分子生物学绪论第一章b.ppt

绪绪 论论 Introduction 何为何为“ “分子生物学分子生物学” ”？ 是在分子水平上研究生命本质的一门新兴的 边缘学科，是生物学研究从宏观发展到微 观而形成的。终极目标是要了解所有生物 学现象的分子本质。 是当前生命科学中 发展最快并正在与 其它学科广泛交叉 与渗透的重要前沿 领域。 分子生物学的研究对象分子生物学的研究对象 生物大分子 核酸 蛋白质 多糖 脂类 它以核酸和蛋白质等生物 大分子的结构及其在遗传信息 和细胞信息传递中的作用为研 究对象。 分子生物学与生物化学的关系分子生物学与生物化学的关系 “ “你中有我，我中有你你中有我，我中有你” ” 分子生物学生物化学 研究方向 主要研究核酸、蛋白质质和其它大 分子的结结构和功能，及它们们之间间 的相互作用。着重解决细细胞中信 息传递传递 的问题问题 。 主要研究大、小分子在 生命活动动中的代谢转谢转 化 过过程，如糖酵解、脂肪 氧化、三羧羧酸循环环等。 研究方法 以X-射线线等物理学方法研究大分 子结结构，以生化与遗传遗传 相结结合的 方法探索其功能。 采用生化和化学方法。 重点是大分 子的结构与 功能 重点是分 子的代谢 转化 第一章第一章 遗传的物质基础遗传的物质基础-DNA-DNA DNA一级结构 DNA二级结构 DNA三级结构 脱氧核糖核苷酸脱氧核糖核苷酸 3,5-3,5-磷酸二酯键磷酸二酯键 线状或环状线状或环状 一、一、DNADNA一级结构一级结构 DNA的一级结构实际上 就是DNA分子内碱基的 排列顺序。 DNADNA和和RNARNA在稳定性上的差异在稳定性上的差异 DNA的戊糖2上没有自由羟基，很稳定，在 pH11.5时DNA的一级结构几乎无变化；而 RNA的戊糖有2上的自由羟基，遇碱水解生成 2,3环式单核苷酸，极不稳定，很快转变成2 单核苷酸和3单核苷酸。 结构决定特性结构决定特性 结构决定功能结构决定功能 重复序列重复序列（repetitive sequencerepetitive sequence） 高度重复序列 中度重复序列 低度重复序列 1 1、高度重复序列、高度重复序列 重复频率高，几十万到几百万次； 重复序列较短，5300bp，多数为515bp； 有些是反向重复序列。 卫星DNA 回文结构 palindrome 卫星卫星DNADNA（satellite DNAsatellite DNA） 在高度重复序列中，有一种由富含AT的2 10bp成串排列组成的简单重复序列，可 用等密度梯度离心法将其与主体DNA分开 ，因此把它叫做卫星DNA。 分类 微卫星DNA（microsatelletite DNA） 小卫星DNA（minisatelletite DNA） 重复频率 重复序列长度 具有种属特异性， 常作为一种分子遗 传标记。 2 2、中度重复序列、中度重复序列 重复频率和重复序列长度 差异大； 有些成串集中排列，有些 与单拷贝序列间隔排列； 有些是编码蛋白质的结构 基因； 一般有种的特异性，可作 为探针，区分不同种间细 胞DNA。 差异大差异大 种的特异性种的特异性 3 3、低度重复序列、低度重复序列 序列不重复或只重复几次、十几次； 重复序列长度1000bp； 携带大量能编码功能蛋白质的遗传信息。 又称单拷贝拷贝序 列 The Double Helix (1953) The foundation of molecular biology Francis H. Crick James D. Watson 二、二、DNADNA二级结构二级结构 （1）反向平行，右手双螺旋； （2）糖与磷酸通过3,5- 磷酸二 酯键在外侧形成骨架； （3）碱基在内部，平面与螺旋 轴垂直； （4）A=T，G C； （5）直径为2nm，螺距为3.4 nm ，10bp/helix； （6）大沟（major groove）和小 沟（minor groove） The Double HelixThe Double Helix 氢键 碱基堆积力 DNADNA分子结构状态的维持是四种作分子结构状态的维持是四种作 用力相互竞争的结果用力相互竞争的结果 静电斥力 疏水力 有利于维持双螺旋结构 不利于维持双螺旋结构 DNADNA二级结构的多态性二级结构的多态性 除B-DNA外，人们还发现到了其它的结构参数有一定差 异的DNA，如A-DNA, Z-DNA，三链和四链DNA等，这 一现象称为DNADNA结构的多态性（结构的多态性（polymorphismpolymorphism） ）。 三链三链DNADNA 分子间的三螺旋DNA 分子内的三螺旋DNA 平行的三螺旋结构 R-DNA A-DNA：周碱基数可变DNA Z-DNA：左旋DNA 双链双链DNADNA DNA三螺旋结构中的第三条链 与第一条链的序列和方向均相同 ，这种的DNA叫R-DNAR-DNA。 四链四链DNADNA G四联体螺旋：含有端粒重复序列的单链寡 核苷酸可以形成四联体螺旋结构。 DNADNA结构的动态性结构的动态性 不同DNA结构形式相互转变的现象，称为DNADNA结结 构的动态性构的动态性。 DNA基本结构：B型 天然DNA分子中，以B型结构为主 在这个分子的某些区段 会出现A、Z型，甚至三 链、四链。 这些不同的结构处于动态变化中 双链DNA中配对碱基的氢键不断处于断裂和再生 状态之中，特别是稳定性较低的富含A-T的区段 ，氢键的断裂和再生更为明显。在微观上，它 们常常发生瞬间的单链泡状结构，这种现象称 为双螺旋的呼吸作用。 DNADNA结构的呼吸作用结构的呼吸作用 对于一些识别双链DNA开链成单链的蛋白质结合 到DNA上具有重要作用。这些蛋白质需要处于呼 吸状态的双链DNA来阅读和识别DNA内部所含信 息（如碱基序列、碱基上可以作用的氢供体、氢 受体的数目和方位等）。 DNADNA的超螺旋结构的超螺旋结构是指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所 形成的构象，包括线形双链中的纽结、超螺旋、多重 螺旋、分子内局部单链环和环状DNA中的超螺旋及连 环等拓扑学性质。 三、三、DNADNA三级结构三级结构 超螺旋结构（最常见）超螺旋结构（最常见） 生物学意义生物学意义 1、超螺旋DNA形状更紧密，在DNA 组装中有重要作用； 2、超螺旋程度的改变介导了DNA结构的变化，有利于功能 的发挥； 3、超螺旋DNA能实现松弛态DNA所不能实现的结构转化。 四、四、DNADNA的变性、复性与杂交的变性、复性与杂交 DNADNA的变性的变性（denaturationdenaturation） 在物理和化学因素的影响下，维系核酸二级 结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA 双链解旋成单链，这一过程称为DNA的变 性。 判断：判断： 1、核酸的变性可发生在整个DNA分子中，也可发生在局 部的双螺旋节段上（局部变性）。 2、DNA变性不涉及核苷酸中二酯键的断裂。 3、引起变性的因素有酸、碱、尿素、胍等变性剂和乙醇、 丙酮等化学因素以及热、紫外线等物理因素。 4、变性后的DNA其一系列的物理、化学性质都发生变化 ，如260nm处紫外吸收值降低，粘度下降，沉降速度增加 ，浮力密度上升等。 5、熔解曲线的中点，即一半的DNA双螺旋解为单链所对 应的温度称为熔解温度或解链温度。 6、每一种DNA都有一个解链温度，Tm值是一个固定常数 。 增色效应增色效应 同一种同一种 DNADNA分子在分子在 不同离子强度溶液不同离子强度溶液 中其中其TmTm值不同值不同 你还记得影响变你还记得影响变 性的因素有哪些吗？ 性的因素有哪些吗？ 变性的DNA重新恢复为双螺旋的过程，叫做 复性或退火。 DNADNA的复性（的复性（renaturationrenaturation） 分子碰撞 时间长 核心作用 时间短 拉拉链作用 限制因素 复性机制复性机制 不完全变性DNA容易迅速复性； 复性DNA分子不一定是原有互补链，大 部分不是原配，而是形成杂交分子； 复性DNA分子的结构和理化性质等均得 到恢复。 复性的特点复性的特点 你知道影你知道影响复性速度的因素有哪些吗？响复性速度的因素有哪些吗？ 判断：判断： 、DNA片段小的比大的容易复性。 、盐可以减少两条互补链负电荷的排斥作用，通常增 加盐浓度，可加速两条互补链重新结合的速度。 、DNA浓度越大，两条互补链彼此相遇的可能性越大 ，复性速度也越快。 一定的盐浓度 适宜的温度 复性的条件有哪些？复性的条件有哪些？ 为什么？为什么？ 复性是分子杂交的理论基础 核酸分子杂交核酸分子杂交 Nucleic acid hybridizationNucleic acid hybridization 亲缘关系很近的不同来 源的DNA单链或RNA单链 与DNA单链之间通过碱 基互补形成杂交分子的 过程,叫做核酸分子杂 交。 DNA/DNA DNA/RNA 根据核酸分子杂交的原理，有目的地人工制备或从基因 组中分离一段已知序列的DNA，使其带上标记，经变性 后成为单链，在一定条件下与待测DNA单链杂交，如两 者序列有同源性，就形成带有标记的双链DNA分子，即 检测到了待测的DNA。这段带有标记的核苷酸序列称为 核酸探针或基因探针（Gene probe）。 核酸探针（核酸探针（Nucleic acid probeNucleic acid probe） 常用的核酸分子杂交方法常用的核酸分子杂交方法 SouthernSouthern印迹杂交（印迹杂交（Southern Southern blotingbloting） Northern Northern 印迹杂交（印迹杂交（Northern Northern blotingbloting） 斑点杂交（斑点杂交（dot blottingdot blotting） 原位杂交（原位杂交（in situ hybridizationin situ hybridization） 五、五、 DNADNA序列分析及进展序列分析及进展 DNA序列分析技术是揭开生命奥秘的一把金钥匙 吴瑞士 引物-延伸测序策略 1971年首次成功地测定了 噬菌体两个粘性末端 的完整序列。F.Sanger末端终止法 K.Mullis PCR M.Smith碱基定点突变技术 SangerSanger法法 1 1、基本原理、基本原理 SangerSanger双脱氧末端终止法双脱氧末端终止法 利用脱氧核苷三磷酸（dNTP）的类似物双脱氧核 苷三磷酸（ddNTP）取代正常的底物。 在DNA合成反应中除了加入4种正常dNTP外，再加 入1种少量的ddNTP，反应产物是一系列长短不一的核 苷酸链。在4组独立的核苷酸反应中，分别加入4种不同 的ddNTP，结果生成4组核苷酸链，它们分别终止于每 一个A、T、C、G的位置上。对这4组核苷酸进行聚丙烯 酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA ，可 读出序列。 2 2、反应原理、反应原理 ddNTP可以在DNA聚合酶作用下和多核苷酸 链的3羟基形成磷酸二酯键，但却不能再与下一 个核苷酸缩合，结果使得多核苷酸链的延伸终止 。 ddNTP的作 用 方法过程 ddNTPddNTP与与dNTPdNTP 聚丙烯酰胺 凝胶电泳 DNA聚合酶 单链DNA模板 单链寡核苷酸引物 Mg2+ 4种dNTP (dATP,dGTP,dCTP和dTTP) 4种ddNTP (ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP) 3 3、反应体系、反应体系 DNADNA序列测定策略序列测定策略 1 1、定向测序、定向测序 是从大片段是从大片段DNADNA的一端开始按顺序进行分析的一端开始按顺序进行分析 。 2 2、随机测序、随机测序 又称鸟枪策略又称鸟枪策略(shotgun strategy)(shotgun strategy)，是将人类基因组，是将人类基因组DNADNA用机用机 械方法随机切割成械方法随机切割成2Kb2Kb左右的小片段，把这些左右的小片段，把这些DNADNA片段装入片段装入 适当载体，建立亚克隆文库，从中随机挑取克隆片段。最后通适当载体，建立亚克隆文库，从中随机挑取克隆片段。