毕业论文（综述）微粒体甘油三酯转运蛋白MTP研究进展.doc

微粒体甘油三酯转运蛋白MTP的研究进展摘 要：微粒体甘油三酯转运蛋白（microsomal triglyceride transfer protein, MTP）首先是从牛肝细胞微粒体碎片中分离获得的。它的主要作用是加速甘油三酯（TG）、胆固醇酯（CE）和磷脂硫胆碱（PC）的转运和细胞或亚细胞膜的生物合成。它被认为在富含甘油三酯的脂蛋白极低密度脂蛋白（VLDL）和乳糜微粒（CM）的组装过程中扮演重要的角色。根据近几年的研究进展，本文就其结构和功能、活性、调节、多态性及其表达等方面做一综述。关键词：微粒体甘油三酯转运蛋白；活性；多态性; 表达微粒体甘油三脂转移蛋白（MTP）是一种独特的脂质转移蛋白，在富含apoB（载脂蛋白B）的脂蛋白合成和分泌中起着重要作用，主要存在于内质网中，后来在肠上皮细胞的刷状缘黏膜囊泡中也分离到 MTP，MTP 通过穿梭机制催化甘油三酯(TG) 、胆固醇酯(CE)和磷脂酰胆碱在磷脂表面的转运。MTP 首先从牛肝细胞微粒体碎片中分离获得的,随后又在小肠组织分离出 MTP ,在鼠的肝脏、肠黏膜同样能分离到 TG 和胆固醇转运活性,这种活性存在于微粒体囊泡中,是继载脂蛋白B (apolipoprotein B , apoB) 之后发现参与 TG 转运及极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein , VLDL ) 组装的内质网腔内蛋白,是一种重要的脂质转运蛋白。MTP 是含有大小两个亚基的异源二聚体,其主要的生理功能是将内质网外的中性脂质转运至内质网腔,参与新合成的apoB100分子脂化的第一步,进而形成新生的脂蛋白颗粒,并在调节 VLDL 组装和分泌中发挥主要作用。肝脏 MTP 的活性、基因表达状态是控制 VLDL 合成、装配和分泌速率的重要因素。因此,研究 MTP 基因结构和功能、活性、调节、多态性、表达等对预防脂肪肝,提高家畜家禽生产品质和性能有重要意义。 1 MTP 的结构和功能1.1 MTP 的结构MTP 和 APOB 的N端的序列与卵黄脂蛋白有同源性。卵黄磷脂蛋白是蛋黄中主要的脂蛋白复合体,Banaszak 认为其结构是由三个折叠(A、C、N) 和一个螺旋区构成。基于序列上的同样性,可以推测卵黄磷脂蛋白、MTP 和 APOB 可能在结构上相似,用Clustal W程序检测这些蛋白之间序列的同源性(Hussain M M, et al, 2003),可以推测MTP 包含了三个折叠(A、C、N) 和一个螺旋区,APOB17 包含N和C折叠和一个螺旋区,这些结构比较表明螺旋区在三个蛋白中是最保守的,主要不同的是A折叠区,它在 MTP 和 APOB 中都缺乏,在 MTP 的M亚基中A折叠的切断可形成一个比卵黄磷脂蛋白更大的空间,这就解释了MTP比卵黄磷脂蛋能够与更多的脂分子结合,然而 APOB 包含了其他疏水性的C折叠,因此暗示它能与膜关联起来。1.2 MTP 的功能1.2.1 MTP 的脂转运 Wetterau等实验表明 MTP 可以通过一种穿梭机制在囊泡之间(小单层囊泡(SUV) 和 LDL 及 HDL 之间) 增加脂质的转运(Atael A and Wetterau J R, 1994)。在这种机制中 MTP 先从一个膜上提取脂肪粒,然后将其转运到另一个膜上。 在提取和转运过程中, MTP 可以暂时的与供体和受体接触。据报道 MTP 在有中性电荷膜存在的时候,有最佳的脂转运活性,当膜上有负电荷时,则 MTP 的转运活性降低（Hussain M M, et al, 2003）。其动力学研究表明 MTP 有两个脂的结合位点,即一个可能与脂的转运有关的快点;一个可能与膜的关联有关的慢点。另外 MTP 转运活性在脂蛋白的组装和分泌中也很重要。首先脂转运活性的缺陷与无脂蛋白血症患者血浆中载脂蛋白(APOB)是息息相关的;其次，APOB 和 MTP 在非肝细胞和非肠细胞中的协同表达,可以导致 APOB 的分泌(此细胞是不组装脂蛋白的)；最后 MTP 的抑制因子减少体外脂转运活性,从而降低 APOB 的体内分泌。1.2.2 ER内膜中的脂滴的形成和稳定化研究表明 MTP 可能将 TG 转运到内质网(endo2 plasmic reticulum , ER)内膜(叶健强，蒋立,王继文，2005)。缺乏 MTP 则与 ER 内膜上脂滴的缺乏有关,抑制 MTP 的活性则会降低内膜上的 TG 的含量。同样,MTP 也可以稳定的与囊泡结合。由此,可以推测 MTP 可能对在ER中内膜上 TG 的输入和脂滴的形成和稳定化起了关键作用。1.2.3 与 APOB 结合实验表明 APOB 和 MTP 之间存在一些生理生化关系。Patel等用共免疫沉淀技术开发了一种固液交互阶段的结合实验来表明二者之间的关系,实验中 MTP 被固定起并且用高浓度的 LDL 来温浴,然后用酶联免疫实验技术来量化和 APOB 结合起的 LDL（Mann C J, et al, 1999）。结果表明人类的 LDL 和 MTP 有高度的亲和力。为鉴定在这反应中的氨基酸残基,在 LDL 上作了一些化学修饰,结果用氨基乙酸甲基脂来修饰的氨基酸残基对于 APOB 和 MTP 结合没有影响;而用乙酰乙酰辅酶A修饰的精氨酸残基可以彻底消除与 MTP 的结合。更重要的是,若是使修饰过的精氨酸残基和赖氨酸残基恢复则可以全部恢复与 MTP 的结合,这些表明赖氨酸、精氨酸残基对 APOB 与 MTP 结合是很重要的。1.3 结构和功能 MTP 有三种功能和四种结构亚基,N、A、C折叠和一个螺旋区, Shoulders 研究表明不同的结构基序可能一起协同形成 MTP 的功能区域,所以推测脂转运区可能是由A和C折叠所包围,螺旋区和N折叠可能包含 APOB 结合区,认为N和A折叠区可能形成膜关联区。同时有学者提出不同区域之间的功能独立性这个假设。脂转运活性的抑制因子不能影响 APOB - MTP 的结合,APOB - MTP 结合的抑制因子对 MTP 的脂转运活性不起作用,因此表明这些是功能相对独立的区域。APOB - MTP 的修饰结合是通过脂质提供依据来说明 APOB 和膜的结合, 表明 MTP 与脂质的结合可以提高 MTP - APOB 的结合,但现在还不知道是否与脂质结合作用会影响 MTP 的转运活性,这仍然需要进一步探讨和研究。2 MTP 的活性研究发现,在相同的亚细胞区域内,MTP、PDI 及 MTP 和 apoB 有共同域化现象,说明 MTP、PDI 和 apoB 有相同或相似的功能（徐闯等，2004）。MTP单独表达在昆虫 sf9 细胞时,MTP 没有活性,而与 PDI 一起表达时才有活性。说明 PDI 对于 MTP 功能的实现和组成的完整是非常重要的。PDI 和 MTP 分子结合时,它的活性只有游离PDI 的1/ 10 ,而当 PDI 从 MTP 分子分离后,其活性增加。PDI 活性中心位于3540 和375384 两段氨基酸残基处。但也有报道认为,PDI 的活性在 MTP 促进 apoB 与甘油三酯的结合过程中不起作用, PDI 在 MTP 功能的实现上不发挥作用。因此, PDI 在大量超过 MTP 其他亚基的情况下,游离 PDI 的作用还需要研究。除 PDI 已有的酶功能外,有关 PDI 的其他功能还有待进一步研究。3 MTP 的调节3.1 细胞内毒素及细胞因子对 MTP 的调节 细胞内毒素(脂多糖、LPS)和细胞因子I型白细胞介素(IL21)和肿瘤坏死因子( TNF)显著减少仓鼠肝脏 MTP mRNA 水平。这一效应只需要几小时。并且,IL21 和 IL26 显著减少 Hep G2 细胞内 MTP mRNA 水平。这一效应非常明显,在低剂量(0.1ng/ml)给药8h后效应出现。延长细胞因子对 Hep G2 细胞的处理后,MTP 活性和 MTP 大亚基水平也有所减少。IL21减少了 MTP 一个增强子的表达,相应地减少了 MTP mRNA ,这说明在减少 MTP 基因表达方面,转录调节起着主要作用。MTP 启动子的敲除分析证明,上游-121到-88编码序列是 IL21 的调节位点。这个区域包括一个胰岛素响应元件(IRE) 、活化蛋白(AP21)、肝核因子I(HNF21)和肝核因子IV(HNF24)的共同序列。IRE 和 HNF24 位点的突变不影响 IL21 的作用。但是,AP21 和 HNF21 位点的突变导致 MTP 表达量的显著减少和丢失了 IL21 的效应,表明完整的 AP21 和HNF21 调节单元对于 IL21 调节 MTP 基因的表达起决定性作用。延长 IL21 的作用没有改变 Hep G2 细胞内 apoB 的合成,表明 MTP mRNA 的下降不会显著地影响细胞因子介导的脂质代谢(Navasa M , et al, 1998)。3.2 胰岛素、胰高血糖素、油酸盐和葡萄糖对 MTP 的调节在 Hep G2 细胞中,胰岛素(10M)和高水平的葡萄糖(30M)减少 MTP 大亚基 mRNA 水平,胰高血糖素和油酸盐对 MTP mRNA 水平没有影响。胰岛素效应的产生是有时间和剂量的依赖性,并且受到胰岛素受体调节。另外,胰岛素也小范围减少了 PDI mRNA 水平。由于 MTP 较慢的合成率(4.4d) ,短期的胰岛素处理(24h)不改变 MTP mRNA 水平,说明在 Hep G2 细胞中胰岛素调节 MTP mRNA 水平与胰岛素急性抑制 apoB 的分泌是不相关的。在 He2p G2 细胞中 MTP mRNA 水平对胰岛素非常敏感,但要想影响 MTP 蛋白的水平需要持续地改变 MTP mRNA 的水平,也就是要持续改变胰岛素的浓度。3.3 影响 MTP 的其他因素丙型肝炎病毒(HCV)核蛋白对 MTP 活性的影响。肝脏脂肪变性是HCV感染的特点之一。体内转基因模型试验证实,肝脏过量表达 HCV 核蛋白会影响 VLDL 的组装和分泌。核蛋白的表达导致 MTP 活性的降低和新合成的 VLDL 颗粒的改变,但不影响 MTP 和 PDI 的生成。肝脏 apoAII 的表达减少了肝脏内核蛋白聚集和阻止 HCV 对 VLDL 生成的作用(Perlemuter G, et al, 2002)。黄酮类化合物柑桔素和陈皮素对 MTP 的调节作用:在油酸处理的 Hep G2 细胞中,它们可减少脂酰辅酶A胆固醇脂酰转移酶和 MTP 的活性及表达从而起到对 MTP 水平的调节(Borradaile N M , et al, 2002)。4 MTP 的多态性 MTP 启动子区493位点上的单碱基突变(-493G/T)，即 MTP 增强子基因的多态性能够影响 MTP 表达活性,影响血浆低密度脂蛋白(low density lipoprotein ,LDL)和 VLDL 水平。这种多态性通过影响核蛋白的特异性等位基因联合而调整 MTP 转录活性,影响VLDL 的合成来起作用。这一突变是发生在编码序列后的第493bp处的G/T突变,MTP 大亚基增强子的突变影响了其与脂蛋白空间构象的结合。同时这也说明 MTP 在 LDL 家族性高胆固醇血症临床症状的表现形式上起着重要的作用（孙玉成等，2005）。MTP 基因多态性也给人们提供了从基因水平上调节心血管疾病危险因素发生的可能性（黎荣山等，2005）。Stpierre J等研究发现 MTP2493G/T 多态性对冠心病的危险有深远的影响。Gambino R 等报道,MTP 基因多态性与型糖尿病患者肝脂肪变性的生物学特性明显相关,在 MTP 基因转录中G等位基因减少可造成肝内 TG 含量增加,从而说明肝脂肪变性有基因易感性(Stpierre J , et al, 2002)。5 MTP 的表达 MTP 的表达主要在肝脏和小肠,此外在睾丸、卵巢、肾脏和心脏中也有表达。对人和仓鼠 MTP 基因表达研究显示85bp123bp区域对于表达是关键的,含有肝细胞特异因子(hepatocyte nuclear factor , HNF21、HNF24)和活化蛋白(activating protein ,AP21) 的识别序列。 HNF21 和HNF24 调节许多肝脏特异性基因的表达, HNF24 是包括 apoA2-、apoC- 和 apoB 在内的脂蛋白代谢基因的主要活性因子。启动子还含有一个胆固醇正反应元件,位于人、仓鼠肝细胞160bp180bp区域;一个胰岛素负反应元件,位于人肝细胞85bp123bp区域,仓鼠肝细胞79bp117bp区域,胆固醇和胰岛素可据此调节 MTP 活性。人体研究发现, MTP 基因表达受不同饮食条件和代谢调节因子的影响。高脂饮食引起肝脏和肠道中 MTP 大亚基 mRNA 水平增加,使肝脏 MTP 大亚基 mRNA 增加55% ,小肠增加126%;而高蔗糖饮食引起肝脏 MTP 大亚基 mRNA 水平增加55% ,对小肠 MTP mRNA 水平无影响, 饥饿对 MTP 大亚基 mRNA 无影响。当葡萄糖浓度高于30 mmol/L时引起 MTP 大亚基 mRNA 水平明显降低,因此葡萄糖对 MTP mRNA 的影响仅发生在非常严重的糖尿病患者。MTP mRNA 水平和血浆胆固醇、甘油三酯水平呈正相关关系。小肠的快反应与肠细胞的快速更新相联系,对应于各种饮食变化引起的 MTP 的活性波动。肝脏的调节较缓慢,这是对饮食长期变化的适应。Sharp D 等报道补充游离胆固醇对 Hep G2 分泌 apoB 无影响,而252羟胆固醇使TG、CE 和 apoB 分别增加1.4 、3.2 、2.5倍,同时apoB mRNA 和 apoB 均增加,膳食中增加胆固醇则大鼠肝脏 apoB 和 TG 分泌增加(Sharp D , et al, 1993)。体外实验显示 MTP 的活性与受体和供体的 SUV 浓度有关,当实验体系内两者 SUV 浓度平衡时，MTP 活性最大,如果一方 SUV 的浓度超过另一方, MTP 的活性则被减弱。有报道磷脂可以降低 MTP 对囊泡受体的亲和性,所以能够抑制 MTP 的活性。相反升高自由脂肪酸的浓度能够增加 MTP 对受体的结合能力故而提高 MTP 的活性作用。在体内,动物模型实验显示高脂、高糖饮食能够影响 MTP mRNA 在细胞内的含量。高脂、高糖饮食处理的动物模型小肠细胞内的 MTP mRNA 水平可比对照组(正常饮食)的高出126%之多。给实验动物高脂饮食后,取动物肝细胞测定 mRNA ,结果显示编码 MTP mRNA水平比对照组高出50%60%,提示 MTP 与饮食的相关性是显著和肯定的(Lin M C , et al, 1994)。不同能量摄入水平影响围产期奶牛肝 MTP mRNA 的表达,而且干乳期高能量摄入上调产后肝 MTP mRNA 的丰度(陈仕均等，2007)。6 总结与展望 综上所述, MTP 是一种在脂蛋白组装过程中必须的多功能蛋白。在通过对 MTP 功能的研究中,其主要在脂蛋白的组装和分泌中起作用; 除此以外,MTP 还有其他的生理功能,如: MTP 可能作为辅助因子诱发蛋白质的某些折叠,同样 MTP 也可能在脂肪分泌或流动中起作用 (陈仕均,唐海蓉，2007)。这些进一步的生理功能都将是我们研究的热点,对这些热点的研究不仅可以进一步了解蛋白质其结构与功能的关系提供一个很好的理论依据,从而丰富和加深对蛋白质的理解,同时我们对 MTP 的研究还可以了解其在脂肪代谢中的作用,进而可以应用到人类医学上。例如: 对 MTP 的研究可以对无脂蛋白血症产生的分子机制将进一步了解,同时通过对 MTP 的分子结构及基因序列的研究,其多态性与肥胖疾病的关系将更加明确,由此我们可以通过对 MTP 序列上的定位修饰,使其在一定程度上的减少肥胖病症的发生,不仅如此对 MTP 的序列同源性的研究,可以与卵黄原蛋白家族的研究相联系起来,从而研究不同物种间的脂质转运特点。另外由于 MTP 在脂质转运过程中的重要作用,我们可以通过对转运区和接合区的研究,开发一些药物因子使其在脂质转运过程中,按照具体的生理状况抑制或促进脂质量的转运,进而减少酒精性或非酒精脂肪肝的发病率。除此以外,MTP 的研究可以间接对冠心病(CHD)、动脉粥硬化(AS)的研究起到理论依据,同时由于其与2型糖尿病有一些关系,所以通过对 MTP 的研究也可以对防止或减少2型糖尿病的发生有借鉴作用（陈莉明，孙蓓，2006；赵芊，2005）。同时由于 MTP 在脂质转运过程中的作用,所以用禽类作为研究肝脏变性的模式动物,这不仅可以为探讨人类的疾病产生的机制,同时也能够进一步为家禽育种提供一些理论依据。因此对 MTP 的结构和功能的研究,将有助于了解禽类品种之间在分子机制上的遗传差异,从而进一步地指导畜禽业中的品种改良及个体选育,以便提高经济效益。同时在医学上,对探讨人类脂肪肝病变、无脂蛋白血症、2型糖尿病以及一些心血管疾病的产生机制都有一定的理论作用,从而也带动了相关的药物研究和开发,为疾病治疗作出贡献（黄俊军等，1998）。 参考文献1. 陈莉明，孙蓓. MTP 基因多态性与2型糖尿病血管并发症的关系. 中国糖尿病杂志，2006，14（2）：98-1002. 陈仕均, 孙玉成, 刘国文等. 不同能量摄入水平对围产期奶牛肝 MTP mRN 丰度的影响. 中国兽医学报, 2007a ,27 (3)：382-3863. 陈仕均, 唐海蓉. 微粒体甘油三脂转运蛋白研究进展. 动物医学进展, 2007b，28（12）：84-894. 黄俊军. 微粒体甘油三脂转运蛋白的研究. 国外医学临床生物化学与检验学分册，1998，19(6)：259-2685. 黎荣山. 广西黑衣壮族微粒体甘油三酯转移蛋白基因多态性与血脂水平的关系. 硕士学位论文. 南宁：广西医科大学图书馆，20056. 孙玉成，王雪莹，陈仕均等. 乳牛肝MTP基因mRNA定量检测模板的构建. 中国兽医科技，2005，35(9)：731-7347. 孙玉成. 围产期奶牛肝VLDL组装与分泌主要相关蛋白基因表达的调控. 博士学位论文. 长春：吉林大学，20068. 徐闯，刘彩霞，董凤仙等. 微粒体甘油三脂转运蛋白的研究进展. 国外医学临床生物化学与检验学分册，2004，25（5）：439-4419. 叶健强，蒋立, 王继文. 微粒体甘油三脂转运蛋白 MTP 的结构和功能研究概况. 生物信息学，2005，3：140-14310. 赵芊. MTP 基因多态性与2型糖尿病视网膜病变. 中国糖尿病杂志，2005，12（6）：63-6611. Atael A and Wetterau J R. Identification of two classes of lipids molecule biding sites on microsomal triglyceride transfer protein. Biochemistry , 1994 , 33: 15382 - 1538812. Borradaile N M , de-Dreu L E , Barrett P H , et al. Inhibition of hepatocyte apoB secretion by naringenin : enhanced rapid intracellular degradation independent of reduced microsomal cholesteryl esters. Lipid Res, 2002, 43(9): 1544-155413. Hussain M M, Shi J and Dreizen P. Microsomal triglyceride transfer protein and its role in apolipoprotein B - lipoprotein assembly. Lipid Res , 2003 , 44: 22 - 3214. Lin M C , Arbeeny C , Bergquist K, et al . Cloning and regulation of hamster microsomal t -riglyceride transfer protein, the regulation is independent from that of ot her hepatic and intestinal proteins which participate in the transport of fat ty acids and triglycerides. Biol Chem, 1994, 269 ( 46 ): 29138-2914515. Mann C J , Anderson T A ,Read J , et al . The structure of vitellogenin provides a molecular model for the assembly and secretion of atherogenic lipoproteins. Mol Biol, 1999 ,285: 391-40816. Navasa M , Gordon D A , Hariharan N , et al. Regulation