抗人宫颈癌单链抗体的表达, 结构预测和功能分析.doc

期刊文献抗人宫颈癌单链抗体的表达、结构预测和功能分析 作者：王莹；李旭；陈葳(西安交通大学第一医院医学实验中心，陕西西安710061)摘要：目的扩增、表达抗人宫颈癌单链抗体 (ScFv)基因；对ScFv蛋白进行活性鉴定、二级结构、三维结构预测和理化性质分析。方法采用基因重组技术构建抗人宫颈癌ScFv基因，进行TG1和HB2151两个原核体系的表达；SDS-PAGE、Western blotting、竞争抑制实验、免疫组化反应检测ScFv；用Antheprot 4.3软件、Swiss-model、3dpssm 进行蛋白理化性质分析和立体结构模拟。结果抗人宫颈癌可溶性ScFv大小为32 000左右，与预计蛋白相对分子质量相符；可溶性和展示性ScFv均可与人宫颈癌细胞株细胞膜表面抗原结合。免疫组化显示能与宫颈癌组织特异性结合而不与正常宫颈组织和其他肿瘤组织结合。ScFv蛋白等电点预测值为7.215，属于+蛋白；VH和VL区均有多个蛋白激酶C磷酸化位点和酪氨酸激酶II磷酸化位点。三维结构预测显示linker 贴近，使VL和VH形成一个疏水的“口袋”，这一结构有利于抗原的结合。结论经基因工程方法制备的抗人宫颈癌ScFv具有与亲本单克隆抗体相似的抗体活性和特异性。抗人宫颈癌ScFv构建为进一步构建双特异性ScFv和双功能ScFv基因创造了条件；其成功的表达为人宫颈癌的早期诊断和特异性治疗打下了基础。计算机对ScFv蛋白的空间结构的模拟和理化性质的分析为ScFv的进一步改建和抗原、抗体反应的研究提供了宝贵的资料。关键词：宫颈癌；单链抗体；二级结构；三维结构中图分类号：R737.33文献标识码：A文章编号：1673-4254(2006)01-0016-06Expression, structure prediction and functional analysis of murine single-chain fragment variable antibody against human cervical cancerWANG Ying；LI Xu；CHEN WeiMedical Laboratory Center, First Hospital of Xian Jiaotong University, Xian 710061, ChinaAbstract: Objective To amplify and express the gene encoding murine single-chain fragment variable (scFv) antibody against human cervical cancer and predict the secondary structure and three-dimensional structure of the antibody. Methods The gene fragments coding for the variable region of the heavy and light chains of scFv antibody against human cervical cancer were amplified respectively using recombinant DNA techniques from CsA125 hybridoma cells, and spliced together using a flexible linker to the antibody. The scFv genes were then cloned into the expression vector pCANTAB 5E and expressed in E.coli HB2151 and TG1, respectively. The scFv antibody obtained was assayed using SDS-PAGE, Western blotting, and immunohistochemical analysis, with its secondary structure and three-dimensional structure predicted with Swiss-model and 3dpssm. The physicochemical properties of the antibody were analyzed with Antheprot software. Results The expressed scFv antibody was soluble and phage-displayed. The specific binding capacity of the soluble and phage-displayed scFv antibody to the surface-associated antigen of human cervical cancer cell line were further confirmed. The scFv antibody had a relative molecular mass of 32 000 as was consistent to theoretical prediction, with pI of 7.215 and characterized to belong to + protein. The antibody contained many protein kinase C phosphorylation sites and casein kinase II phosphorylation sites in both the VH and VL domains. Computer graphic modeling indicated that the linker was isolated from the VH and VL domains, which formed a hydrophobic pocket in the molecule to facilitate antigen binding. Conclusions The soluble and phage displayed scFv antibody expressed in E.coli against human cervical cancer shows high and specific affinity to the cervical cancer cell line surface-associated antigen. The construction and analysis of the molecular model of the antibody may facilitate further studies in engineering of the antibody and exploration of the mechanism of the antigen-antibody interaction.Key words: cervical cancer; single-chain fragment variable antibody; secondary structure; three-dimensional structure收稿日期：2005-07-12基金项目：陕西省自然科学基金项目(99SM52)Supported by Natural Science Foundation of Shaanxi Province (99SM52)作者简介：王 莹(1971-)，女，在读博士研究生，电话E-mail: 通讯作者：李旭，教授，电话E-mail: 宫颈癌是妇女中最常见的恶性肿瘤之一，近年来，虽然诊断和治疗方法有了飞速的进展，但是如何提高宫颈癌的远期生存率仍是临床和基础研究的重要课题1。随着基因工程技术、尤其是噬菌体展示技术的进一步发展2，基因工程抗体在疾病诊断和治疗中的研究和应用越来越广泛。我们实验室建立了多株抗人宫颈癌杂交瘤细胞株，其中CsA125杂交瘤细胞株能特异性分泌高亲和性和高特异性的mAb CsAb125，并经动物实验有较好的靶向性。我们以CsA125为原料，应用分子生物学技术构建了抗人宫颈癌mAb CsAb125的ScFv基因，并进行原核表达和空间结构预测，为宫颈癌的预防、导向诊断和治疗打下了基础。1 材料与方法1.1质粒、细胞来源以及试剂盒抗人宫颈癌CsA125杂交瘤细胞株、宫颈癌细胞株Cs12133由本室自建。pMD18-T vector购自大连宝生物工程公司；pCANTAB5E表达载体、TG1和HB2151表达体系以及linker全长基因为大连理工大学胡学军博士惠赠。3-full RACE 试剂盒、5-Full RACE试剂盒、PCR 片段回收试剂盒均购自大连宝生物工程公司；即用型免疫组织化学超敏S-P试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。1.2引物引物由大连宝生物工程有限公司合成。 1.3生物学软件基因比对与分析网站http:/www.ncbi. nlm ./blast；蛋白综合分析软件Antheprot由 提供；二级结构预测网站http:/www.sbg.bio.ic.ac.uk/3dpssm/。三级结构预测工作站SWISS-MODEL由GlaxoSmithkline 公司提供。三级结构观察软件为PdbViewer 3.7，MDLChime 和Rasmol软件；截图软件为HyperSnap DX-4.1.4ScFv基因的构建及结构分析1.4.1VL基因片段的扩增用3RACE和5RACE法进行扩增4。ScFv的构建：重叠延伸连接法将VH和VL用一段linker连接起来 5。1.4.2基因片段测序和同源性分析分别登陆NCBI BLAST基因和蛋白数据库，进行基因和蛋白的同源性分析。应用蛋白序列分析软件包ANTHEPROT 4.3分析该基因所编码的蛋白氨基酸组成、等电点、疏水性、抗原性等理化性质。应用ANTHEPROT 4.3 和3dpssm分别对编码蛋白进行二级结构预测。SWISS-MODEL 进行蛋白的3D 结构预测。1.5ScFv基因与pCANTAB-5E表达载体进行连接和转化抗人宫颈癌ScFv基因与pCANTAB-5E表达载体进行连接反应，并转化感受态细胞TG1和HB2151菌。1.6ScFv基因的表达IPTG 1 mmol/L，30 进行诱导，培养上清中含可溶性ScFv。可溶性ScFv经硫酸铵初步纯化后进行进一步检测。取重组ScFv基因转化菌TG1，用辅助噬菌体 M13K07进行援救，培养上清含噬菌体展示型ScFv。1.7ScFv的鉴定1.7.110% SDS-PAGE和Western blot进行ScFv相对分子质量的鉴定一抗为ScFv,二抗为鼠抗E-tag抗体，三抗为地高辛标记的羊抗鼠抗体，DAB显色。阴性对照为未经诱导的HB2151。1.7.2ScFv的亲和活性检测(竞争结合抑制试验)宫颈癌Cs1213细胞悬液加初步纯化的ScFv封闭抗原后，加亲本mAb CsAb125孵育后，加入FITC标记的兔抗鼠抗体经固定，上流式细胞仪检测。以宫颈癌Cs1213细胞加亲本mAb CsAb125为阳性对照，正常鼠IgG为阴性对照。 1.7.3ScFv抗原结合活性检测a:常规制备Cs1213宫颈癌细胞和正常宫颈上皮细胞涂片，SABC法检测可溶性ScFv和噬菌体ScFv的免疫活性。设立宫颈癌Cs1213细胞加亲本mAb CsAb125作为阳性对照，正常宫颈上皮细胞涂片分别加亲本mAb CsAb125和正常鼠IgG作为阴性对照，PBS代替一抗做空白对照，同时设立RLC-310肾癌细胞涂片、HC-108肝癌细胞涂片和COC1卵巢癌细胞涂片做无关对照。b: 免疫组织化学：宫颈癌和正常宫颈组织标本由本院病理科提供，分化程度好(高、中分化) 20例，分化程度差(低分化)3例，正常宫颈组织标本10例，常规固定、封闭，一抗先后为ScFv及鼠抗E-tag抗体，二抗为HRP标记的羊抗鼠单抗，底物为DAB。着棕色者为阳性，深棕色为强阳性。对照设置：正常鼠IgG代替ScFv作阴性对照；亲本抗体作为阳性对照；肾癌、肝癌、胃癌组织切片为无关对照；PBS代替ScFv作空白对照。2结果2.1基因产物分析2.1.1PCR结果VL基因扩增产物带有部分linker基因和NotI酶切位点，片段大小为360 bp左右；VH基因扩增产物5端和3端分别带有SfiI酶切位点和linker的部分序列，片段大小为390 bp；ScFv基因产物片段大小约830 bp (图1)。 图1ScFv PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 PCR products of the engineered ScFv gene from CsA125 hybridroma cellsLanes 1,3: DL2000 DNA marker; Lane 2: ScFv gene2.1.2测序结果与GenBank中的序列进行比较，与登陆的ScFv有73%的同源性。证实PCR产物测序结果确实为抗人宫颈癌ScFv基因(图2)。 图2ScFv克隆产物测序结果Fig.2Sequence of the cloned ScFv gene2.2蛋白理化性质分析用蛋白序列分析软件包ANTHEPROT 4.3分析，表明该基因编码蛋白理论相对分子质量为28 800；等电点为7.215。重链区疏水性氨基酸61个，轻链区疏水性氨基酸58个，占43.1%，并且分布与预测的CDR区较为一致。抗原决定簇位于4046，5179，8894，183208，227236，244256之间的氨基酸，与CDR区基本一致。在蛋白数据库PROSITES中进行查询，发现位于2224，2628，156158位的氨基酸具有蛋白激酶C磷酸化位点，在1215，9295，219222，234237，268271的氨基酸具有酪氨酸激酶II磷酸化位点6。2.3二级结构预测分别用GOR, GIBRAT, DBM, Predator算法进行其二级结构的预测，经神经网络法进一步证实，重链区和轻链区有较多的螺旋和片层结构，以片层为主(图3)。linker呈无规卷曲。该ScFv根据二级结构比例不同分为4类，全，全 ，+ ，/ 。参照分类标准，该蛋白属于+蛋白质。 图3ScFv预测的二级结构(Conf:可信度; Pred:二级结构预测; AA:氨基酸残基)Fig.3Predicted secondary structure of ScFv antibody2.4三级结构经序列比对，发现1NQBA和1NQBC7ScFv与目的ScFv同源性达到73.44%，经SWISS-Model8自动比较，运用同源建模法获得蛋白的三级结构。ScFv重链可变区主要由9个片层组成，轻链可变区主要由10个片层组成。其三级结构中连接肽卷曲形成“索状”结构将VH和VL牵拉而相互靠近，形成“口袋”或“凹陷”的沟槽结构，有利于抗原的结合(图4、5)。 图4ScFv的三级结构模型Fig.4Tertiary structure model of the ScFv antibody图5ScFv的表面模型Fig.5Graphic model of surface of the ScFv antibody2.5ScFv的鉴定细胞培养上清液和周质腔提取液在32 000左右位置上均有明显条带，而预计ScFv在29 000左右，这是由于表达的ScFv带有E-Tag尾标签，增加了相对分子质量。培养上清液和周质腔提取液位于32 000左右有条明显的条带。竞争抑制实验检测亲和活性 ScFv封闭实验组荧光标记细胞阳性率为95.6%，Mean值为 1.83，亲本抗体阳性对照组荧光标记率为99.8%，Mean值为3.72，经公式计算抑制率为53%，即ScFv能与宫颈癌Cs1213细胞特异性结合并封闭亲本抗体53%的亲和活性。免疫化学SABC法结果显示可溶性ScFv和噬菌体展示性ScFv均能与宫颈癌细胞特异性结合，阳性部位主要定位于细胞膜上，呈棕褐色，与亲本抗体结合活性相似。非靶细胞设立的无关对照和正常鼠IgG对照均为阴性。实验表明制备的抗宫颈癌ScFv较好地保持了亲本抗体的活性(图6)。20/23例宫颈癌呈阳性反应，其中3例分化程度低标本呈强阳性，3例高分化标本未见阳性反应；正常宫颈组织标本均呈阴性；无关对照和空白对照标本也呈阴性。 图6免疫组织化学结果Fig.6Result of immunohistochemical detection of the scFv antibody(Original magnification:1040)1: Soluble ScFv; 2: Phage-displayed ScFv; 3: Negative control (IgG) 4: CsAb125;3讨论宫颈癌是最常见的恶性肿瘤之一，由于其病因复杂、预后差，死亡率高，因此探明宫颈癌的致病因素，寻找特异、敏感、有效的早期诊断、早期治疗方法是基础和临床研究的重点。我们制备的分泌抗人宫颈癌的单克隆抗体的CsA125杂交瘤细胞,单抗经初步鉴定，证实具有较高的特异性和亲和力,并在动物模型中显示了明显的靶向性。因McAb分子大，免疫原性强，难于进入组织等缺点，限制了它的使用。近年来出现的ScFv由于分子小，无Fc端，免疫原性低，穿透力强，体内易于清除等特点，应用价值优于McAb，在疾病预防、诊断和治疗中显示了光明的前景。目前国内外已经研制出多种ScFv，并用于临床9。而在宫颈癌诊断和治疗的研究上，至今尚未见抗人宫颈癌ScFv的构建和应用的报道。通常构建ScFv有两种方法，一种是在没有制备杂交瘤条件或没有现成的杂交瘤细胞时，采用构建ScFv库的技术10，通过多轮淘筛，获得亲和力较高的ScFv。此方法受构建抗体库库容和多轮淘筛过程的限制，易于丢失信息，所以获得的ScFv只能达到中等亲和力11。另一种方法以分泌高特异性McAb的杂交瘤细胞株为原料，该方法能很好地保留ScFv的亲本McAb的高亲和力、高特异性，避免了淘筛抗体库的繁琐工作，获得了亲和力和特异性均较高的ScFv12。本实验从抗人宫颈癌的杂交瘤细胞株中克隆并构建了抗人宫颈癌scFv。结果证实所得到ScFv具有较高的亲和力。实验采用大肠杆菌为基因表达的宿主菌，生长快，可大量生产重组蛋白，是较简单的表达系统。表达载体选用Pharmacia公司的噬菌粒载体pCANTAB5E13。pCANTAB5 E是经丝状噬菌体改建的一种噬粒，在多克隆位点与g III蛋白编码区之间有1个E-tag序列和琥珀终止密码子(UAG)。 当噬菌体感染非琥珀突变抑制的菌株(HB2151)时，则UAG为终止密码子，多肽链终止于E-tag，形成可溶性的 ScFv-E-tag融合蛋白，分泌到外周质中。在含有琥珀突变抑制基因的菌株(TG1)中表达时，UAG密码子被读为谷氨酸，从而与gIII蛋白融合，在辅助噬菌体的超感染下，组装成噬菌体，并可将ScFv以融合蛋白形式展示于噬菌体的表面，即展示性ScFv。经免疫组织化学证明制备的可溶性ScFv和噬菌体展示性ScFv可以与宫颈癌细胞表面抗原特异性结合并能与宫颈癌组织特异性结合，具有较强的亲和活性、结合活性。由于HB2151首先分泌ScFv入胞质，随后进入培养液，本实验发现培养上清与胞质提取物的ScFv活性均较强，并且培养上清活性更佳，进一步证实ScFv以可溶性的形式表达于培养上清和细胞周质腔，能够完成抗体的自然立体折叠，从而很好地保留了单抗的活性。ScFv的可溶性表达更益于ScFv的大量生产、制备和纯化，使ScFv用于诊断、治疗成为可能。噬菌体展示性ScFv是ScFv基因型和表型的统一，产量高，制备方法简单，不需纯化，是研究ScFv的很好形式，并能进一步用于制备更高亲和力ScFv。总之，我们获得的具有较高活性的Scfv为进一步的动物实验和体外实验提供了材料，为宫颈癌的预防、基因诊断、基因治疗做了有意义的基础研究工作。随着生物信息学的发展，计算机数字化分析系统成为蛋白质工程研究中必不可少的工具。我们应用此技术对ScFv蛋白疏水性、等电点、抗原性等理化性质以及三维结构进行预测，结果与ScFv检测结果基本吻合，符合ScFv的特点，说明我们所用的分析预测体系较可靠。在VH和VL区发现多个蛋白激酶C磷酸化位点和酪氨酸激酶II磷酸化位点，可能与抗体的功能有关，有待进一步地研究。从计算机模建的三维结构可以看出，单价ScFv的VH和VL结构域互相靠近，形成一个较为致密的分子，VH和VL形成一个“口袋样凹陷”结构14，有利于抗原的结合。这些预测结果的综合应用为ScFv表达、纯化和活性研究等后续实验提供了大量宝贵的信息；并为ScFv进一步改建、研究抗原抗体反应机制，甚至于设计、改造抗原和抗体提供了宝贵的信息。参考文献：1Dillner J. 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