高山红景天叶肉原生质体分离培养与植株再生.ppt

高山红景天叶肉原生质体分 离培养与植株再生 小组成员： 张亚琴 赵校玲 祝志诚 赵 鑫 张可建 朱晓兰 曾 娟 张静静 张运浩 章登华 * * 1 1 目的：利用高山红景天组培苗叶片分离目的：利用高山红景天组培苗叶片分离 得到原生质体，经培养后获得再生植株。得到原生质体，经培养后获得再生植株。 方法：研究外植体前期预处理、外方法：研究外植体前期预处理、外 植体的大小、酶液配比、酶液中甘露醇浓度等影植体的大小、酶液配比、酶液中甘露醇浓度等影 响原生质体的相关因素，确定最优条件。响原生质体的相关因素，确定最优条件。 * * 2 2 高山红景天 DateDate 3 3 高山红景天人工 栽培利用的研究 高山红景天 DateDate 4 4 高山红景天： 为景天科红景天属多年生草本植物，是长 白山珍稀药用植物之一，具有抗缺氧、抗 寒冷、抗疲劳、抗微波辐射等显著功能。 2019/1/172019/1/17 5 5 一 材料和方法 1.材料 高山红景天高山红景天 组组 培苗叶片培苗叶片 DateDate 6 6 2. 原生质体分离： 取材：幼嫩叶片(长 0.53 ）切成宽1.02.0 mm 的条状 酶液配制：0.5 %2 %纤维素酶 + 0.3 %1 % 果胶酶 + 10 mmol/ L CaCl2 2H2O + 0.1 %MES + 0.7 mmol/ L KH2 PO4 + 0.40.6mol/ L 甘露 醇, p H = 5.8 酶解处理：以1 10 的量将材料放入酶液。于25 ,黑暗条件下振荡酶解15h ,转速为80 r/ min 。 DateDate 7 7 3.原生质体纯化： 酶解后的原生质体和 酶混合液经250 目的 尼龙网滤过后以800 r/ min 离心8min 沉降 原生质体。向沉降的 原生质体中再加入洗 涤液和液体培养基各 清洗1 次备用。 洗涤液：10mmol/ L CaCl2 2H2O + 0.1 % MES + 0.7mmol/ LKH2 PO4 + 0.4 mol/ L 甘露 醇, p H = 5.8 液体培养基：1/ 2MS + 1 mg/ L 2 ,42D + 0.5 mg/ L ZT + 0.5 mol/ L 甘露醇 + 5 00 mg/ L 水解酪蛋 白。 DateDate 8 8 4. 原生质体存活率及产量的测定： 活力测定:采用EvansBlue 染色法，存活率 = (未染蓝细胞数/ 细胞总数) 100 %。 原生质体产量:用血球计数板进行计数,以 每克鲜质量组织获得的原生质体个数(个/ g) 来表示. DateDate 9 9 5. 原生质体培养： 将原生质体密度调到210 105 个/ mL , 转入 原生质体液体培养基中进行液体浅层黑暗静 置培养。在培养过程中每10 d 以3 1(原生质 体培养基无渗透压调节剂培养基) 比例加入 无渗透压调节剂培养基,逐步降低渗透压。 DateDate1010 6.愈伤培养与植株再生: 当多细胞团进一步增大,形成肉眼可见的小愈伤组 织时,挑出并转移到愈伤组织培养基MS + 6-BA 2 mg/ L + NAA 0.5 mg/L ,转为光照培养之前,首先经过23 d 的弱光培养锻炼阶段,然后转入光照培养,继续培养约 1 个月时间。 经3 次继代培养后,挑选鲜绿色愈伤组织转入芽 分化培养基MS + 1 mg/ L 6-BA + 0.1 mg/ L NAA ,待 小芽长至2.0 cm 左右,切下转入生根培养基上形成完 整植株,生根培养基为1/ 2MS。培养基p H = 5.8-6.0 , 琼脂6 g/ L ,蔗糖25 g/ L ,在1.2 kg/ cm2压力下灭菌20 min ,培养温度(25 2) ,光照强度为2 0003 000 lx ,每天光照12 h 。 DateDate1111 二、结果与分析 影响天原生质影响天原生质 体分离的因素体分离的因素 光光 叶片大小叶片大小 酶类组合酶类组合 DateDate1212 1.光照与黑暗 DateDate1313 结果表明：在相同酶解条件下，光照与黑暗处 理对高山红景天原生质体产量间差异不显著， 因此，在进行原生质体分离以前，对组培苗是 否光照不是影响原生质体产量的关键因素。在 此实验中，直接采取没有进行黑暗预培养的组 培苗进行原生质体分离。 DateDate1414 2.叶片大小 DateDate1515 在相同酶解条件下，长度大于 1.5cm的叶片原生质体产量显著 高于长度小于1.5cm的处理，因 此，选用长度大于1.5cm的叶片 为宜。 DateDate1616 3.酶类组合 纤维素酶与果胶酶组合 DateDate1717 各处理存活率大小顺序为:1 4 5 2 7 3 8 6 9 各处理产量大小顺序为: 5 3 6 2 7 4 8 1 9 综合来看，处理5的产量显著高于其他处理 ，因此，采用处理5 的酶液组合（1%纤维 素酶 + 0.5%果胶酶）可获得最大存活原生 质体产量。 DateDate1818 4.酶解时间与酶液中甘露醇浓度对高山红景 天原生质体产量的影响： DateDate1919 时间影响：14 h随酶解时间的延长，原生质 体产量递增，在4 h时达到最高值，以后随时 间的延长，产量下降。 酶解后期的产量和存活率下降，是由于酶解液 长时间浸泡造成部分原生质体破裂和损伤引起 的。 DateDate2020 酶液中甘露醇对原生质体产量和存活率的 影响： 酶液中采用0.5 mol/L 甘露醇的处理经 纯化后呈圆球型，可观察到大量叶绿体的 存在。因此，酶液采用0.5 mol/L 的甘露醇 用于维持原生质体渗透压效果较好。 DateDate2121 高山红景天原生质体培养与植株再生： 将纯化的原生质体密度调到2105个/mL,在黑 暗条件下进行液体浅层培养，经3天可见第一 次细胞分裂，约40d时，可形成肉眼可见的愈 伤组织。经过23d 的弱光培养，将愈伤组织 转移到培养基MS+2mg/L NAA上精心光照培养 。继续培养约45d时，愈伤组织生长旺盛，并 有少量芽体萌发，挑选鲜绿色