尿酸氧化酶催化尿酸氧化为尿囊素，尿：尿酸氧化酶催化尿酸氧化为尿囊素，尿 酸在酸在290nm290nm有吸收，而尿囊素则没有。有吸收，而尿囊素则没有。 光吸收测定法的特点是灵敏度高光吸收测定法的特点是灵敏度高( (可检测到可检测到 nmolnmol/L/L水平的变化水平的变化) )，简便易行，测定一般，简便易行，测定一般 可在较短的时间内完成。可在较短的时间内完成。 光吸收法，应用很广，除上述氧化还原酶光吸收法，应用很广，除上述氧化还原酶 ，许多激酶，许多激酶( (转移酶转移酶) )、酯酶、肽酶等，都广、酯酶、肽酶等，都广 泛采用这类方法。泛采用这类方法。 2.3.2 2.3.2 荧光测定法荧光测定法 如果酶反应的底物或产物具有荧光，则荧光强度如果酶反应的底物或产物具有荧光，则荧光强度 变化速度可作为酶反应速度的一个量度。变化速度可作为酶反应速度的一个量度。 可以应用此法测定酶的反应有两种：可以应用此法测定酶的反应有两种： 一是脱氢酶等反应，它们的底物本身在酶反应过一是脱氢酶等反应，它们的底物本身在酶反应过 程就有荧光变化。例如程就有荧光变化。例如NAD(P)HNAD(P)H的中性溶液发强的中性溶液发强 的蓝白色荧光的蓝白色荧光(460nm)(460nm)，而，而NAD(P)+NAD(P)+则没有。则没有。 另一类是最近发展起来的，利用荧光源底物的酶另一类是最近发展起来的，利用荧光源底物的酶 反应，例如可用二丁酰荧光素测定脂肪酶，二丁反应，例如可用二丁酰荧光素测定脂肪酶，二丁 酰荧光素不发荧光，但其水解后释放荧光素。酰荧光素不发荧光，但其水解后释放荧光素。 荧光测定法优点：荧光测定法优点： 灵敏度极高，它比光吸收测定法还要高灵敏度极高，它比光吸收测定法还要高2323 个数量级，因此特别适于酶量或底物量极个数量级，因此特别适于酶量或底物量极 低时的快速酶分析。与此有关的是荧光光低时的快速酶分析。与此有关的是荧光光 谱与荧光偏振测定。二者近年来广泛用于谱与荧光偏振测定。二者近年来广泛用于 酶作用机制的研究。酶作用机制的研究。 荧光测定法缺点荧光测定法缺点 荧光读数与浓度问没有直接的比例关系。荧光读数与浓度问没有直接的比例关系。 而且常因测定条件如温度、散射、仪器等而且常因测定条件如温度、散射、仪器等 而不同。所以如果要将酶活性以确定的单而不同。所以如果要将酶活性以确定的单 位表示时，首先妻制备校正曲线，根据这位表示时，首先妻制备校正曲线，根据这 曲线再确切定量。曲线再确切定量。 该法易受其它物质干扰。该法易受其它物质干扰。有些物质如重铬酸钾有些物质如重铬酸钾 常会抢夺能量，降低荧光强度；有些物质如蛋白常会抢夺能量，降低荧光强度；有些物质如蛋白 质能吸收和发射荧光，质能吸收和发射荧光，这种干扰在紫外光区尤这种干扰在紫外光区尤 为显著，故测定的荧光最好是可见光、特为显著，故测定的荧光最好是可见光、特 别是红荧光为好。别是红荧光为好。 2.3.3 2.3.3 电化学测定法电化学测定法 灵敏度和准确度都很高，可和光学方法相灵敏度和准确度都很高，可和光学方法相 比。比。 测定系统中有某些物质污染，不会影响结测定系统中有某些物质污染，不会影响结 果。果。 此法要求一定的仪器设备。此法要求一定的仪器设备。 离子选择性电极测定法离子选择性电极测定法 最普通的是以玻璃电极测定酸度最普通的是以玻璃电极测定酸度(pH)(pH)的变的变 化。可用于产酸反应的测定。化。可用于产酸反应的测定。 此法操作简单，但有两个缺点：此法操作简单，但有两个缺点： 一是随着反应的进行，一是随着反应的进行，pHpH不断改变，酶活不断改变，酶活 力也将发生变化；力也将发生变化； 二是测定系统的二是测定系统的pHpH依赖于介质的缓冲能力依赖于介质的缓冲能力 ，蛋白质是高缓冲性物质，粗的待测样品，蛋白质是高缓冲性物质，粗的待测样品 中往往包含大量惰性蛋白，因而难以保证中往往包含大量惰性蛋白，因而难以保证 恒定的缓冲强度，测定结果不易准确。恒定的缓冲强度，测定结果不易准确。 连续滴定或恒酸滴定可以克服上述困难。连续滴定或恒酸滴定可以克服上述困难。 所谓恒酸滴定就是在反应过程中，不断向所谓恒酸滴定就是在反应过程中，不断向 反应系统加酸或碱使反应系统加酸或碱使pHpH维持恒定，同时以维持恒定，同时以 加酸或加碱的速度代表反应速度。加酸或加碱的速度代表反应速度。 恒酸滴定仪恒酸滴定仪(pH-stat)(pH-stat)就是适应这种需要而设就是适应这种需要而设 计的一种精密测定仪。它可自动加酸加碱计的一种精密测定仪。它可自动加酸加碱 控制控制pHpH，并记录加入的酸碱量与时何的关，并记录加入的酸碱量与时何的关 系。系。 氧电极测定法氧电极测定法 原理：给水溶液中的电极加上一定电压，其原理：给水溶液中的电极加上一定电压，其 中的溶解物质在电极上进行氧化还原反应；中的溶解物质在电极上进行氧化还原反应； 产生电解电流。根据电流测定溶质浓度。产生电解电流。根据电流测定溶质浓度。 各种物质产生电极反应所需要加的电极电压各种物质产生电极反应所需要加的电极电压 是不同的。可以进行选择性测定，是不同的。可以进行选择性测定，例如，溶解例如，溶解 氧能在较低的负电压氧能在较低的负电压(0.65V(0.65V左右左右) )条件下还原，而能条件下还原，而能 在这种电极电压水平下发生反应的物质又很少，因在这种电极电压水平下发生反应的物质又很少，因 此可用来测定氧化还原反应，如葡萄糖氧化酶、氨此可用来测定氧化还原反应，如葡萄糖氧化酶、氨 基酸氧化酶等，不过这种方法主要用于线粒体和光基酸氧化酶等，不过这种方法主要用于线粒体和光 合成酶系的研究。合成酶系的研究。 电流测定法电流测定法 原理：把两个电极浸入分析样品中，其间原理：把两个电极浸入分析样品中，其间 维持一恒定电压，这样反应过程中电流的维持一恒定电压，这样反应过程中电流的 变化速度将反映酶反应的速度。变化速度将反映酶反应的速度。 例：测定葡萄糖氧化酶例：测定葡萄糖氧化酶 反应过程中管状铂电极上发生的反应过程中管状铂电极上发生的FeFe2+ 2+氧化导 氧化导 致电流的变化，这种变化和酶反应速度间有致电流的变化，这种变化和酶反应速度间有 线性关系。线性关系。 2.3.4 2.3.4 放射化学测定法放射化学测定法的原理放射化学测定法放射化学测定法的原理 和化学法相似，不过底物用同位素标记。和化学法相似，不过底物用同位素标记。 随着酶催化反应进行，将定量地导致放射随着酶催化反应进行，将定量地导致放射 标记的产物形成。一定时间后，将反应停标记的产物形成。一定时间后，将反应停 止并将产物和底物加以分离，然后测定产止并将产物和底物加以分离，然后测定产 物的放射性或未反应的底物的放射性，那物的放射性或未反应的底物的放射性，那 么转化的底物量也就能推算出来。此法检么转化的底物量也就能推算出来。此法检 测的灵敏度可以通过反应时间的控制、比测的灵敏度可以通过反应时间的控制、比 放射性的选择而适当调整。放射性的选择而适当调整。 已知的六大类酶几乎都可以用此法测定。已知的六大类酶几乎都可以用此法测定。 通常用于底物标记的同位素有。通常用于底物标记的同位素有。HH、14C14C、 32P32P、35S35S和和131I131I它们在衰变过程中放射的它们在衰变过程中放射的 都是都是 粒子。用于酶分析中的底物，其比放粒子。用于酶分析中的底物，其比放 射性一般不宜太高，因为这样可以降低分射性一般不宜太高，因为这样可以降低分 析成本，避免干扰，减少误差。析成本，避免干扰，减少误差。32P32P、131I131I 等产生的高能等产生的高能-射线，可直接用射线，可直接用 GergermiillerGergermiiller。计数器探测计数。但是低。计数器探测计数。但是低 能的能的-射线射线( (如来自如来自HH、35S)35S)则常用液体闪则常用液体闪 烁仪检测。烁仪检测。 放射化学检测法的特点是灵敏度极高，高放射化学检测法的特点是灵敏度极高，高 于光学和电学等方法。可直接用于酶活性于光学和电学等方法。可直接用于酶活性 检测，也可用于体内酶活性测定。缺点是检测，也可用于体内酶活性测定。缺点是 操作较繁而费时，每个测定都必须进行分操作较繁而费时，每个测定都必须进行分 离，其次同位素的保存和操作必须特别小离，其次同位素的保存和操作必须特别小 心，它直接关系到使用者的健康、安全；心，它直接关系到使用者的健康、安全； 另外此法不能进行连续跟踪，故测定时反另外此法不能进行连续跟踪，故测定时反 应时间不能太长，应使底物的转变落在初应时间不能太长，应使底物的转变落在初 速度范围内；最后一个问题是辐射线的淬速度范围内；最后一个问题是辐射线的淬 灭，例如。灭，例如。HH发射的发射的-射线可被纸吸收。总射线可被纸吸收。总 的来说，放射化学测定法是一种重要的测的来说，放射化学测定法是一种重要的测 定方法。它的应用愈来愈广、愈多，有些定方法。它的应用愈来愈广、愈多，有些 酶反应目前还只能采用此法测定。同位素酶反应目前还只能采用此法测定。同位素 在酶分析上的其它应用可参考有关专著。在酶分析上的其它应用可参考有关专著。 2.3.4 2.3.4 放射化学测定法放射化学测定法 原理：底物用同位素标记。随着酶催化反原理：底物用同位素标记。随着酶催化反 应进行，将定量地导致放射标记的产物形应进行，将定量地导致放射标记的产物形 成。一定时间后，将反应停止并将产物和成。一定时间后，将反应停止并将产物和 底物加以分离，然后测定产物的放射性或底物加以分离，然后测定产物的放射性或 未反应的底物的放射性，那么转化的底物未反应的底物的放射性，那么转化的底物 量也就能推算出来。量也就能推算出来。 此法检测的灵敏度可以通过反应时间的控此法检测的灵敏度可以通过反应时间的控 制、比放射性的选择而适当调整。制、比放射性的选择而适当调整。 已知的六大类酶几乎都可以用此法测定。通已知的六大类酶几乎都可以用此法测定。通 常用于底物标记的同位素有。常用于底物标记的同位素有。 3 3 HH、14 14C C、 、32 32 P P 、35 35S S和 和131 131I I它们在衰变过程中放射的都是 它们在衰变过程中放射的都是 粒粒 子。子。 用于酶分析中的底物，其比放射性一般不宜用于酶分析中的底物，其比放射性一般不宜 太高，因为这样可以降低分析成本，避免干太高，因为这样可以降低分析成本，避免干 扰，减少误差。扰，减少误差。 3232P P、 、131 131I I等产生的高能 等产生的高能-射线，可直接用射线，可直接用Geiger Geiger miillermiiller计数器探测计数。但是低能的计数器探测计数。但是低能的-射线射线( (如来自如来自 HH、35 35S) S)则常用液体闪烁仪检测。则常用液体闪烁仪检测。 优点：灵敏度极高，高于光学和电学等方法。优点：灵敏度极高，高于光学和电学等方法。 缺点：缺点：操作较繁而费时；操作较繁而费时；同位素的保存和操同位素的保存和操 作必须特别小心，它直接关系到使用者的健康、作必须特别小心，它直接关系到使用者的健康、 安全；安全；不能进行连续跟踪，故测定时反应时间不能进行连续跟踪，故测定时反应时间 不能太长，应使底物的转变落在初速度范围内；不能太长，应使底物的转变落在初速度范围内； 辐射线的淬灭问题，如辐射线的淬灭问题，如 3 3 HH发射的发射的-射线可被纸射线可被纸 吸收。吸收。 放射化学测定法是一种重要的测定方法。它的应放射化学测定法是一种重要的测定方法。它的应 用愈来愈广、愈多，有些酶反应目前还只能采用用愈来愈广、愈多，有些酶反应目前还只能采用 此法测定。此法测定。 2.3.5 2.3.5 酶偶联分析法酶偶联分析法 应用过量、高度专一的应用过量、高度专一的“ “偶联工具酶偶联工具酶” ”，使，使 被测酶反应能继续进行到某一可直接、连被测酶反应能继续进行到某一可直接、连 续、简便、准确测定阶段的方法。续、简便、准确测定阶段的方法。 1 1酶偶联分析测活力的实例：酶偶联分析测活力的实例： 例例1 1：如果被测酶反应的产物是某脱氢酶的底：如果被测酶反应的产物是某脱氢酶的底 物，在这种情况下，可向反应测定系统中物，在这种情况下，可向反应测定系统中 加入足够量的相应的脱氢酶和辅酶，使加入足够量的相应的脱氢酶和辅酶，使 反应继续进行，然后通过反应继续进行，然后通过NAD(P)HNAD(P)H特征吸特征吸 收变化而加以测定。收变化而加以测定。 其中其中GG和和G-6-P-OG-6-P-O分别代表葡萄糖和葡萄糖分别代表葡萄糖和葡萄糖-6-6-磷酸磷酸-内酯内酯) ) 大约有大约有5050种左右的脱氢酶可以利用种左右的脱氢酶可以利用NADNAD + + 和和NADHNADH，2020多多 种脱氢酶能利用种脱氢酶能利用NADPNADP + + 或或NADPHNADPH。它们都可用作偶联指。它们都可用作偶联指 示酶。示酶。 如：己糖激酶如：己糖激酶(HK)(HK)的测定就可在过量的葡萄糖的测定就可在过量的葡萄糖-6-6-磷磷 酸酸(G-6p)(G-6p)脱氢酶脱氢酶(G6PDH)(G6PDH)和和NADPNADP + + 存在的条件下存在的条件下 进行：进行： 例例2 2：被测反应不能直接和上述脱氢酶反应偶：被测反应不能直接和上述脱氢酶反应偶 联，可再插入一个起联结作用的辅助酶反联，可再插入一个起联结作用的辅助酶反 应。如测定肌激酶活力：应。如测定肌激酶活力： 其中其中PEPPEP、PyrPyr和和L L分别代表磷酸烯醇丙酮酸、丙分别代表磷酸烯醇丙酮酸、丙 酮酸和乳酸；酮酸和乳酸；AMPAMP、ADPADP和和ATPATP分别为腺苷一、分别为腺苷一、 二和三磷酸。二和三磷酸。 例例3 3：被测反应和其它有光学性质改变的酶反应偶联：被测反应和其它有光学性质改变的酶反应偶联 ，如腺苷酸脱氨酶催化，如腺苷酸脱氨酶催化AMPAMP脱氨过程中伴随有脱氨过程中伴随有 265nm265nm光吸收的降低，此酶专一作用于光吸收的降低，此酶专一作用于AMPAMP，不，不 作用作用ADPADP和和ATPATP。因此在测定某些合成酶或激酶。因此在测定某些合成酶或激酶 反应时，它可用作偶联指示酶，肌激酶的测定也反应时，它可用作偶联指示酶，肌激酶的测定也 可利用它：可利用它： 用这两种酶组成偶联测定系统时，由于它们的最适用这两种酶组成偶联测定系统时，由于它们的最适pHpH相相 距较远，因而不能在同一系统中进行作用，为此必须分开距较远，因而不能在同一系统中进行作用，为此必须分开 建立两个反应系统，并在不同时间间隔从肌激酶反应系统建立两个反应系统，并在不同时间间隔从肌激酶反应系统 取样，然后转入脱氨酶反应系统，最后测定。取样，然后转入脱氨酶反应系统，最后测定。 2 2应用酶偶联测活力应注意的事项应用酶偶联测活力应注意的事项 首先，加入的偶联工具酶应当高度纯净，首先，加入的偶联工具酶应当高度纯净， 尤其不能混有待测酶，也不能混有干扰测尤其不能混有待测酶，也不能混有干扰测 定的其它酶。定的其它酶。 其次，偶联酶的用量必须过量，以保证被其次，偶联酶的用量必须过量，以保证被 测酶的反应速度是总反应系统的限制因子测酶的反应速度是总反应系统的限制因子 ，使测得的反应速度和被测酶浓度呈线性，使测得的反应速度和被测酶浓度呈线性 关系。关系。 第三节第三节 酶法分析酶法分析 应用酶作为分析工具的酶分析法可以对应用酶作为分析工具的酶分析法可以对 酶的底物、辅酶、活化剂或抑制剂进行酶的底物、辅酶、活化剂或抑制剂进行 定量分析。定量分析。 常用的方法有动力学分析法、终点测定常用的方法有动力学分析法、终点测定 法和法和- -酶标免疫铡定法。终点测定法应用酶标免疫铡定法。终点测定法应用 最为普遍。最为普遍。 终点测定法是借助某种酶作用，使被测物质终点测定法是借助某种酶作用，使被测物质 定量地进行转变，然后在转化完成后，测定定量地进行转变，然后在转化完成后，测定 底物、产物或辅酶物质等的变化量。分为单底物、产物或辅酶物质等的变化量。分为单 酶反应定量法和偶联酶反应定量法。酶反应定量法和偶联酶反应定量法。 3.1 3.1 单酶反应定量法单酶反应定量法 3.2 3.2 偶联酶反应定量法偶联酶反应定量法 3.1 3.1 单酶反应定量法单酶反应定量法 单酶反应只需要一种催化酶，如下式所示单酶反应只需要一种催化酶，如下式所示 用这种反应作底物定量时，可以测定底物用这种反应作底物定量时，可以测定底物 的减少量，也可以测定产物的增加量。对的减少量，也可以测定产物的增加量。对 含有辅酶的酶，测定辅酶的变化量也是有含有辅酶的酶，测定辅酶的变化量也是有 效的方法。效的方法。 3.1.1 3.1.1 底物减少量的测定底物减少量的测定 在待测物质为底物的酶反应中，如果底物能接近在待测物质为底物的酶反应中，如果底物能接近 完全地转化为产物完全地转化为产物( (当有当有9999转化成产物时，则认转化成产物时，则认 为反应完全为反应完全) )，而且底物又具有某种特征性质，而且底物又具有某种特征性质( (如如 具有特殊的吸收光谱具有特殊的吸收光谱) )时，就有可能直接测定底物时，就有可能直接测定底物 的减少量而定量待测物。的减少量而定量待测物。 据此原理能进行测量的物质有胞嘧啶据此原理能进行测量的物质有胞嘧啶( (胞嘧啶脱氨胞嘧啶脱氨 酶反应酶反应280nm280nm处吸光度的减少处吸光度的减少) )，腺嘌呤，腺嘌呤( (腺嘌呤脱腺嘌呤脱 氨酶反应，氨酶反应，280nm280nm处吸光度的减少处吸光度的减少) )以及尿酸等。以及尿酸等。 例：尿酸的定量测定例：尿酸的定量测定 尿酸在尿酸在293nm293nm、297nm297nm处具有特征吸收峰，处具有特征吸收峰， 其摩尔吸光系数分别为有明显差别。利用其摩尔吸光系数分别为有明显差别。利用 这一性质，通过尿酸酶反应，根据它的吸这一性质，通过尿酸酶反应，根据它的吸 光度的减少就可算出尿酸量。光度的减少就可算出尿酸量。 3.1.2 3.1.2 产物增加量的测定产物增加量的测定 在被测物作为底物的酶促反应中，如果底在被测物作为底物的酶促反应中，如果底 物基本上都能转变成为产物，而产物又具物基本上都能转变成为产物，而产物又具 有可专一性进行定量测定的物质，那么，有可专一性进行定量测定的物质，那么， 根据产物的增加量就能检测底物的量。根据产物的增加量就能检测底物的量。 如：各种氨基酸类如：各种氨基酸类(L-(L-LysLys、L-L-ArgArg、L-L-TyrTyr、 L-HisL-His、L-L-GluGlu、L-AspL-Asp等等) )和草酸等。都可和草酸等。都可 借助相应的专一性脱羧酶的作用，用借助相应的专一性脱羧酶的作用，用 WarburgWarburg呼吸测定生成的呼吸