基因重组与基因工程(2).ppt

第十七章 基因重组与基因工程 (genetic recombination and genetic engineer) 1 基因重组(genetic recombination) 是指在体外用酶学方法将不同来源的DNA进行切割、连接 ，组成一个新的DNA分子的过程，又称DNA重组。 基因克隆(gene cloning) 将重组DNA分子导入到合适的受体细胞中，使其扩增和繁 殖，以获得大量的同一DNA分子，称此为基因克隆、DNA克隆 或分子克隆。 基因工程(genetic engineering) 是将不同来源的DNA片段与载体分子连接形成重组DNA分子 ，再导入宿主细胞内进行表达，也称重组DNA技术。 2 本章主要内容 重要的工具酶 基因克隆常用的载体 重组DNA基本原理 重组技术在医学和制药 工业中的应用 3 第一节 重要的工具酶 工具酶 基因工程中的工具酶主要包括用于DNA和 RNA分子的切割、连接、聚合、逆转录等相关 的各种酶类。 4 一、限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE) 是一类由细菌产生的能专一识别和切割双链DNA中 的特定碱基序列的核酸内切酶，简称限制酶或切割酶 。 根据限制酶作用特性，一般分为、和型， 其中常用的是型限制酶。 5 限制酶（型）识别及切割位点 特异识别及切割48个bp长度且具有回文序列的 DNA片断，主要产生3种末端结构： 5粘性末端 3粘性末端 平端或钝端 回文序列(palindrome) 是指该部位的核苷酸序列呈180O反向重复; 粘性末端(sticky end) 是指经内切酶特异切割后产生的5末端突出和 3末端突出的碱基序列相互间具有互补性。 6 产生5-粘性末端 产生3-粘性末端 7 产生平(头末)端/钝端 其它特殊性质 的型限制酶 同裂酶（异源同工酶） 同尾酶 可变酶 8 同裂酶 又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的 识别序列。 在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生 平头末端，称为同识同切； 切割点也可以是不同的，产生3或5粘性末 端，称为同识异切。 9 同裂酶同识同切 10 同裂酶同识异切 11 同 尾 酶 同尾酶 指来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关 性的一类酶。它们作用后产生相同的粘性末端 。 12 可变酶 可变酶 识别顺序中的一个或几个碱基是可变的， 并且识别顺序往往超过6个碱基对。 如， Bstp，其识别顺序为GGTNACC。 13 常用限制性核酸内切酶的特性 微生物名称酶名称识别顺识别顺 序同裂酶同尾酶 Bacillus amyloliquefaciens H 解淀粉芽孢孢杆菌 BamHGGATCCBstBgl Mbo Bacillius globigil 球芽孢孢杆菌 Bgl ACATCT Escherichia coli RY13 大肠肠杆菌 EcoRGAATTC Haemophilus influenzae 流感嗜血菌 Hind AAGCTTHsu Providencia stuartii 164 普罗罗威登细细菌 PstCTGCAGSalp Streptomyces albus Subspecies pathocidicus 白色链链球菌 SalGTCGACAva Xho 14 限制性内切酶的应用 通过切割不同来源DNA双链的特异碱 基序列，产生含有黏性末端或平端的、长 度不同的DNA片段。 用于DNA重组、制备探针、分子杂交 、DNA序列分析等。 15 二、DNA聚合酶 （最常用的DNA聚合酶有以下4种） DNA聚合酶（全酶） DNA聚合酶大片段Klenow片段 Taq DNA聚合酶 T4 噬菌体DNA聚合酶 16 DNA聚合酶 E.Coli DNA聚合酶（DNA pol ） 是一个具有 3 种酶活性的多功能性酶。 包括： 53DNA 聚合酶活性 53核酸外切酶活性 35核酸外切酶活性 17 DNA pol 应用 常用来催化DNA缺口平移反应，制备高比活性DNA 探针； cDNA第二条链的合成； 对DNA3突出末端进行标记； DNA序列分析。 18 E. coli DNA pol. 催化缺口平移 *T *T*T*T Mg 2+ D N a s e I 5 3 3 5 3 55 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 dATP,dCTP,dGTP - 32 P dTTP E. coli DNA POL I 19 Klenow片段（DNA pol.大片断） 20 Klenow片段用途 补齐双链DNA的 3末端； 用标记碱基补 齐3末端 ； 用于cDNA克隆中 第二股链的合成； DNA序列分析。 21 Taq DNA pol（耐热DNA聚合酶） 作用特点 1） Taq DNA pol催化DNA合成的最适温度范围 70 75， 2） 95以上高温，半小时不失活， 3） 最适合用于聚合酶链反应（PCR）。 22 三、逆转录酶(reverse transcriptase) 特点 逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3种酶 活性： 以单链RNA为模板， 催化合成cDNA单链 具有RNase H 活性，能水解RNA:DNA杂交链中的 RNA 以DNA为模板，催化合成cDNA双链。 23 逆转录酶的应用： 将mRNA逆转录成cDNA，构建cDNA文库； 补平和标记5-末端突出的DNA片段； 代替Klenow酶用于DNA序列分析； 制备杂交探针等。 24 四、DNA连接酶(DNA ligase) 催化双链DNA中一条链的3OH与另一条链的 5PO3H2形成磷酸二酯键，从而构成完整的DNA长链 。 DNA连接酶的用途 （1） 两个双链DNA片段连接起来 5- ACG AATTCGT-3 T4DNA连接酶 5-ACGAATTCGT-3 3- TGCTTAA GCA-5 3-TGCTTAAGCA-5 （2） 修补带有缺口的双链DNA分子 T4DNA连接酶 25 五、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase） 能够催化水解去除DNA或RNA5-端的磷酸基团。 用途 制备载体时，用碱性磷酸酶处理去除载体分子 5端磷酸基后，可防止载体自身环化连接，提高 重组效率。 用32P标记5-端前，去除5-P，再通过激酶作用 把放射性核苷酸加到5-端进行标记。 26 六、末端 （脱氧核苷酸）转移酶(TdT) 作用 将标记或未标记的dNTP加到DNA的3OH末端；也可催 化载体分子或待克隆的DNA片段上加上互补的同聚尾，便于进 一步连接。 应用 探针标记 P32-.dGTP G32G32G32G32 G32G32G32G32 在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接 3 3 27 重要的工具酶 工具酶 活性 限制性核酸内切酶 识别特异碱基序列，切割DNA T4 DNA连接酶 催化DNA5-磷酸与3-羟基 形成磷酸二酯键 DNA聚合酶 以DNA为模板合成DNA 逆转录酶 以RNA为模板合成cDNA 碱性磷酸酶 切除5末端磷酸 T4多聚核苷酸激酶 催化核酸5-羟基磷酸化 末端脱氧核苷酸转移酶 催化3-端合成同聚尾 28 第二节 基因克隆常用的载体 载体(vector) 是指能在连接酶作用下和外源DNA片段连接起来，并运 送到宿主细胞的运载工具。 其化学本质为DNA分子 。 本节主要内容 载体必须具备的基本条件 载体的分类 常用的载体 29 一、载体必须具备的基本条件 具有独立复制能力 具备多个限制酶的识别位点(多克隆位点) 具有遗传表型或筛选标记 有足够的容量以容纳外源DNA片段 可导入受体细胞。 30 二、载体的分类* （一） 克隆载体 用来克隆和扩增DNA片段的载体。 有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA三类。 （二） 表达型载体 为了使插入的外源DNA能够表达为多肽链而设计 的载体称为表达型载体。 表达型载体除需载体必备条件外，还需相应的启 动子、核糖体结合位点、增强子、终止子等表达调控 构件。 31 三、常用的载体 （一） 质粒 (plasmid)： 是存在于细菌染色体外的、能自主复制的双链 环状DNA分子。 作为克隆载体的质粒应具备以下特点： 1. 分子量相对较小，能稳定存在于细菌体内， 有较高的拷贝数； 2. 具有1个以上的遗传标志，便于筛选； 3. 具有多克隆位点。 32 总而言之，质粒载体应该是一种分子量 较小、高拷贝的“松弛型”质粒，且具有一个 以上遗传标志和多克隆位点的质粒。 广泛应用的质粒： pBR32质粒、pUC系列等 33 pBR322质粒 4363 bp 含一个复制点 含一个抗氨卞青霉素基因 (ampR) 一个抗四环素基因 (tetR) ampR和tetR抗性基因内各 有一些限制酶的酶切位点， 供外源基因插入 当外源基因插入抗药基 因内后，抗药基因失活。 AmpRAmp敏感(AmpS )、 TetRTet敏感(TetS). 34 pUC系列质粒 由pBR322和M13噬菌体构 建而成的双链质粒载体； （1） 2674bp； （2） 有ampR和与M13噬菌体 相同的多克隆位点（MCS） （3）有1个来自E.coli的LacZ 基因片断, 编码半乳糖苷酶 ，便于蓝白筛选 35 (二)噬菌体 组成特点： 双链线状DNA分子， 全长50kb， 含66个基因， 在其分子两端各含有 12个碱基的互补单链，是 天然的粘性末端，被称为 COS位点。 36 噬菌体两种生长途径（示意图） 37 噬菌体感染细菌后的两种生长途径 溶菌性生长 噬菌体感染细菌后，借助其2个COS位点互补成环，在 宿主菌体内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌 体颗粒，裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌 。 溶源性生长 噬菌体感染细菌后，可将自身DNA整合到细菌的染色体 中去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂 解 。 38 第三节 重组DNA基本原理 （DNA重组基本程序包括下列过程） 分获取目的基因和载体 接目的基因与载体的连接 转重组DNA导入宿主细胞 筛重组DNA的筛选与鉴定 39 一、目的基因的获取（分） 目的基因 是指所要研究或应用的基因，也是需要克 隆或表达的基因。 目的基因来源 1） 制备基因组DNA 2） 制备cDNA 3） 聚合酶链反应 4） 人工合成基因 40 （一）制备基因组DNA（基因文库， genomic library ） 分离、纯化基因组DNA 在EDTA等存在下，用蛋白 RE 酶K消化细胞、酚抽提； 大小不同酶切片段 常用蔗糖梯度离心或电泳 分离酶切片断； 分别与同样RE酶切的载体连接 常用噬菌体载体或质粒载体 DNA连接酶连接； 导入宿主细胞、扩增 导入宿主细胞内培养、扩增； 得到分子克隆混合体 用分子杂交等方法进行鉴定、 （基因文库） 筛选、再扩增，分离、回收。 41 （二）制备cDNA （cDNA文库） 分离目的基因 的mRNA 逆转录生成cDNA单链 水解去除mRNA， 合成cDNA双链 水解回折处单链 得到平端双链cDNA 与载体连接，导入宿主细胞扩增 构建cDNA文库。 42 （三）聚合酶链反应( PCR) 在体外，以目的基因为模板，在DNA引物、dNTP、TaqDNA Pol 等存在下，构成一个反应体系。经94变性、54退火及72延伸 3个步骤的反复多次循环（2530次），扩增目的基因（见18章）。 （四）人工合成基因 应用DNA测序仪测出某一基因的碱基序列，或根据某一蛋白质 的氨基酸组成反推核苷酸序列，再用DNA合成仪通过化学合成原理 合成目的基因。 （一般先合成短片断DNA，然后再拼接成长片段） 43 二、 目的基因与载体的连接（接） （主要有以下4种连接方式） 1) 粘性末端连接 2） 平头末端连接 3） 人工接头法 4） 同源多聚尾连接法 44 （一） 粘性末端连接 将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生 相同粘性末端，再通过DNA连接酶作用将两者连接起 来，构成重组DNA分子。 （二）平头末端连接 有些限制酶只能将目的基因和载体DNA切割成 平端，此时在T4DNA连接酶的作用下同样能连接起 来。 45 （三） 人工接头法 合成连接子与DNA平头末端连接限制酶切割, 产生粘性末端连接，构建重组DNA。 46 （四）同源多聚尾连接法 47 三、重组DNA导入宿主细胞（转） 无性繁殖 体外重组后的DNA导入受体细胞，然后随受体细胞 生长、增殖，使重组DNA发生复制、扩增，这一过程称 为无性繁殖。 克隆 从上述无性繁殖细胞中进一步筛选出含目的DNA的 重组体分子即为无性繁殖系或克隆。 宿主细胞 进行无性繁殖时所采用的受体细胞. 48 重组DNA导入宿主细胞的类型 转化 以质粒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程； 转染 以病毒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程； 转导 以噬菌体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程。 感受态细胞 用特殊方法处理（CaCL2）后，受体细胞才具备接 受外源DNA的能力， 这种细胞称感受态细胞。 感受态细胞有原核细胞和真核细胞两大类。 49 四、重组DNA的筛选与鉴定（筛） （筛选含重组体的阳性菌落，一般有下列几种方法） 1） 平板筛选 2） 限制酶切图谱筛选 3） PCR筛选重组体 4） 原位杂交技术 插入失活 蓝白筛选 50 （一） 平板筛选 是指利用载体的遗传性标记在平板上直接筛选 的方法。 具有抗药性标记的载体，转化宿主细胞后，能 在含抗生素（Amp或Tet）的培养平板上生长；未转 化的则不能生长。 1. 插入失活 2. 当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内， 使 3. 该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生 素的 4. 培养平板上。 51 抗生素平板筛选（插入失活） 52 2. 蓝-白筛选 利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。 载体：编码-半乳糖 宿主： 编码-半乳糖 苷酶N端序列 苷酶C端序列 -互补 细菌表达： -半乳糖苷酶活性 5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） 形成蓝色菌落 当在质粒中插入外源DNA-半乳糖苷酶的N端基因失活 不能与宿主-半乳糖苷酶的C端进行-互补产生白色菌落。 （IPTG 存在下） 53 蓝白筛选示意图 54 (二) 限制性内切酶图谱鉴定 55 （三） PCR筛选重组体 抽提少量重组DNAPCR扩增电泳鉴定序列分析。 （四） 原位杂交技术 56 1、获取 DNA重组基本过程(小结) 57 2、重组 58 3、转化 体 59 4、筛选 60 5、克隆 61 6、表达 表达产物分离纯化 62 五、重组体在宿主细胞中的表达和调控 基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导入 合适的宿主细胞中高效表达，产生有重要价值的蛋白 质产品。 克隆基因表达有三个条件 基因的编码区不能被插入序列中断; 基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主 细胞的RNA聚合酶有效地识别; mRNA必须相当稳定，并有效地被翻译，产生的外 源蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所降解。 63 第四节 重组技术在医学和制药工业中的应用 一、疾病基因的发现 1990年美国科学家率先启动人类基因组计划（HGP ），计划历时15年，至2005年完成； 2001年2月12日由Since和Nature杂志同时向世界 宣布，人类基因组3X109bp的最新图谱，约含34万个 基因； 整个人类基因组的全部核苷酸序列不久即将完成 。但要揭示人类4万个基因功能的任务将更为艰巨。 64 人类基因组图谱的初步完成，不仅为全部基因 的定位建立了一个开放框架，而且为分离、鉴定人 类疾病相关基因提供了参照模板。 如已知人类遗传性疾病约有3000种，推测可能 是由于某些基因结构异常或基因位移等突变所致。 如果利用分子生物学技术，将患者疾病基因与正常 基因图谱作对照分析，必将有助于阐明遗传病的分 子机制，这对遗传病的基因治疗将起到不可估量的 推动作用。 65 产品名称 治疗功能与医药范围 1. 人胰岛素 治疗糖尿病 2. 人生长激素 治疗侏儒症，加速创口愈合 3. 干扰素 治疗癌症、病毒感染 4. 干扰素 治疗带状疱疹，眼结、角膜炎 5. 干扰素 治疗癌症、病毒感染 6. 人组织纤溶酶原激活因子(tPA) 溶解血栓，治疗急性心肌梗塞 7. 红细胞生成素 (Epo) 治疗肾病性贫血，增加红细胞及血色素水平 8. 超氧化物歧化酶 清除超氧化物，治疗关节炎，缓解心肌坏死 9. 凝血因子 治疗A型血友病 10. 乙型肝炎疫苗 防治肝炎 11. 神经生长因子 维持神经元细胞存活、生长和分化 12. 脑啡肤 镇痛 13. 降钙素 治疗骨质疏松症 二、 生产蛋白质和多肽类活性物质 66 基因工程生产胰岛素的原理（示意图） 67 三、制备基因工程疫苗 基因工程疫苗可以帮助解决传统技术难以解决的 一些特殊的病原体疫苗。如， （1） 乙型肝炎病毒疫苗（HBV）、丙型肝炎病毒疫 苗（HCV）等； （2） 有诱发致癌或产生免疫病理作用的疫苗，如人 T细胞免疫缺陷病毒（HITV-1）等； （3） 常规效果较差的疫苗，如霍乱和痢疾疫苗等 （4） 制备一些多价疫苗等。 68 四、改良物种特性 69 动物药厂 通过转基因动物生产感兴趣的基因 把YFG放在乳球蛋白的启动子下 注入羊卵细胞植入借腹怀孕的母羊 体内 YFG在乳腺中表达 乳汁中提纯YFG蛋白。 70 1. 分离体细胞 （先处于“饥饿 ”的“静止状态 ”） 使“关闭 ”的基因全部“ 打开”。 2.