《酶的生物合成》PPT课件.ppt

退出 酶工程 Enzyme Engineering 第三章 酶的生物合成 第一节 产酶微生物概述 第二节 微生物产酶的发酵工艺条件及控制 第三节 植物细胞培养产酶的特性、工艺条件及控 制 第四节 动物细胞培养产酶的特性、工艺条件及控 制 第一节 产酶微生物概述 一、 微生物产酶的特点 二、 产酶微生物的种类 三、 微生物酶的种类 四、 产酶微生物的来源 一、 微生物产酶的特点 工业生产酶制剂一般都以微生物为主要来源 为什么酶制剂的生产主要以微生物为材料？ (1) 微生物种类多，酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样 (2) 微生物生长繁殖快，酶易提取，特别是胞外酶 (3) 来源广泛，价格便宜 (4) 微生物易得，生长周期短 (5) 可以利用以基因工程为主的分子生物学技术，选育和改造 菌种，增加产酶率和开发新酶种 二、 产酶微生物的种类 1、 细菌 2、 放线菌 3、 酵母菌 4、 霉菌 菌 种酶及功能 (1) 无芽孢杆菌 大肠肠埃希氏菌属 (Escherichia) 天门门冬酰酰氨酶，抗肿肿瘤，治疗疗白血病 青霉素酰酰化酶，制备备6-APA母核，生产产半合成青霉素 酰酰基转转移酶，拆分DL-氨基酸，制备备L-氨基酸 溶菌酶，用于消炎、抗菌等 谷氨酸脱羧羧酶，在味精工业业中用于谷氨酸的定量分析 假单单胞菌属 (Pseudomonas Migula) -酪氨酸酶，用于合成L-多巴，治疗疗帕金森病 葡萄糖异构酶，溶菌酶，青霉素G酰酰化酶，脂肪酶 1、 细菌 菌 种酶及功能 (2) 芽孢杆菌 枯草芽孢孢杆菌 (Bacillus subtilis) -淀粉酶，蛋白酶，青霉素酶，溶菌酶 5-磷酸二酯酯酶，用于水解RNA，生产产核苷酸和核苷等 纳纳豆激酶，溶解血栓，抑制金黄色葡萄球菌、大肠肠埃氏菌O157菌株 及沙门门氏菌的作用 嗜热热脂肪芽孢孢杆菌 (B. stearothermophilus) -半乳糖苷酶，青霉素酶等 果糖芽孢孢杆菌 (B. fructosus) 异构酶，溶菌酶等 环环状芽孢孢杆菌 (B. circulans) 环环糊精葡基转转移酶(用于由淀粉生产环产环 状糊精)，丁酰酰苷酶A、B等 巨大芽孢孢杆菌 (B. megaterium) 头孢头孢 菌素酰酰化酶(用于酶法半合成生产产各种头孢头孢 菌素衍生物，如先 锋锋毒素等) 1、 细菌 菌 种酶及功能 (3) 球菌 微球菌属(Micrococcus) 溶壁微球菌 (M. lysodeikticus) 玫瑰色微球菌 (M. roseus) 用于生产产青霉素酰酰化酶和溶壁酶等多种酶类类 链链球菌属 (Streptococcus) -溶血性链链球菌 (S. -hemolyticus) 生产产酪氨酸脱羧羧酶、链链激酶、链链道酶、双链链酶等(有溶解血栓、血 块块，加速伤伤口愈合等作用) 明串珠菌属 (Leuconostoc) 产产生葡萄糖异构酶 1、 细菌 菌 种酶及功能 (1) 链霉菌属 (Streptomyces) 委内瑞拉链链霉菌 (S. venezulae) 葡萄糖异构酶 灰色链链霉菌 (S. griseus) 葡萄糖异构酶，溶菌酶 白色链链霉菌 (S. albus) 葡萄糖异构酶，溶菌酶 不产产色素链链霉菌 (S. achromogenes) 葡萄糖异构酶 弗氏链链霉菌 (S. fradiae ) 产产生角蛋白酶 2、 放线菌 菌 种酶及功能 (1) 链霉菌属 (Streptomyces) 密执执安链链霉菌 (S. michiganensisi) 产产生抗胰酶，可抑制食道癌和乳腺癌的发发生，抑制烧伤烧伤 疼痛和水泡 形成等 金色链链霉菌 (S. aureus) 产产生青霉素V酰酰化酶 淡紫灰叶链链霉菌 (S. lavendulae) (2) 诺卡氏菌属 (Ncardia) 产产生单单加氧酶，双加氧酶(用于烃类烃类 、氰氰、腈类腈类 物质质的降解) 2、 放线菌 菌 种酶及功能 酿酿酒酵母(S. cerevisiae) 又称啤酒酵母，是糖酵母属中最主要的酵母种，也是发发酵工业业上最 常用、最重要的菌种之一，用于生产产凝血激酶、尿激酶等药药用酶 球拟拟酵母属(Torulopsis) 制取青霉素酰酰化酶，谷氨酸脱羧羧酶和酸性蛋白酶等 假丝丝酵母属(Candida) 产产生单单加氧酶，双加氧酶，用于烃类烃类 等石油产产品的降解 3、 酵母菌 菌 种酶及功能 (1) 根霉(Rhizopus) 少根根霉 (R.arrhizus) 生产产淀粉糖化酶、脂肪酶 代氏根霉 (R. delemar) 匍枝根霉 (R. stolonifer) 生产产果胶酶 其它 生产产酸性蛋白酶、 -半乳糖苷酶等 (2) 木霉 (Trichoderma) 绿绿色木霉 (T. viride) 产纤维产纤维 素酶(C1、Cx酶)、纤维纤维 二糖酶、淀粉酶、乳糖酶、真菌细细胞 壁溶解酶、青霉素V酰酰化酶等 康氏木霉 (T. Koningii) 4、 霉菌 菌 种酶及功能 (3) 毛霉(Mucor) 微小毛霉 (M.pusillus) 凝乳酶 灰蓝蓝毛霉 (M. griseo-cyanus) 刺状毛霉 (M. spinosa) 爪哇毛霉 (M. javanicus) 果胶酶 高大毛霉 (M.mucedo) 产产生用于腐乳发发酵的蛋白酶和淀粉糖化酶等(高大毛霉还还可产产脂肪 酶) 总总状毛霉 (M.racemosus) 4、 霉菌 菌 种酶及功能 (4) 青霉 (Penicillium) 点青霉 (P. notatum) 葡萄糖氧化酶 产产紫青霉 (P. ururogenum) 产产黄青霉 (P. chrysogenum) 葡萄糖氧化酶，中性、碱性蛋白酶和青霉素V酰酰化酶 橘青霉 (P. citrinum) 5-磷酸二脂酶(水解RNA，生产产4种5-单单核苷酸，肌苷酸和鸟鸟苷 酸)，脂肪酶，凝乳酶和真菌细细胞壁溶解酶等 (5) 犁头霉(Absidia) 蓝蓝色犁头头霉 (A. coerulea) 糖化酶 李克犁头头霉 (A. lichtheimi) -半乳糖苷酶 4、 霉菌 菌 种酶及功能 (6) 曲霉 (Aspergillus) 黑曲霉 (A. niger) 淀粉酶，蛋白酶，果胶酶葡萄糖氧化酶等 黄曲霉 (A. flavus) 蛋白酶， 果胶酶等 米曲霉 (A. oryzae) 蛋白酶，果胶酶等 栖土曲霉 (A. terricola) 蛋白酶 亮白曲霉 (A. candidus) 葡萄糖氧化酶 黄柄曲霉 (A. flacipes) 葡萄糖氧化酶 4、 霉菌 三、 微生物酶的种类 三、 微生物酶的种类 1、蛋白酶 n催化肽键水解。可以在短时间内将蛋白质水解 n按蛋白酶作用的最适pH将其分为酸性、中性、碱性 蛋白酶三类 2、糖化酶 n葡萄糖淀粉酶 n产酶菌种主要是霉菌 n最适反应pH为45，最适反应温度为5060 三、 微生物酶的种类 3、-淀粉酶 n芽孢杆菌，米曲霉 n液体深层发酵，固体发酵 4、-淀粉酶 n芽孢杆菌、假单胞菌，土佐链霉菌、吸水链霉菌及 高温放线菌等 n多从高等植物中提取 n以微生物大规模生产，存在以下问题：酶活力低、 耐热性差，不能适应啤酒、饴糖等工业生产 三、 微生物酶的种类 5、葡萄糖异构酶 n木糖异构酶。能将D-木糖、D-葡萄糖、D-核糖等醛 糖可逆地转化为相应的酮糖 n所有的异构糖全部使用固定化酶生产 6、果胶酶 n广泛存在于植物果实和微生物中 n工业上，常采用曲霉、青霉，枯草芽孢杆菌、欧氏 杆菌等 n固态发酵，液体深层发酵 n水果加工，麻纤维脱胶，木材防腐，饲料添加剂等 三、 微生物酶的种类 7、漆酶 n含铜的多酚氧化酶，最早从漆树的分泌物中发现 n广泛存在于担子菌、半知菌和子囊菌等高等真菌中 ，主要用的是白腐菌，至今只发现一种细菌能分泌 漆酶 n降解木质素；与有毒的酚类物质作用 n纸浆的生物漂白，污水处理，生态修复剂 8、几丁质酶 n昆虫和大多数真菌的重要细胞结构成分 n细菌、放线菌、真菌等都可产生几丁质酶 三、 微生物酶的种类 9、医药与分析研究用酶 (1) 青霉素酰化酶 青霉素酰胺酶，青霉素氨基水解酶 细菌、放线菌、霉菌及酵母菌等 生产-内酰胺类抗生素中间体和半合成-内酰胺类抗生素 改变天然青霉素的侧链结构，使其具有抵御抗药性微生物- 内酰胺酶攻击的能力 (2) 溶栓酶 用于急性心肌梗死、脑血栓、静脉血栓塞等治疗 三、 微生物酶的种类 9、医药与分析研究用酶 (3) 超氧化物歧化酶(SOD) 由两个亚基组成的金属酶。Cu-SOD、Zn-SOD、Mn-SOD 和Fe-SOD等 酵母菌、细菌及霉菌等 治疗关节炎、类风湿关节炎等；防晒、防衰老及抗炎等 (4) 透明质酸酶 治疗关节损伤、关节周围炎症及膝外伤，传染性肝炎及肝硬 化等 用做药物扩散剂 四、 产酶微生物的来源 1、土壤中的产酶微生物 2、水体中的产酶微生物 3、空气中的产酶微生物 4、极端环境中的产酶微生物 1、 土壤中的产酶微生物 土壤是微生物生活的大本营，为微生物生长繁 殖及生命活动提供了各种条件 工业中广泛应用的许多产酶微生物就来源于土 壤。如枯草芽孢杆菌、假单胞菌、根霉、毛霉 和青霉等 2、 水体中的产酶微生物 水中溶解或悬浮的多种无机和有机物质，供给微生 物营养，使其生长繁殖 淡水：微球菌等 海洋：古生菌 (嗜盐菌)、细菌、真核类 目前，已商品化的嗜盐酶类都是限制性内切核酸酶 3、 空气中的产酶微生物 空气中没有微生物生长繁殖所需要的营养物质和充 足的水分，而且还有日光中有害的紫外线的照射， 因此，空气不是微生物生长的良好场所，但空气中 也漂浮着许多微生物 工业生产中所用的产酶微生物不从空气中进行筛选 4、 极端环境中的产酶微生物 极端环境下生长的极端微生物只能在很窄的温 度、pH等范围下生存 极端微生物有特殊的生理代谢类型，产生特殊 的酶，这些酶在极端的条件下具有活性和高度 的稳定性，具有很高的研究和应用价值 由于极端微生物的培养条件要求很高，无法进 行常规的工业发酵。需依靠在常温微生物菌体 内相应的基因表达来实现 第一节结束 微生物产酶的特点 产酶微生物的种类 微生物酶的种类 产酶微生物的来源 细菌 放线线菌 酵母菌 霉菌 产酶微生物概述 土壤 水体 空气 极端环境 第一节结束 n点击返回 第二节 微生物产酶的发酵工艺条件及控制 一、 产酶微生物的工业化要求及安全 性 二、 微生物酶的发酵生产 三、 发酵的影响因素及其控制 一、 产酶微生物的工业化要求及安全性 1、产酶微生物的工业化生产条件 2、产酶微生物的安全性要求 1、 产酶微生物的工业化生产条件 产酶量高，酶的性质符合要求，而且最好是分 泌型的胞外酶，以便于酶的提取 产酶菌不能是致病菌，在系统发育上与病原体 无关，不产生毒素 菌株稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体 能利用廉价原料，发酵周期短，易于培养，易 于提取 基因工程菌株必须符合安全性要求 2、 产酶微生物的安全性要求 酶制剂生产时需通过安全检查 医药和食品酶制剂需进行毒性试验 尚未在法规机构GRAS(公认为安全的)的食 品生产或加工的清单中的微生物，需申请 许可证 申请许可证须包括以下资料： n酶及其来源微生物的描述 n酶制备方法 n酶制剂的组成 n酶或微生物的毒理数据 申请许可证须包括以下资料： n酶及其来源微生物的描述 n酶制备方法： 培养基的完全组成；生产设备；发酵条件(通气、 搅拌、温度等) n酶制剂的组成 单一酶、复合酶或是整个细胞 杂质如重金属、溶剂痕迹或来源于生产过程中的其他化学物质 用于分析组成和杂质浓度的分析方法的细节 n酶或微生物的毒理数据 微生物必须是非致病性的 微生物一定不能产生真菌素或其他毒性化合物 微生物一定不能产生抗生素 二、 微生物酶的发酵生产 1、酶的发酵生产方法 2、培养基的配制 3、种子培养 4、微生物发酵产酶的一般工艺 1、 酶的发酵生产方法 (1) 固体培养法 (2) 液体培养法 1、酶的发酵生产方法 (1) 固体培养法 麸皮、米糠 + 其他成分 固体或半固体培 养基 灭菌 发酵 优点：设备简单；操作方便；酶浓度高；适于 霉菌培养 缺点：劳动强度大；原料利用率低；生产周期 长；规模小 1、酶的发酵生产方法 (2) 液体培养法 将液体培养基置于发酵容器中，经灭菌、冷却 后接入菌株进行发酵 目前酶发酵生产的主要方式 适于微生物，植物、动物细胞及工程菌的发酵 优点：机械化强度高；易于管理控制；生产效 率高、质量好；规模大 2、 培养基的配制 配制原则 营养丰富，浓度恰当 各组分理化性质稳定，不互相反应 黏度适中，有适当的渗透压 所用原料利于目的产物的生物合成 不影响通气和搅拌，不影响产物的分离精制和 底物处理 原材料因地制宜、质优价廉、成本低 3、种子培养 p又称种子制备，是指将处于休眠状态的生产菌 种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及 种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量纯 种的过程，它是发酵的第一道工序 p提供产量高、性能稳定、数量足且无杂菌污染 的生产种子 p从培养基、培养条件、种龄和接种量等方面控 制种子质量 4、微生物发酵产酶的一般工艺 试管菌种培养 茄瓶菌种培养 孢子(菌体)悬液制备 种子罐菌种培养 发酵罐发酵 发酵液预处理酶的分离纯化精制 摇瓶菌种培养 三、 发酵的影响因素及其控制 1、 温度 2、 pH 3、 溶解氧 4、 基质浓度 5、 泡沫 6、 发酵终点判断 1、 温度 p影响酶催化反应速度和蛋白质性质；影响发酵液 的物理性质(如黏度、基质和氧的溶解度和传递速率、 基质的分解和吸收速率等) 细菌发酵产酶的最适温度往往低于最适生长温度 控制： u在不同发酵产酶阶段控制不同的温度条件 u控制方法：热水升温；冷水降温 2、 pH p影响酶蛋白的解离度和电荷情况，改变酶的结构和功能 ，引起酶活性的改变 p影响细胞对基质的利用速度和细胞的结构，以至影响菌 体的生长和产物的合成 p影响细胞膜的电荷状况，引起膜通透性发生改变，从而 影响细胞对营养物质的吸收和代谢产物的形成 控制： u改变培养基的基础配方 u直接补加酸或碱 u添加生理酸性物质(NH4)2SO4和碱性物质(氨水) u补料 3、 溶解氧 p临界氧浓度 (C临) p溶解氧浓度 C临时，造成浪费；抑制某些酶的生成；损 伤细胞 控制： u供氧 提高氧分压；增加通气量；延长气液接触时间；增加气液比表 面积；改变培养液的性质；添加氧载体 u需氧 限制培养液中的营养成分，减少细胞生长速率；降低培养温度 4、 基质浓度 p培养基营养成分过低，影响菌体生长和酶的形成 p培养基过于丰富，菌体生长过盛，发酵液黏稠， 传质差，不利于酶的合成，阻遏产物的形成 控制： u中间补料培养 补料分批培养(半连续培养) 连续培养 补料内容：C源和能源；N源；微量元素或无机盐；酶的诱导底物 5、 泡沫 p减少发酵罐的装料系数 p减少氧传递系数 控制： u筛选不产流态泡沫的菌种 u调整培养基中的营养成分，或改变某些理化参数 、发酵工艺来控制 u采用机械消沫或消泡剂 6、 发酵终点判断 p原则：高产量，低成本 p考虑因素 最低的成本获得最大的生产能力 产品质量 不同发酵过程有不同的特点，个别进行分析 第二节结束 产酶微生物的工业化要 求及安全性 微生物酶的发酵生产 发酵的影响因素及其控 制 工业化生产条件 安全性要求 微生物产酶的发酵 工艺条件及控制 温度 pH 溶解氧 基质浓度 泡沫 发酵终点判断 酶的发酵生产方法 培养基的配制 种子培养 微生物发酵产酶的一般工艺 第二节结束 n点击返回 第三节 植物细胞培养产酶的特性、工艺条件 及控制 一、 植物细胞培养产酶的特点 二、 植物细胞培养产酶的工艺条件 三、 培养的影响因素及其控制 一、 植物细胞培养产酶的特点 优点 (1) 可以在人为控制条件下进行物质生产，克 服人工栽培的不足 (2) 提高产率 (3) 提高产品质量 缺点 (1) 对剪切力敏感 (2) 发酵周期长 二、 植物细胞培养产酶的工艺条件 1、 植物细胞的培养方法 2、 培养基的配制 3、 植物细胞培养的一般工艺 1、 植物细胞的培养方法 悬浮细胞培养 细胞株的建立 扩大培养 大罐培养 分批培养法 半连续培养法 连续培养法 2、 培养基的配制 与微生物培养基有较大的差别 (1) 需大量的无机盐。除了P、S、N、K、Na、Ca、Mg 等大量元素外，还需要Mn、Zn、Co、Mo、Cu、 B、I等微量元素 (2) 需维生素和植物生长激素。如硫胺素、吡哆素、烟 酸、肌醇、生长素、分裂素等 (3) 氮源一般为无机氮源。即可以同化硝酸盐和铵盐 (4) 一般以蔗糖为碳源。蔗糖浓度一般为2%5% 3、植物细胞培养的一般工艺 外植体 细胞的获取 细胞培养 分离纯化 产物 三、 培养的影响因素及其控制 1、 温度 2、 pH 3、 溶解氧 4、 光照 5、 前体的添加 6、 诱导因子的应用 (控制在室温范围，2035) (微酸性，5.06.0) (通风或搅拌供给) 4、 光照 p多数植物细胞生长以及次级代谢的生产需光照 ，并对光强度和光照时间有要求 p少数植物次级代谢的合成受光抑制 控制 u根据植物细胞的特性，及目的次级代谢物的种 类不同，进行光照的调节控制 5、 前体的添加 p目的代谢物代谢途径上游的物质 u添加目的代谢物的前体，能提高植物细胞培养 生产次级代谢物的产量 例：在培养辣椒细胞生产辣椒胺的过程中，添加苯丙 氨酸作为前体，可以全部转变为辣椒胺。添加香草酸 和异葵酸作前体，亦可显著提高辣椒胺的产量。 6、 诱导因子的应用 p目的代谢物代谢途径上游的物质 u添加诱导因子可提高次级代谢产物的产量，并 促进产物分泌到培养基中 例：紫杉醇的细胞工程中，加入灭活的壳囊孢菌菌丝 体和青霉菌的孢子，或硫酸钒等，可促进短叶红豆杉 的悬浮细胞生长，并分泌更多的紫杉醇。 第三节结束 植物细胞培养产酶的特 点 植物细胞培养产酶的工 艺条件 培养的影响因素及其控 制 植物细胞培养产酶的特 性、工艺条件及控制 温度 pH 溶解氧 光照 前体的添加 诱导因子的应用 植物细胞的培养方法 培养基的配制 植物细胞培养的一般工艺 第三节结束 n点击返回 第四节 动物细胞培养产酶的特性、工艺条件 及控制 一、 动物细胞培养产酶的特点 二、 动物细胞培养产酶的工艺条件 三、 培养的影响因素及其控制 一、 动物细胞培养产酶的特点 主要用于生产：疫苗、激素、多肽生长因子、酶、单 克隆抗体、非抗体免疫调节剂等功能蛋白质 特点 动物细胞没有细胞壁，细胞适应环境的能力差，十分脆弱 体积比微生物细胞大几千倍，稍小于植物细胞的体积 细胞生长缓慢，易受微生物污染，培养时需要抗生素 培养过程需氧量少，且不耐受强力通风和