基因组学与系统毒理学.ppt

第10章 毒理基因组学与系统毒理学 v1 概述 v2 毒理基因组学研究技术 v3 毒理基因组学研究内容及其应用 v4 从基因组学到系统毒理学（自修） 1 概述 v毒理基因组学（toxicogenomics）:是研究基因组如何对化 学毒物发生反应的学科。 v毒理基因组学最初是将基因组学的理论和技术应用于毒理学 ，研究组织细胞特定基因的功能并预测受试物的毒性。目前 研究不仅包括基因组水平的效应，还包括基因的DNA表达（ 转录组学）、蛋白质产物表达（蛋白质组学）、代谢谱改变 （代谢组学）、遗传多态性以及生物信息学等相关领域。 v毒理基因组学的基本任务：是利用人类基因组的资料，帮助 筛选和鉴别潜在的环境毒物，并在基因组水平上阐明毒作用 发生的机制。 v毒理基因组学的研究目标：近期是确定某种有害因素的反应 基因（信号基因）用于毒理学和相关疾病的研究，远期是建 立全基因组与蛋白质组毒性反应知识库，并在此基础上开辟 以芯片技术和生物信息技术为特征的数字（digitized toxicology）毒理学。 2 毒理基因组学研究技术 v毒理基因组学面临的基本问题一是如何获取大规模 的生物数据，二是如何对所得到的大量信息进行及 时而合理的处理。这有赖于下列毒理基因组学现代 研究技术。 v2.1 基因组学与转录组学技术 v2.2 蛋白质组学技术 v2.3 代谢组学技术 v2.4 生物信息学 2.1 基因组学与转录组学技术 v2.1.1 差异显示反转录PCR技术(DDRT-PCR) v2.1.2 基因表达序列分析 v2.1.3 微阵列分析 v2.1.4 RNA干涉（RNA interference,RNAi） 技术 v2.1.5 单核苷酸多态性检测 2.1.1 差异显示反转录PCR技术 vDDRT-PCR技术是以分子生物学上应用广泛的两种技术PCR和 聚丙烯酰胺凝胶电泳为基础。 v基本原理：以1对细胞/组织的总DNA反转录而成的cDNA为模 板，利用PCR的高效扩增，通过5端和3端引物的合理设 计和组合，将细胞/组织中表达的约15000种基因片段直接显 示在DNA测序胶上，从而找出1对细胞/组织中有差异的cDNA 片段。 v优点：周期短、功能多、灵敏度高、所需RNA量少和重复性 高。 v缺点：假阳性率高、凝胶中单条cDNA带成分不均一、所获 cDNA仅代表mRNA3UTR（非翻译区）、一些低复制数mRNA不 能有效呈现。 2.1.2 基因表达序列分析 vSAGE（serial analysis of geneexpression）技术 的主要理论依据：是来自cDNA 3端特定位置的一 段9-11bp长的序列能够区分基因组中95%的基因。这 段基因特异的序列被称为标签。通过对cDNA制备 SAGE标签并将这些标签串联起来，然后对其进行测 定，不仅可以显示各SAGE所代表的基因在特定组织 中是否表达，而且还可以根据各SAGE标签所出现的 频率作为其所代表的基因表达丰度的指标。 vSAGE技术的前提条件：是genbank中必须有足够的某 一物种的DNA系列信息，尤其是表达系列标签（ expressed sequence tag,EST）的序列资料。 2.1.3 微阵列分析1 vDNA微阵列（Microarray assay）或 DNA芯片（DNA chip） 技术研究所使用的基本硬件：是基因微阵列或基因芯片，其 上含有成千上万个寡聚核苷酸片段或cDNA探针（cDNA、EST 或基因特异的寡核苷酸）。这些探针按一定顺序以矩阵方式 排列在载玻片大小的塑料或玻璃板上，在1cm2面积上可有1- 10万个不同的排列，并可有多个拷贝，其敏感性可达1-5个 拷贝mRNA/细胞。 v基因表达测定：先将受试动物染毒，其靶器官或细胞与毒物 接触后，发生反应或被活化的基因会产生mRNA。然后将mRNA 用核素或荧光素标记，再加入基因芯片。在单个的阵列中加 入两种标记样品进行杂交，再用图象分析仪或激光扫描显微 镜进行检查和分析。根据发生结合反应发生的情况便可判断 哪些基因发生了改变。 2.1.3 微阵列分析2 v优点：灵敏度高，mRNA丰度低至10万分之一 仍能被检出。可采用几种不同颜色的荧光染 料标记探针，这样在同一张阵列膜上进行一 次杂交实验就可分析不同样品间基因表达的 差异，因此效率高。 v缺点：成本较高，需要特殊的信号检测分析 系统（图象分析仪或激光扫描显微镜），玻 片上的微阵列不能重复使用。 2.1.4 RNA干涉技术 vRNAi(RNA interference)是一种能快速有效地沉寂靶基因的 表达，进而从反向角度来阐明基因的功能。 v原理：是外源性双链RNA导入细胞后，可产生21-23nt（核苷 酸，nucleotide）长度的小分子干涉RNA（small interference RNA, siRNA），引起与其序列同源的特异基 因mRNA降解的现象-转录后的基因沉默（post- transcriptional gene silencing,PTGS） v实验步骤：选取目的基因；设计相应的siRNA序列；制备 siRNA； siRNA转染哺乳动物细胞；RNAi效果分析。其中关 键是设计相应的siRNA序列。 2.1.5 单核苷酸多态性检测 vSNPs（single nucleotide polymorphisms） 指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起 的DNA序列多态性。其类型有单碱基的转换、 颠换、插入、缺失等。 v最普遍的检测方法：定位的序列标签位点和 表达序列标签进行测序。 2.2 蛋白质组学技术 v双向凝胶电泳：是将细胞抽提物在电泳过程中，依据蛋白质 所带电荷及分子大小而被分离的技术。 v生物质谱：是使样品分子离子化后，根据不同离子间质荷比 （M/Z）的差异来分离并确定相对分子量的技术。 v多向蛋白鉴定技术：是将蛋白质酶解后得到多肽混合物，进 样到强阳离子交换色谱柱，直接洗脱后进样到反向LC色谱柱 上，然后进行梯度洗脱，用MS/MS对分离的馏份进行鉴定。 v同位素亲和标签技术：是用化学性质相同而质量不同的两种 同位素分子，对蛋白样品的半胱氨酸进行标记，然后对混合 的样品进行质谱分析，通过比较质谱峰的强弱可对蛋白质进 行定量比较。 v分子扫描技术：是将双向凝胶转到涂有酶解液的膜上，在转 膜的同时进行酶切，再利用质谱扫描鉴定。 2.3 代谢组学技术 v核磁共振：其可在一次单独的检测中获得生物体液 中成百上千的代谢物组分的信息，而无需预先确定 被检测物质的性质。包括： v氢谱：其可检测含氢的化合物，但其大分子信号会 掩盖小分子化合物的信号。 v碳谱：可用于检测分子量在500D以下的含碳有机化 合物的信息。 v色谱-质谱联用：包括LC-MS和GC-MS。其速度快、灵 敏度高、样品处理简单。 v毛细管电泳：分离样品速度更快、效率高。 2.4 生物信息学 v生物信息学：是综合运用数学、计算机科学和生物 学的各种工具，以核酸、蛋白质等生物大分子数据 库作为主要研究对象，对巨量生物学原始数据进行 存储、管理、注释、加工，使之成为具有明确生物 生物学意义的生物信息。其有三部分组成： v生物学数据库 v生物信息学分析方法 v应用软件 生物学数据库 v它是按照一定的标准收集和处理生物学实验数据，并提供相 关的数据查询和处理的服务。其几乎覆盖了生命科学的各个 领域。如只对原始数据进行简单处理和归类的基本数据库： vDNA序列数据库：GenBank,EMBL,DDJB,ESTdb,OMIM,GDB等。 v蛋白质一级结构数据库：SWISS-PROT,PIR,OWL,ISSD等。 v蛋白质二级结构数据库：PROSITE,BLOCKS,PRINTS等。 v生物大分子的三维结构数据库：PDB,NDB,CCSD等。 v蛋白质结构分类数据库：SCOP,CATH,FSSP等。 v多个基本数据库的整合并能提供综合性服务的二次数据库： vUniGene,TransFac,EPD,Prosite,Prints,Pfam,Blocks, vProfiles,DSSP,PubMed等。， v目前这些数据库均可实现在线免费服务。 生物信息学分析方法 v序列比对预测法：是以核酸和蛋白质序列为依据， 比较2个或2个以上核酸或蛋白质在碱基、氨基酸水 平上的相似性和差异性。 v结构比对预测法：是比较两个或两个以上蛋白质分 子空间结构（二级和三级结构）的相似性和差异性 。 v功能比对预测法：是先以蛋白质序列为依据预测蛋 白质的物理性质（分子量、等电点、亲水和疏水性 、信号肽和蛋白定位等），再进行蛋白质的功能预 测。 应用软件 v其用于管理数据库，使用户能方便地得到实 时、在线的数据库服务。如： v用于核酸和蛋白质序列分析的GCG和Staden软 件包； v用于大规模测序的Seguencher； v用于快速克隆的VectonNTI； v用于比对基因组研究的Alfresco； v用于多序列比对的彩色序列编辑器CINEMA。 3 毒理基因组学研究内容及其应用 v3.1 毒作用机制研究 v3.2 化学物毒性预测 v3.3 比较毒理学研究 v3.4 混合物联合毒作用研究 v3.5 危险度评定 v3.6 表型锚定 v3.7 信息整合 3.1 毒作用机制研究 v传统采用动物模型进行毒性测试使用动物量大、工 作量大、周期长。 v采用基因组技术，实现了高通量筛选。 v阐明毒作用机制和预测新化学物毒性的关键在于识 别毒物所特有的分子标志或指纹基因。 v单基因对不同毒物的反应往往具有交叉性，不具备 单独作为指纹基因的特异性。 v只用采用多个变量（如多个基因），分析其综合变 化情况（如基因组表达谱），才可能反映出特征性 的改变。 3.2 化学物毒性预测 v基因组表达谱可用于预测新化学物可能具有的毒效应。 v根据研究目的可分别设计识别化学物的毒性、毒作用途径或 靶器官的阵列：选定已知毒物（如重金属）作为标准参照物 ；选定参照物已知或可能作用的靶基因作为阵列目标基因； 在特定组织或细胞中，用暴露与参照物靶基因的表达谱与受 试物表达谱进行比较，预测其毒作用类型；应用统计学分类 方法如聚类分析、自组图分析发现两类毒物间基因表达模式 的差异。 3.3 比较毒理学研究 v由于遗传背景、生化途径、受体亲和力等互不相同，同一毒 物在不同物种间的毒性效应存在较大差异。因此，将动物实 验结果合理地外推到人是个复杂的问题。要解决这一问题的 关键是寻找能够在不同物种间进行毒性比较的生物学标志 “桥梁生物标志”。 v采用高通量的DNA微阵列技术，可从大量甚至全部基因分子 中筛选出适当的“桥梁生物标志”，用于比较化学物毒作用 的种属差异，从而更加准确地将动物实验结果外推到人。 v比较不同物种间基因表达谱的相似程度，有助于选择与人类 反应最接近的实验动物，从而使毒理学研究的结果更接近人 类的实际情况。 3.4 混合物联合毒作用研究 v混合物联合毒作用因相互间在代谢动力学和效应动力学方面 存在复杂的相互作用。联合作用用化学物单独的作用外推显 然是不科学的。传统实验方法需要消耗大量的动物，周期长 ，成本高。 v微阵列技术对未知毒作用的混合物，通过检测基因表达图谱 和数据库检索，可预测混合物毒作用方式及有害健康效应。 v在已经明确毒效应的动物模型上，将混合物染毒后的基因表 达谱与每一单个化学物染毒后的基因表达谱进行比较，分析 不同化学物间可能的相互作用。 3.5 危险度评定 v任一次单化学物的暴露都可能引起成千上万个基因的反应， 而人类是暴露在一个多元的环境中，反应更加复杂。故传统 对化学物的暴露评价需要很长时间的研究和标准的制订。 v目前采用的暴露生物标志多为血液或组织中的毒物或其代谢 产物、DNA加合物、组织病理学及生化方面的改变，其数量 有限且多不具备足够的灵敏和特异。 v通过微阵列技术测定的基因表达谱的改变，可能成为新型的 灵敏生物标志。 v芯片技术可是遗传多态性的检测和基因分型变得简单快捷。 可帮助阐明个体对不同环境因素的易感机制，筛选和确定易 感人群，为进一步的流行病学调查和针对性预防提供依据。 3.6 表型锚定 v表型锚定：是将特定的基因图谱改变与特定剂量或 时间条件下的毒性损害相联系的过程。 v锚定的条件：因影响因素和反应的复杂性，需要将 毒理基因组学与计算机科学相结合。 v注意：基因组、蛋白质组、转录组和代谢组的状态 是一个动态的过程，即受到时间、饮食、运动、病 理生理和遗传背景等因素的影响。 3.7 信息整合