脑缺血动物模型研究.ppt

脑缺血动物模型 的制备和评价 同济大学附属东方医院神经内科 黄 东 雅 急性期脑梗塞治疗理念的演变 改善或增加缺血区的供血: 稀释血液， 降低血粘度，改善循环 “时间窗”治疗 溶解血栓、恢复血供 、挽救半暗带区脑组织: 3-6h内溶栓治 疗 抗血小板聚集治疗 卒中单元（stroke unit） 神经保护剂 急性期脑梗塞治疗理念的演变 神经保护剂： （1）钙离子拮抗剂: 具有选择性扩张脑血管作用， 改善脑缺血区的低代 谢状态，抑制缺血“瀑布效应”启动，改善再灌注损伤。 （3）细胞稳定剂: 常用胞二磷胆碱，有神经元保护作用 （4）兴奋型氨基酸拮抗剂: 迄今综合评价最好的氨基酸受体损坏拮抗剂Mg 2+ 是其中之一。硫酸镁1.0-2.5g稀释成1%浓度静滴1次/日，连用3日，应尽 早应用。 （5）阿片受体拮抗剂: 阿片受体拮抗剂纳洛酮能改善脑缺血后的神经损伤症 状，促进神经功能恢复，降低死亡率。 （6）神经节苷脂制剂（GM）：改善预后 （7）GABA增强剂：吡拉西坦 ，结果不一 （8）其它:神经生长因子（NGF） 脑梗塞治疗理念的演变历程 在过去的15年中被世界所公认： 3小时内静脉溶栓 卒中单元 阿斯匹林 开颅减压术 动物试验 临床随机对照试验 概 述 缺血性脑血管病 ( I CVD) 约占全部脑血 管病的 80%, 具有发病率、致残率、病死率 高的特点 , 已成为严重危害人类健康的疾病 之一。由于临床研究的种种限制 , 脑缺血动 物模型已成为研究脑血管病损伤机制和防治 措施不可缺少的工具。因此 , 建立最接近人 类脑缺血的理想动物模型 , 具有重要意义。 脑血流供应 模式生物 1. 研究生命现象过程中长期和反复作为研究材料的物种 2. 细胞生命在发育的基本模式方面具有相当大的同一性 3. 用较低级位置上的物种来研究发育共同规律是可能的 4. 在有不同发育特点的生物中发现共同形态形成和变化 特征时，发育的普遍原理也就得以建立。 5. 这些生物帮助我们理解生命一般规律的生物被称为 “模式生物” 脑缺血动物模型的意义 宗旨： 为人类疾病（脑缺血性疾病）研究服务 要求： 基因 脑和血管解剖 繁殖力强 操作简单，重复性好 物种的概念和动物分类的等级 物种（Species）是动物分类的基本单位，在动物分 类学上，为了将数量众多的物种进行鉴定、研究，便建 立了一个科学的系统，设立了很多的等级或阶元（ Category），用以表示各种动物间类似的程度和亲缘关 系的远近。从上至下则为界、门、纲、目、科、属和种 ，形成了一个科学的动物分类系统。 “没有物种的概念，整个科学便没有了” 恩格斯 物种的概念和动物分类的等级 界： 动物界 Animalia 门： 脊索动物门 Chordata 纲： 哺乳纲 Mammalia 下纲： 真兽下纲 Eutheria 总目： 灵长总目 Euarchontoglires 目： 啮齿目 Rodentia 兔形目 树鼩鼩目 亚目： 松鼠形亚目 Sciuromorpha 河狸亚目 Castorimorpha 鼠形亚目 Myomorpha 鳞尾松鼠亚目 Anomaluromorpha 豪猪亚目 Hystricomorpha 发现 物种的分类 常用模式动物 常用模式动物 尽管一些体积较大的动物，如猩猩、猴、 猫、狗、兔、猪 都曾用于脑缺血研究，但是 大多数实验室选择大鼠或沙土鼠作为研究对 象。 大鼠和小鼠作为模式生物的优势 1. 大鼠品种多，易于饲养，价格低廉 2. 纯种鼠属近亲交配，基因型相似，脑血管解剖和生理机能也相似 3. 大鼠脑血管解剖和生理机能接近于人类 4. 脑血管损伤部位恒定，实验重复性好 5. 动物存活时间长，利于脑缺血相关病理改变过程的研究 6. 脑体积大小适宜，易施低温固定技术和组织生化分析 7. 有关系列大鼠的生理、药理和生化方面的实验资料可供分析比较 8. 克服了体外实验无法实施再灌流的缺陷 9. 沙土鼠缺乏后交通动脉及完整的基底动脉环，两侧大脑供血相对 独立，通过闭塞一侧或双侧CCA即可复制效果明显的同侧或双侧 脑缺血模型 脑缺血模型的制备 全脑缺血模型全脑缺血模型 局灶性脑缺血模型局灶性脑缺血模型 永久性闭塞 缺血/再灌注 大鼠脑血管解剖示意图 大鼠全脑缺血模型 - 二血管阻断法 方法：Smith等通过夹闭双侧颈 总动脉(CCA)合并低血压以减少 脑血流量，造成急性脑缺血。 单纯结扎双侧 CCA而不降低血压 , 则不足以使脑血流量(CBF)降低 至缺血和能量代谢紊乱的程度。 大鼠全脑缺血模型 - 二血管阻断法 优点： 该法手术简单, 失败率低 模拟了临床上休克、心功能不全、脑血管严重狭窄或 阻塞合 并血液低灌流引起的脑循环障碍 缺点： 脑缺血时限长，有时导致脑缺血后抽搐、癫痫等并发症的发生 由于全身低血压严重干扰其他器官的血供及实验结果 模型不能在清醒动物进行, 无法进行神经行为的观察 适用： 探讨不完全性脑缺血对能量代射的影响，缺血性脑损伤的发病 机理、 评价抗脑缺血药物的疗效更有价值。 大鼠全脑缺血模型 - 四动脉阻断法 方法：Pulsinelli 等在1979年通过阻断双侧 CCA及椎动脉血流成功建立了四血管闭塞 法大鼠全脑缺血模型。以1 %戊巴比妥钠按 40 mgP kg 进行腹腔麻醉, 腹卧固定大鼠于恒温 手术台 ,颈后正中切开 , 暴露第一颈椎的两侧翼 板小孔, 用单极电凝针插入其中 ,烧灼双侧推动 脉 , 使之永久闭塞 , 24 h后再仰卧位 , 局麻喉 部 , 在喉头与胸骨间 3 cm处正中切口 ,分离暴露 二侧CCA ,手术缝合线打活结 结扎 , 阻断两侧 CCA使缺血 30 min , 松开活结 ,造成大鼠全脑缺 血再灌流模型。 大鼠全脑缺血模型 - 四动脉阻断法 优点：检验缺血是否成功的指标明确 并能进行灌注实验 海马损伤明显，可显示记忆功能的减退 缺点：操作较复杂 椎动脉和脊管前动脉间的交通支存在个体差异较大 操作的熟练程度直接影响实验效果 适用：该模型用于特殊领域的研究 大鼠局灶性脑缺血（MCAO）模型 大脑中动脉( MCA)是人群脑卒中的多 发部位，MCA闭塞（Middle cerebral artery occlusion， MCAO）模型被 普遍认为是局灶性脑缺血的标准动物模型 ，主要有以下几种：栓塞法、栓线法、光 化学法、开颅法 大鼠局灶性脑缺血模型 大鼠局灶性脑缺血模型 - 栓塞法 方法： Kudo等采用100 m，在颈外 动脉（ECA）的颈内动脉（ICA）开口 处置一可逆性插管，栓子则由ICA进入 MCA，导致同侧大脑皮层、海马、深 层灰质结构的梗塞。 材料：同源血凝快 碳素颗粒 塑料颗粒 花生四烯酸钠 大鼠局灶性脑缺血模型 - 栓塞法 优点：可选材料多样，较好模拟脑栓塞 缺点：由于栓子的随机性, 无法预测栓塞的部位与大小 缺血不一 , 不利于神经症状和脑组织定量分析 不能再通与人类卒中差异较大 适用：血栓形成过程的研究 溶栓治疗的观察（尤其是人血凝块栓塞者更有 使用价值） 大鼠局灶性脑缺血模型 - 栓线法 方法： 1985年由 Koizumi 首 次报道 , 近年来不断得以完善 。由 ECA 插入 4 -0 尼龙线进 入 ICA , 阻断 MCA起始端而导 致局灶性脑缺血。通过提拉插 线可以造成再灌流损伤模型。 大鼠局灶性脑缺血模型 - 栓线法 优点： 急慢性局灶性缺血模型 较理想的观察脑缺血再灌流损伤模型 缺点： 结扎枕、甲状腺上、咽升、舌、上颌外和翼腭动脉 需要一定手术技巧 , 实质上是一种栓塞性卒中，与人类常见卒中仍有差异 适用： 该模型模拟了人类缺血性脑血管病的永久性及暂时性局 灶性脑缺血的各种状态, 在评价再灌流的作用及药物疗效 时, 具有说服力。 大鼠局灶性脑缺血模型 - 光化学法 方法： Watson等8首次建立了光化 学法诱导脑皮层梗塞的动物模型。 将大鼠固定在定位仪上 ,暴露颅骨 , 静脉注射光敏材料虎红酸钠, 用特定 冷光源(500-600 nm)照射颅骨, 光线 透过颅骨与血管内的光敏物质接触, 刺激发光化学反应的单线态氧, 直接 损伤血管内皮细胞而诱导血栓形成 大鼠局灶性脑缺血模型 - 光化学法 优点： 该法手术创伤小, 动物易长时间存活 血栓形成过程与人类相似 可选择皮层梗塞部位 缺点： 较早地导致终末动脉及微血管永久 性闭塞 ,不利于扩血管及促进侧支循环 作用的研究 适用： 慢性脑缺血研究 抗血小板, 抗血栓等药物及内皮细胞保护等的 动物实验研究 大鼠局灶性脑缺血模型 - 开颅法 方法： Tamura 等采用颞下部开颅，分 离近端MCA，夹闭、电凝或用手术丝线 结扎MCA，造成脑梗塞，是目前公认的 标准MCA闭塞模型。在大鼠耳眼连线中 点开口, 分离颞肌, 剪断颧弓 ,在颧弓根前 方颅骨钻孔, 于大脑上、 下静脉间11-0外 科无伤缝合线结扎MCA ,造成MCA支配 区局灶性脑缺血模型。 大鼠局灶性脑缺血模型 - 开颅法 优点：实验条件较恒定，缺血效果可靠 以大脑皮层、尾状核缺血最明显，最接近人类脑卒中 是迄今应用最广泛的经典性局灶脑缺血模型 缺点：于阻断MCA的手术难度较大，需显微外科手术技术 但可能形成脑脊液漏 对操作过多的血管可能影响缺血后的侧支循环 适用：脑缺血后长期的神经功能缺损及介入治疗和康复策略的研究 同时进行生理、 生化、病理形态及神经病学等指标的观察 小鼠脑缺血模型的特点 大多数实验动物由于颅内有侧枝循环的代偿作用因而很难造 成脑缺血。近20 年来, 国内外均有文献报道利用 小鼠（mause， mice）没有联系颈内动脉系统和椎基底动脉系统的后交通动脉的 解剖学特征, 可制作理想的脑缺血模型。 蒙古种沙土鼠： Monglian gerbils 近交系（inbredstrain）: BALB/c小鼠 C57BL 称远交群（outbredstock）： KM小鼠 ICR小鼠 NIH小鼠 突变系（mutantstrain）： nude小鼠 Scid小鼠 小鼠前脑缺血/再灌注模型 （forebrain ischemic / repefusion，FbIR） 用20 %乌拉坦按 110 gP kg经腹腔麻醉 小白鼠。沿颅顶正中线切开皮肤、 暴露颅 骨 , 于颅骨左侧 ,冠状缝和矢状缝旁开各 1 mm 处钻洞 , 穿透颅骨达硬心电图标准 导 联记录心电图。结扎双侧 CCA ,同时将绕颈 后的备线扎紧给颈部软组织逐步加压 小鼠全脑缺血/再灌注模型 优点：手术操作简单，创伤小 缺点：沙土鼠体积小，生理反应有不稳定倾向 操作技术要求高 死亡发生率较高，需保持动物清醒，便于随 时观察动物生理状态变化 适用：用于筛选脑活性保护成分或缺血性保护剂的 研究 小鼠线拴局灶脑缺血小鼠线拴局灶脑缺血/再灌注模型再灌注模型 WelshWelsh等建立了插线法小鼠局部脑缺等建立了插线法小鼠局部脑缺 血模型血模型 ，在，在 CCA CCA 分叉部的近端约分叉部的近端约2-3 mm2-3 mm 处剪一小口处剪一小口, , 插入插入 820 820 尼龙纤维线段尼龙纤维线段 , ,送至送至 ICAICA近端后松开血管夹并继续推送直到遇到近端后松开血管夹并继续推送直到遇到 阻力不能再前进为止。激光多谱勒流量仪阻力不能再前进为止。激光多谱勒流量仪 监测监测MCAMCA。 小鼠线拴局灶脑缺血小鼠线拴局灶脑缺血/再灌注模型再灌注模型 优点：优点： 该方法操作简单易行该方法操作简单易行, ,避免开颅避免开颅 缺点缺点: : 动物小，要借助手术显微镜动物小，要借助手术显微镜 准确的栓塞位点较难把握准确的栓塞位点较难把握 适用：适用： 该模型为剖析脑梗死形成的复杂分该模型为剖析脑梗死形成的复杂分 子机制提供了有力工具，由于技术子机制提供了有力工具，由于技术 要求高，应用不太广泛要求高，应用不太广泛 非人灵长目动物-猴脑缺血模型 非人灵长目动物在直立的体位、 行 为、 运动、 感觉、 新皮质的比例、 脑血 管的构筑、 非骨性脑膜和右手优势等方面 与人类相似。可以设想 , 其脑血管和组织 对脑缺血的反应最接近人类卒中。因此 , 非人灵长目动物可能是制作脑缺血模型的 最佳动物 猴全脑缺血模型 四血管闭塞法(4VO) 分离两侧颈总动脉分离两侧颈总动脉(CCA)(CCA)及椎动脉，在及椎动脉，在 结扎双侧椎动脉后结扎双侧椎动脉后, , 立即夹闭双侧立即夹闭双侧CCA, CCA, 缺血缺血 15 min 15 min 后再灌注。后再灌注。 猴全脑缺血模型 四血管闭塞法(4VO) 优点：能导致严重的大脑缺血 具有高度重复性 缺点：缺点：易出现实验未达到预定时间而动易出现实验未达到预定时间而动 物已经死亡的情况物已经死亡的情况 适用：适用：以作为严重创伤造成的多器官衰竭以作为严重创伤造成的多器官衰竭, , 脑衰竭的模型。脑衰竭的模型。 猴全脑缺血模型 头臂总干 +左锁骨下动脉闭塞法 猕猴的主动脉弓上只有头臂总干和左锁 骨下动脉两个分支 , 夹闭这两个分支可以阻 断脑部血流 , 从而造成全脑缺血。 猴全脑缺血模型 袖带充气压颈法袖带充气压颈法 先气管插管先气管插管 , ,然后将小儿血压计袖带绕然后将小儿血压计袖带绕 在颈部在颈部 , ,充气加压充气加压 , ,静脉注射神经节阻滞剂樟静脉注射神经节阻滞剂樟 脑磺酸三甲噻吩脑磺酸三甲噻吩 ( (TrimethaphanTrimethaphan camsylatecamsylate) ,) , 可以制造全脑缺血和再灌注模型。这种方法可以制造全脑缺血和再灌注模型。这种方法 简单、简单、 可靠可靠, , 但脑部动脉、但脑部动脉、 静脉同时被阻断静脉同时被阻断 猴局灶性脑缺血模型 为了长时间、 反复进行实验和临床观察 , 非人灵长类动物单血管堵塞模型是最理想 的局灶性脑缺血模型，各种方法造成 MCA 闭塞 猴局灶性脑缺血模型 大脑中动脉缺血/再灌注法 经眶入路法 血管夹闭法 血管外气囊充气阻断血流法 永久性局灶性脑缺血 MCA 电凝并切断法 皮质梗死法 介入法 自体血凝块栓塞法 硅胶栓子法 猴局灶性脑缺血模型 经眶入路法 开颅手术需要直接对脑组织进行操作开颅手术需要直接对脑组织进行操作 , , 影响颅内压和动物的咀嚼等功能影响颅内压和动物的咀嚼等功能。采用拉采用拉 线或松线可使大脑中动脉线或松线可使大脑中动脉(MCA)(MCA)闭塞或再闭塞或再 通。通。 猴局灶性脑缺血模型 经眶入路法 优点：优点： 直视下完成直视下完成MCAMCA的闭塞或再通的闭塞或再通 缺点：缺点： 有一定难度，需精细的眼眶内操作有一定难度，需精细的眼眶内操作 容易损伤容易损伤MCAMCA管壁上的神经襻导致脑脊髓液漏管壁上的神经襻导致脑脊髓液漏 对血管的操作可能引起血管痉挛从而难以再通对血管的操作可能引起血管痉挛从而难以再通 因有侧支循环受累因有侧支循环受累, , 脑组织缺血程度不一脑组织缺血程度不一 猴局灶性脑缺血模型 经眶后开颅法 该法是一种较为经典的制作 MCA 区缺血的方法 , 广泛应用于兔、 狒狒、 猫、 犬等大型实验动物。十字 切开角膜 ,眶内减压 ,吸出晶体和玻璃体 ,电凝视神经周 围的血管。剥开蛛网膜 ,在嗅索下 3 mm 处可见MCA。 夹闭或电凝MCA 主干可造成大多数动物MCA区的急性 缺血性损伤。 猴局灶性脑缺血模型 经眶后开颅法 优点：该法创伤小, 死亡率低 缺点：但手术复杂, 由于猴脑血管侧支循环 丰富 , 结扎MCA起始部后, 其远端血管可经眶额 动脉、 颞动脉等侧支供血, 梗死成功率不高。 适用：该法得到的中风模型，根据梗塞范围 和疾病严重程度适于进行后续研究 猴局灶性脑缺血模型 MCA 电凝并切断法 手术开颅，电凝并切断 MCA 优点: 梗死灶确切 缺点：不能恢复血流 猴局灶性脑缺血模型 皮质梗死法 用双极电凝法在运动皮质手功能代表区电凝 小血管床而诱发皮质梗死 优点：梗死灶确切 缺点：不能恢复血流 猴局灶性脑缺血模型 -自体血凝块栓塞法 选选3-7 kg3-7 kg的成年猴的成年猴 , ,术前术前 2 d 2 d 抽取抽取 2-3 ml 2-3 ml 静脉血静脉血 室温静止分离血块室温静止分离血块, , 用用 18 18 号针头制成直径号针头制成直径 1mm, 1mm, 长长5-5- 7 mm7 mm的栓子的栓子, , 保存在保存在 4 4 的生理盐水的生理盐水, , 将栓子导入将栓子导入 ICAICA后每隔后每隔1 min1 min注入注入1 1个栓子个栓子, , 共注入共注入 5 5个个, , 栓塞后栓塞后 2 h 2 h 用放射性同位素检测蛋白质合成。用放射性同位素检测蛋白质合成。 猴局灶性脑缺血模型 -自体血凝块栓塞法 优点：该法简便易行该法简便易行 血管内栓子法不影响血管上的神经血管内栓子法不影响血管上的神经 缺点：缺点：自体血凝块可能形成多灶性缺血不易控制自体血凝块可能形成多灶性缺血不易控制 大的梗塞常常会引起动物的死亡大的梗塞常常会引起动物的死亡 适用：适用：于纤维蛋白原激活系统血栓效应的研究和溶栓于纤维蛋白原激活系统血栓效应的研究和溶栓 治疗的观察治疗的观察 尤其是人血凝块栓塞者更有使用价值尤其是人血凝块栓塞者更有使用价值 猴局灶性脑缺血模型 - 微栓子栓塞法 Yhshikazu采用硅胶柱作为栓子 ,装在直径 118mm的弹性导管内, 导管外接10 ml 的注射器 ,内装 7ml生理盐水。手推注射器送栓子进入动脉 大脑中 动脉系统。 猴局灶性脑缺血模型 - 微栓子栓塞法 优点：于仅需要颈部局部麻醉，操作简单 缺点：该法存在的问题是撤管后, CCA 壁的缝合有 一定的技术要求。 适