《酶和细胞的固定化》PPT课件.ppt

第三章 酶和细胞的固定化 Chapter 3 immobilized enzyme and cell l酶的催化具有高选择性、高催化活性、反应条 件温和、环保无污染等特点。但游离状态的酶 对热、强酸、强碱、高离子强度、有机溶剂等 稳定性较差，易失活，并且反应后混入底物等 物质，纯化困难，不能重复使用。 历史简介 l1916年Nelson和Griffin首先发现了酶的固定 化现象，从此科学家就开始了固定化酶的研究 工作。1969年日本一家制药公司第一次将固定 化的酰化氨基酸水解酶用来从混合氨基酸中生 产L-氨基酸，开辟了固定化酶工业化应用的新 纪元。 l已经显示固定化酶将在现代酶工程以及整个生 物工程中占有重要作用，它在应用上和理论上 的巨大潜力引起了生物化学、微生物学、医学 、化学工程和高分子等领域的各类研究人员的 广泛关注。 主要讲授内容 l一、固定化酶(细胞)的制备 l二、固定化酶(细胞)的性质和指标 l三、固定化酶和固定化细胞的反应器 l四、酶工程在医药工业中的应用 一、固定化酶(细胞)的制备 l1. 传统的酶固定化方法 l2. 新型的酶固定化方法 l3. 固定化细胞的方法 l4. 固定化酶常用的载体材料 1. 传统的固定化酶的方法 l传统的固定化酶的方法为载体结合法，大致可 分为： 吸附法 交联法 包埋法 其他方法 载体结合法 l载体结合法是将酶结合于不溶性载体上的一种 固定化方法。根据结合形式的不同，可分为物 理吸附法、离子结合法和共价结合法三种形式 。 l物理吸附法：是利用酶和载体间的非特异性物 理吸附作用将酶固定在载体表面，这些物理吸 附作用包括范德华力、氢键、疏水作用、静电 作用等。 物理吸附法的优缺点 l优点：条件温和，工艺简便，载体选择范围很 大，吸附时既可实现酶的固定化又可以达到纯 化的目的，吸附后酶的构象变化较小或基本不 变，因此对酶的催化活性影响小。 l缺点：但酶和载体之间结合力弱，pH、温度 、离子强度等条件的变化都易使酶从载体脱落 ，并且污染催化反应产物。 离子结合法 l离子结合法是酶通过离子键结合于具有离子交 换基的水不性载体上的固定化方法。此法的载 体有多糖类离子交换剂和合成高分子离子交换 树脂，如DEAE-纤维素、AmberliteCG-50、 XE-97和Dowex-50等。 DEAE二乙胺基乙基 离子结合法的优缺点 l离子结合法优点操作简单，处理条件温和，酶 的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破 坏，能得到酶活回收率较高的固定化酶。 l缺点是载体和酶的结合力较弱，容易受缓冲液 种类或pH的影响，在离子强度较高的条件下 进行反应时，往往会发生酶从载体上脱落的现 象。 共价结合法 l共价结合法是酶以共价键结合于载体上的固定 化方法，即将酶分子上非活性部位功能团与载 体表面反应基团进行共价结合的方法。一般先 用化学方法将载体活化，再与酶分子表面的某 些基团如羧基、氨基、羟基等反应，形成共价 键。 共价结合法的优缺点 l共价结合法所得的固定化酶与载体结合比较牢 固，有良好的稳定性及重复使用性，成为目前 研究最为活跃的一类酶固定化方法。但该法较 其他固定方法反应剧烈，固定化酶活性损失更 加严重。 交联法 l交联法是利用双功能或多功能交联试剂，在酶 分子和交联试剂之间形成共价键的酶的固定化 方法。采用不同的交联条件和在交联体系中添 加不同的材料，可以产生物理性质各异的固定 化酶。 l交联法与共价结合法一样也是利用共价键固定 酶，所不同的是它不使用载体。交联法制备较 难，酶活损失较大，一般作为其他固定化方法 的辅助手段。常用的双功能试剂有戊二醛、己 二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等，其中应用 最广泛的是戊二醛。 包埋法 l包埋法是载体与酶溶液混合后，借助引发剂进 行聚合反应，通过物理作用将酶限定在载体的 网格中，从而实现酶固定化的方法。该法条件 温和，基本上不涉及酶的构象及酶分子的化学 变化，因而酶活力回收率较高。 包埋法的缺点 l但包埋法固定化酶易泄漏，常存在机械强度差 、扩散受限制、传质阻力较大等问题，不宜催 化大分子底物的反应。常用的载体主要有明胶 、聚酰胺、琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺、光交 联树脂、海藻酸钠、火棉胶等。 l包埋法可分为两种 ： 网格型 微囊型 l将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中的称 为网格型，常用的高分子化合物有聚丙烯酰胺 、聚乙烯醇和光敏树脂等合成高分子化合物， 以及淀粉、明胶、海藻胶和角叉菜胶等天然高 分子化合物。 l将酶和细胞包埋在高分子半透膜中的称为微囊 型，颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物 与产物的扩散，但反应条件要求高，制备成本 也高。 l传统的酶固定化方法的缺点： 酶在任意位点与载体进行连接，使酶活性位点 不能充分暴露，而且酶的固定化量降低，因此 定向固定化酶技术将成为今后固定化酶研究的 热点。 2. 新型的酶固定化方法 l新型的酶的固定化方法，要在较为温和的条件 下进行，尽量减少或避免酶活力的损失，并提 高固定化效率。通过辐射、光、等离子体、电 子、“柔性链”等新方法均可制备高活性固定化 酶。 l如光偶联法是以光敏性单体聚合物包埋固定化 酶或带光敏性基团的载体共价固定化酶，由于 条件温和，可获得酶活力较高的固定化酶。 l等离子体是高度激发的原子、分子、离子以及 自由基的聚集体，大量的等离子体常在室温下 存在。载体材料表面可以用等离子体进行修饰 ，从而引入活性基团。 l偶合（耦合）固定化也是新近发展起来的一种 酶固定化方法，基本上能够解决单一固定化方 法酶活回收率低、稳定性差、传质阻力大等问 题，并具有方法多样、操作简便、技术成熟等 特点。 l从较早的吸附交联法、包埋交联法开始， 偶合固定化技术已经得到越来越多的应用，先 后提出并研究了包埋吸附法、絮凝吸附法 、吸附交联法、膜吸附法等方法。 l无载体固定化酶直接利用交联剂交联溶解酶、 晶体酶、物理聚集酶和喷雾干燥酶而形成交联 溶解酶、交联酶晶体、交联酶聚集体和交联喷 雾干燥酶等4种无载体酶系统。 l与传统固定化酶相比，无载体酶具有以下一些 优点：催化活性高，成本低；具备较高的 催化剂比表面；可加入多种酶；底物扩散 受限较少；在极端条件、有机溶剂和蛋白酶 中的稳定性较高。 l此外，研究人员还开发了一些定向固定化的方 法，如利用酶和抗体之间的亲和性、酶和金属 离子形成复合物、通过酶分子上的糖基部分固 定化、用分子生物学方法使酶定向固定化等。 3. 固定化细胞的方法 l细胞的固定化主要是活细胞的固定化，是一种 不用载体的工艺。通过化学的或物理的手段， 使整个细胞彼此附着相连。 化学交联 l化学交联是指细胞体借助双功能或多功能试剂 ，如醛或胺的共价附着相连。固定含L-天门冬 氨酸解氨酶(天门冬氨酸酶)活性的大肠杆菌细 胞，它们是通过应用双功能试剂(戊二醛，以 及甲苯二异氰酸酯)来强化细胞壁或细胞膜的 交联。 物理交联 l用絮凝法进行细胞的物理交联，在固定化细胞 的应用中有很大潜力。使用种类不同的絮凝剂 ，可促进细胞凝聚。这些絮凝剂，包括阳离子 聚合电解质和阴离子聚合电解质以及金属化合 物。 絮凝剂 l阳离子聚合电解质，如聚胺、聚乙烯亚胺和阳 离子聚丙烯酰胺；阴离子聚合电解质，如羧基 取代的聚丙烯酰胺、聚苯乙烯磺酸盐、聚羧酸 ；以及金属化合物，如Mg（II）、Ca（II）、 Fe（III）、Mn（II）的氧化物、氢氧化物、硫 酸盐、磷酸盐。 l除了化学交联法外，还有载体粘合法、凝胶体 截留法和金属螫合法等多种。 l载体粘合法，是将融合整细胞粘合到支撑体表 面，根据整细胞粘合的方式，又可分为吸附、 螯合和共价结合三种。用此法固定细胞时，应 注意选择载体及粘合方法。载体有有机载体和 无机载体两种。粘合方法最常用的是吸附法， 它简单、温和、细胞存活率高。 l截留法是在一种压紧的结构内将细胞滞留。这 种结构牢固得足以阻止细胞漏出，同时能让基 质渗入和产物扩散。这种方法与交联法和粘合 法的区别，在于生物催化剂本身不和凝胶本体 或膜联结。这种方法已广泛应用于截留各种生 物大分子、整细胞以及大小不同、性质相异的 细胞器。 4. 常用的固定化酶载体材料 l固定化酶载体材料的性能要求 l固定化酶载体材料 固定化酶载体材料的性能要求 l载体材料对固定化酶的性质影响非常大。尽管 到目前为止，人们没有找到一种合适的材料可 以担当起所有的固定化载体，但是材料的下述 性能可作为选择合适的酶载体材料时的考察要 点。 l(1) 功能基团：一般来说，载体材料带有能与 酶发生反应的官能团，如带有-OH、-COOH 、-CHO等反应性基团，则可大大提高载体材 料与酶之间的结合力，同时亦可提高固定化酶 的操作性和稳定性。 l l(2) 渗透性和比表面积：好的载体材料应具有 大的比表面积和多孔结构，因为具有这样结构 的载体材料易和酶相交联，并可提高固定化率 。 l(3) 溶解性：一般来说，载体材料要求是不溶 于水的。这不仅可以防止酶失活，还可以防止 酶受到污染。 l l(4) 机械刚性及稳定性：这些对载体材料非常 重要，由于固定化酶的一个最大的特点是要能 重复使用，这就要求载体材料的机械刚性和稳 定性都非常好。 l(5) 组成和粒径：一般来说，材料的孔径越小 ，其比表面积就越大，与自由酶固定化程度就 越高，固定化率也就越高。 l (6) 对微生物的抵抗性：在长时间的使用中， 载体材料必须要能防止微生物的降解作用，对 微生物抵抗性好的载体材料可以长时间的使用 。 l(7) 经济性和环保：来源经济、丰富，无毒、 可降解。 固定化酶载体材料 l从载体材料的组成来看，固定化酶所使用的载 体可以分为高分子载体、无机载体、复合载体 以及新型载体等。 高分子载体 l高分子载体又可以分为天然高分子载体和合成 高分子载体材料。 天然高分子载体材料 l天然高分子载体材料如结构性蛋白(角质、胶 原蛋白)、球状蛋白以及碳水化合物由于原料 易得，都比较适合担当酶的载体材料。此类材 料最大的特点是无毒性，传质性能好。 l研究得较多的载体是壳聚糖和海藻酸钠。由于 天然高分子材料存在强度较低，在厌氧条件下 易被微生物所分解，使用寿命较短，而且天然 高分子材料原料来源往往受产地所限，这在一 定程度上限制了其应用。 合成有机高分子材料 l合成有机高分子材料由于其化学、物理性能都 有很大的可变性，从理论上来说，可以担当任 何一种酶的固定化载体，而且它们对微生物的 腐蚀也有较强的抵抗力。另外，与天然高分子 材料相比，合成有机高分子凝胶载体还有强度 较大的优点。 无机载体 l无机载体具有一些有机材料不具备的优点，如 稳定性好、机械强度高、对微生物无毒性、不 易被微生物所分解、耐酸碱、成本低、寿命长 等。常见的无机载体材料有玻璃、硅凝胶、铝 、蒙脱土等。 复合载体 l复合载体是以有机材料和无机材料复合组成的 新载体材料。如磁性高分子微球，其内部含有 磁性金属或金属氧化物的超细粉末，从而具有 磁响应性。 l磁性高分子微球可以通过共聚、表面改性等化 学反应在微球表面引入多种反应性功能基团， 也可以通过共价键来结合酶、细胞、抗体等生 物活性物质，在外加磁场的作用下，进行快速 运动或分离。 l与其他载体材料相比，磁性高分子微球作为固 定化载体具有从反应体系中易分离和回收、操 作简便、成本较低等诸多优点，因此引起了国 内外学者的广泛关注。 新型载体 l设计新型载体并结合当代高新技术，是固定化 酶研究的一个新方向。如导电聚合物作为酶固 定化载体时可用于酶电极类生物传感器的制备 。当光敏性单体聚合物包埋固定化酶或带光敏 性基团的载体共价固定化酶时，反应条件温和 ，固定化酶的酶活力较高。 主要讲授内容 l一、固定化酶(细胞)的制备 l二、固定化酶(细胞)的性质和指标 l三、固定化酶和固定化细胞的反应器 l四、酶工程在医药工业中的应用 二、固定化酶(细胞)的性质和指标 l1. 固定化后酶活力的改变 l2. 固定化对酶稳定性的影响 l3. 固定化酶的最适温度变化 l4. 固定化酶的最适pH变化 l5. 固定化酶的米氏常数(Km)变化 l6. 固定化酶(细胞)的指标 l游离的酶经固定化后，酶本身的结构会受到影 响。由于它的催化作用由均相转到非均相，由 此带来的扩散限制效应、空间障碍、载体的分 配效应等因素必然影响到酶的性质。 1. 固定化后酶活力的改变 l在多数情况下，酶固定化后的活力比天然酶小 ，其专一性也会发生改变。例如，用羧甲基纤 维素做载体固定的胰蛋白酶，对高分子底物酪 蛋白只显示原酶活力的30，而对低分子底物 苯酞精氨酸对硝基酰替苯胺的活力保持80 。 l所以，一般认为高分子底物受到空间位阻的影 响比低分子底物大。 l在相同测定条件下，固定化酶的活力低于等摩 尔原酶的活力，其原因可能是： l 酶分子在固定化过程中，空间构象会有所 变化，甚至影响了活性中心的氨基酸； l 固定化后，酶分子空间自由度受到限制(空 间位阻)，会直接影响到活性中心对底物的定 位作用； l 内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近 受阻； l 包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分 子底物不能透过膜与酶接近。 l不过也有例外，酶在固定化后反而比原酶活力 提高，原因可能是偶联过程中酶得到化学修饰 ，或固定化过程提高了酶的稳定性。 2. 固定化对酶稳定性的影响 l稳定性关系到固定化酶能否实际应用。在大多 数情况下，酶经过固定化后其稳定性都有所增 加，这是十分有利的。 l具体表现在以下三个方面： （1）热稳定性提高 l作为生物催化剂，酶也和普通化学催化剂一样 ，温度越高，反应速度越快。但是大多数酶是 蛋白质组成的，一般对热不稳定。因此，不能 在高温条件下进行反应，而固定化酶耐热性提 高，使酶最适温度提高，酶催化反应能在较高 温度下进行，加快反应速度，提高酶作用效率 。 （2）对有机试剂及酶抑制剂的稳定性 提高 l酶经过固定化后，提高了对各种有机溶剂的 稳定性，使本来不能在有机溶剂中进行的酶 反应成为可能。可以预计，今后固定化酶在 有机合成中的应用会进一步发展。 （3）对pH、蛋白酶、贮存和操作条件的稳 定性提高 l固定化酶稳定性提高的原因可能有：固定化 后酶分子与载体多点连接，可防止酶分子伸展 变形；酶活力的缓慢释放；抑制酶的自降 解。将酶与固态载体结合后，由于酶失去了分 子间相互作用的机会，从而抑制了降解。 3. 固定化酶的最适温度变化 l酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的 综合体现。由于固定化后，酶的热稳定性提高 ，所以最适温度也随之提高，这是非常有利的 结果。 4. 固定化酶的最适pH变化 l酶的催化能力对外部环境特别是pH非常敏感 。 l酶固定化后，对底物作用的最适pH和酶活力- pH曲线常常发生偏移。曲线偏移的原因是微 环境表面电荷性质的影响。 l一般说来，用带负电荷载体(阴离子聚合物)制 备的固定化酶，其最适pH较游离酶偏高。 原因的解释 l这是因为多聚阴离子载体会吸引溶液中阳离子 ，包括H+，使其附着于载体表面，结果使固定 化酶扩散层H+浓度比周围的外部溶液高，即偏 酸，这样外部溶液中的pH必须向碱性偏移， 才能抵消微环境作用，使其表现出酶的最大活 力。 l反之，带正电荷载体(阳离子聚合物)制备的固 定化酶，其最适pH较游离酶偏低。使用带正 电荷的载体其最适pH向酸性偏移。 5. 固定化酶的米氏常数(Km)变化 l固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性 能有一定的变化。 l当酶结合于电中性载体时，由于扩散限制造成 表观Km上升； l但是带电载体和底物之间的静电作用会引起底 物分子在扩散层和整个溶液之间不均一分布。 l由于静电作用，与载体电荷性质相反的底物在 固定化酶微环境中的浓度比整体溶液中的高， 与溶液酶相比，固定化酶的表观Km值低于溶 液的Km值； l而载体与底物电荷相同，则会造成固定化酶的 表观Km值显著增加。 l由于高级结构变化及载体影响引起酶与底物亲 和力变化，从而使Km变化。 l这种Km变化又受溶液中离了强度影响。离子 强度升高，载体周围的静电梯度逐渐减小， Km变化也逐渐缩小以至消失。 6. 固定化酶(细胞)的指标 l游离酶制备成为固定化酶后，其催化功能也由 原来的均相体系反应变为固液相不均一反应 ，酶的催化性质会发生改变。因此制备固定化 酶(细胞)后，必须考察它的性质。常用的评估 指标包括固定化酶(细胞)的活力、固定化酶(细 胞)的偶联率以及相对活力、固定化酶(细胞)的 半衰期以及热稳定性。 固定化酶(细胞)的活力 l是指固定化酶(细胞)催化某一特定化学反应的 能力，其大小可用在一定条件下它所催化的某 一反应的反应初速度来表示。固定化酶(细胞) 的单位可定义为每毫克干重固定化酶(细胞)每 分钟转化底物(或生产产物)的量，表示为 mol/(minmg)。 l与游离酶相仿，表示固定化酶的活力一般要注 明下列条件： l温度、搅拌速度、固定化酶的干燥条件； l固定化的原酶含量或蛋白质含量 l用于固定化酶的原酶的比活力。 l固定化酶的活力回收是指固定化后的固定化酶 (或细胞)所显示的活力占被固定的等当量游离 酶(细胞)总活力的百分数。 l固定化酶的活力回收计算公式如下： 活力回收= 固定化酶总活力(加入酶的总活力上清液 中未偶联酶活力)100 l固定化