基因重组和基因工程(1).ppt

目录 基因重组和基因工程基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering 第14章 目录 二、重组DNA技术 三、重组DNA技术与 医学 一、自然界DNA重组和基因转移 内 容 目录 DNA重组 接合作用 (conjugation) 转化作用 (transformation) 转导作用 (transduction) 转 座 (transposition) 同源重组 (homologous recombination) 目录 发生在同源序列间的重组称为同源重组 (homologous recombination)，又称基本重 组（general recombination）。 一、同源重组 内切酶 (recBCD) DNA侵扰 (recA) 分支迁移 (recA) 内切酶 (recBCD) DNA 连接酶 53 5 3 5 3 53 53 53 53 53 53 53 53 53 5 3 53 33 53 53 35 53 53 53 Holiday中间体 53 53 53 53 Holiday中间体 53 53 53 53 5 5 3 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 内切酶 (ruvC) 内切酶 (ruvC) DNA 连接酶 DNA 连接酶 片段重组体 拼接重组体 目录 二、细菌的基因转移与重组 （一）接合（conjugation） 质粒 目录 （二）转化（ transformation) 目录 （三）转导(transduction) 目录 n插入序列（IS因子） n特征： n很小的DNA片 段 n末端具有倒置 重复序列 10 三、DNA的转座 目录 转座作用的机制 n限制性内切酶切开靶序列 n转座子插入，形成具有单 链粘性末端的转座子 n修补缺刻，形成直接重复 序列。 目录 分为复制型和非复制型两大类 复制型非复制型 目录 遗传效应 n引起插入突变，可导致基因表达失活。 n产生新的基因。 n产生的染色体畸变，引起DNA缺失或倒位。 n引起的生物进化，可产生新的生物学功能的基 因。 目录 二、重组DNA技术 三、重组DNA技术与 医学 一、自然界DNA重组和基因转移 内 容 目录 限制性核酸内切酶 逆转录酶 T4DNA连接酶 常用的工具酶 目录 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在 识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶 。 Bam H GTC CAG G CCTAG GATCC G + GGATCC CCTAGG Hind GTCGAC CAGCTG GAC CTG + 目录 目录 HO5 3 3 5 DNA连接酶 ATP ADP 53 53 目 录 DNA连接酶(DNA ligase) 目录 二、重组DNA技术基本原理 目录 基因克隆过程示意图 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程 目录 （一）目的基因的获取 n化学合成法 n基因组DNA文库(genomic DNA library) ncDNA文库(cDNA library) n聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 限制酶切位点 限制酶消化 除去中间片段 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂 真核生物染 色体DNA 限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段 cos LR cos20 Kb 外源 DNA 片段 基因文库 基因组文库 目录 cDNA文库构建: 用噬菌体载体 目录 目录 克隆载体(cloning vector) 扩增DNA 表达载体(expression vector) 让DNA表达成蛋白质 （二）载体的选择和构建 目录 载体的要求 能自主复制； 具标记，便于筛选； 有多个单一酶切位点 有一定的容量 目录 质粒 (plasmid) 目录 Polylinker MCS: multiple cloning site Promega 目录Invitrogen 真核表达载体示例 目录 噬菌体 载体 目录 粘性质粒(cosmid) 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒） Bam H切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15C GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam H切割载体DNA用Bam H切割 重组体载体自连 目的基因自连 （三）基因与载体连接 单酶切克隆 目录 双酶切克隆 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 连接 重组体 载体自连 目的基因 自连 平端连接 目录 质粒DNA：制备感受态细菌，转入 （四）重组DNA转入宿主细胞 噬菌体DNA：包装后吸附感染细菌 病毒载体：包装后感染受体细胞 目录 抗药性 标志补救(marker rescue) 原位杂交 免疫方法 （五）重组体的筛选 互补 利用互补原理筛选重组体pUC18 原位杂交 鸡的肌球蛋白的克隆和检出 免疫学方法 目录 （六）克隆基因的表达 原核表达体系（细菌）： 优点：培养方法简单，迅速、经济又 适合大规模生产工艺，经验丰富 不足： 只用于表达cDNA 不能进行翻译后修饰 易形成不溶性包涵体 目录 真核表达体系（酵母，昆虫细胞， 哺乳细胞等）： 优点：可进行适当的修饰，蛋白可分 布于胞内一定区域并积累 不足：操作麻烦，费时，不经济 目录 基因重组 总结 目录 二、重组DNA技术 三、重组DNA技术与 医学 一、自然界DNA重组和基因转移 内 容 目录 一、疾病基因的发现与克隆 家族性耳聋 鼻咽癌 目录 生物制药 目录 生物药物现状与展望 l 截止到2004年2月, 美国FDA批准的生物技术药物共79种。 l 2005年底，美国共有1415家生物技术公司，其中329家是上市 公司。全部上市公司2005年底的总市值超过4100亿美元。 l 2000年，在全球十大畅销药物中，生物技术药物只有安进的Epogen 和强生的Procrit （epoetin alfa）。 l 2008年的十大畅销药物中，有5只生物技术产品（Avastin，Enbrel， Epogen/Procrit，Remicade和Rituxan）名列其中。 l 2014年，在前100只畅销药物中，生物技术药物所占比例将超过 50%，而在 2000年和2008年时分别仅为 11%和 28% 。 目录 发展生物制药的领域： 1 激素类： 胰岛素，生长激素 2 细胞因子： 干扰素、集落刺激因子、白细胞介素、肿瘤坏死因子 、趋化因子、转化生长因子、生长因子、促红细胞生成 素（EPO)等。 3 溶血栓药物： 纤溶酶原、链激酶、尿激酶、葡激酶、水蛭素等 目录 4 血液代用品： 定型红细胞、万能型红细胞、重组血红蛋白 5 基因工程抗体： 治疗肿瘤、抗移植反应、抗病毒、抗过敏 6 重组可溶性受体： 纤溶酶原、链激酶、尿激酶、葡激酶、水蛭素等 目录 7 病毒疫苗（亚单位疫苗和DNA疫苗）： HIV、乙肝、丙肝、戊肝、EBV，单纯疱疹病毒、 巨细胞病毒、轮状病毒、登革热病毒、埃博拉病毒 、SARS 8 细菌疫苗： 9 寄生虫疫苗： 目录 基因诊断(genetic diagnosis)：在 DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基 因的置换、缺失或插入等突变。 三、基因诊断与治疗 目录 基本过程： 区分或鉴定DNA的异常 分离、扩增待测的DNA片断 目录 （二）基因治疗的概念 定义 基因治疗(gene therapy)是向有功能缺 陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补 偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。 目录 1. 产前诊断 2. 携带者测试 3. 症候前诊断 4.